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第 51 卷第 9 期2023 年 5 月广 州 化 工Guangzhou Chemical IndustryVol.51 No.9May.2023芹菜黄酮类提取物对酪氨酸酶活性抑制作用的研究何方颖,裘钰颖,徐林通,邱竞瑶,沈芳仪,齐德强(浙江外国语学院,浙江 杭州 310023)摘 要:为探究芹菜中黄酮类提取物对酪氨酸酶活性的抑制作用,本研究通过乙醇提取和酶解等优化方法,提取出西芹茎、西芹叶、香芹茎、香芹叶中的黄酮,得出黄酮得率芹菜叶明显高于茎。通过动力学分析测定出对酪氨酸酶的相对酶活力分别为81.18%、29.32%、74.84%、8.97%,以及酶抑制率分别为 18.82%、70.68%、25.16%、91.03%。结果表明,芹菜叶对酪氨酸酶活性的抑制作用较茎强,为后期酪氨酸酶抑制剂的提取提供实验基础,为开发芹菜作为天然抗氧化剂和美白剂原料提供理论依据。关键词:芹菜;黄酮;提取物;酪氨酸酶;抑制作用中图分类号:O629.9 文献标志码:A文章编号:1001-9677(2023)09-0099-03 第一作者:何方颖,女,浙江外国语学院教育学院科学教育系学生。通讯作者:齐德强,男,博士,浙江外国语学院教育学院科学教育系系主任,主要从事分子荧光探针和中小学科学教学研究。Study on Inhibitory Effect of Flavonoids Extractsfrom Celery on Tyrosinase ActivityHE Fang-ying,QIU Yu-ying,XU Lin-tong,QIU Jing-yao,SHEN Fang-yi,QI De-qiang(Zhejiang International Studies University,Zhejiang Hangzhou 310023,China)Abstract:In order to explore the inhibitory effect of flavonoids extract from celery on tyrosinase activity,theflavonoids was extracted from celery stalk,celery leaf,parsley stem and parsley leaf through optimization methods such asethanol extraction and enzymatic hydrolysis,and obtained that the yield of flavonoids from celery leaf was significantlyhigher than that from stem.The relative activity of tyrosinase was 81.18%,29.32%,74.84%and 8.97%,and theinhibition rate was 18.82%,70.68%,25.16%and 91.03%,respectively.The results showed that celery leaves hadstronger inhibitory effect on tyrosinase activity than stems,which provided experimental basis for the extraction oftyrosinase inhibitors and theoretical basis for the development of celery as a natural antioxidant and whitening agent.Key words:celery;flavonoids;extract;tyrosinase;inhibitory action酪氨酸酶(Tyrosinase,TYR)又名多酚氧化酶,在各种生物体内普遍存在,并且是生物体内黑色素合成的关键酶和限速酶。因此,抑制酪氨酸酶的活性,使黑色素减少或阻断其生成1,可用于预防和治疗与黑色素沉着有关的疾病,如黑斑病、黄褐斑等2。同时,酪氨酸酶抑制剂在多个领域都有广泛应用。有研究表明3,在食品加工方面,酪氨酸酶抑制剂可作为一种保鲜剂,延长水果蔬菜的保质期;在农业方面,酪氨酸酶抑制剂可作为植物保护剂,用于农作物的害虫防治;在医药方面,酪氨酸酶抑制剂可用于治疗色素沉着疾病;在化妆品方面,酪氨酸酶抑制剂可用于身体美白4,因而酪氨酸酶抑制剂的开发在医疗美容、食品保鲜、农业害虫防治、生物抗菌等领域中都有着广阔的应用前景。虽然近年来国内外对酪氨酸酶抑制剂的研究已较为深入,但是由于对安全、环保以及成本等因素的考虑,目前只有少数抑制剂被应用于商业。因此,寻找绿色安全、来源丰富、高效价廉的天然酪氨酸酶抑制剂显得尤为必要5。芹菜作为一种两年生的伞形科植物,原产于地中海沿岸,引进后经历了两千多年历史的培育已在我国各地广泛分布。大量研究表明6芹菜内含有多种有用的化学成分,其中就包括了维生素 C、糖类及芹菜素、芹菜苷等多种黄酮类化合物。另有研究发现7,芹菜黄酮提取物能够清除体内自由基,减少脂质过氧化物的含量,可降低血脂水平,对酪氨酸酶活性具有抑制作用。而我国芹菜资源丰富且价格低廉,提取工艺环保,因此芹菜资源具有较高的开发利用价值。目前,关于芹菜黄酮的提取以及其降血脂、抗氧化等方面已有较多研究文献,却少有对芹菜黄酮类提取物抑制酪氨酸酶活性作用效果的研究。因此,本研究将通过乙醇提取、醇解等优化方法来提取出芹菜中的黄酮化合物,并进行其对酪氨酸酶活性抑制作用的研究,为进一步提取并筛选新型酪氨酸酶抑制剂、开发天然抗氧化剂和美白剂原料提供实验基础和理论依据。1 材料与方法1.1 材料与试剂香芹、西芹,购于杭州市西湖区菜市场;酪氨酸酶(500 U/mg),L-甲基多巴,芦丁标准品,纤维素酶(10000 U/g),95%100 广 州 化 工2023 年 5 月乙醇;亚硝酸钠,硝酸铝,氢氧化钠,以上试剂均为分析纯。1.2 仪器与设备FA2204 型电子分析天平,上海力辰仪器科技有限公司;DHG-9076A 型电热恒温鼓风干燥箱,上海精宏实验设备有限公司;DF-101ZF 型集热式恒温加热磁力搅拌器,杭州惠创仪器设备有限公司;UV-8000T 型紫外-可见分光光度计,上海元析仪器有限公司。1.3 实验方法1.3.1 样品处理将西芹、香芹清洗干净,分别摘取茎和叶并切碎,分成西芹茎、西芹叶、香芹茎、香芹叶四组,置于65 烘箱中干燥8 h以上至烘干,用研钵研成粉末,过筛,放于四个大烧瓶中备用。1.3.2 黄酮标准曲线的制作本研究采用Al(NO3)3-NaNO2法8测定出黄酮含量:用电子分析天平精密称取0.0100 g 芦丁标准品,用配置好的60%乙醇溶解并定容至 100 mL 容量瓶中,最终得到 0.1 mg/mL 的芦丁标准溶液。用移液管精密吸取芦丁标准溶液 0 mL、1.0 mL、2.0 mL、3.0 mL、4.0 mL、5.0 mL 各加入 6 只 10 mL具塞试管中,将 0 mL 的样品则作为对照组。之后在各试管中均用移液管精确加入 60%乙醇溶液至 5 mL;用移液管精密吸取0.3 mL 的0.05 g/mL NaNO2溶液加入试管中,充分摇匀后静置6 min;再用移液管精密吸取0.3 mL 的0.05 g/mL Al(NO3)3溶液加入试管中,充分摇匀后,静置6 min;加入4.0 mL 的 1 mol/LNaOH 溶液,摇匀;最后加入 0.4 mL 蒸馏水充分摇匀后,静置20 min。分别将四组样品溶液置于紫外分光光度计中,在510 nm 处波长测定溶液吸光度。通过对比测定的结果,我们可以将标准液浓度 C(mg/L)作为 X 轴,吸光度 A510的值作为 Y轴,绘制出黄酮标准曲线。1.3.3 芹菜黄酮的提取(1)乙醇提取法参考黄菊等9的方法,通过乙醇加热回流提取出四组不同种类不同部位芹菜样品中的黄酮,在紫外分光光度计中测定芹菜提取液中的黄酮含量。用电子分析天平准确称取西芹茎、西芹叶、香芹茎、香芹叶粉末2.0000 g,各自放入150 mL 圆底烧瓶中,加入82 mL 的80%乙醇溶液,置于磁力搅拌器中,80 油浴加热,回流提取。2 h 后趁热进行减压抽滤,将滤液用 95%乙醇在 100 mL 容量瓶定容。最后用“1.3.2”中的方法测定出四组待测液的吸光度。通过对四组样本的吸收光谱进行分析,我们可以使用芦丁标准曲线来估算它们的黄酮含量。(2)酶解法根据易建华等10的文献,本研究通过酶解提取提高芹菜中黄酮的提取率。用电子分析天平准确称取四组样品 1.5000 g,用 15 mL 即液料比为 1 10(W/W)的 70%乙醇溶解,添加0.0100 g 纤维素酶,在 51.5,pH 4.7 的环境条件下,酶解2.2 h。减压抽滤后,将滤液用60%乙醇在100 mL 容量瓶定容。最后用“1.3.2”中的方法测定出四组待测液的吸光度。根据紫外可见分光光度计中测得样品的吸光度(A),结合上述芦丁标准曲线计算出四组不同种类不同部位芹菜样品的黄酮得率。芹菜黄酮得率=MV110W100%式中:溶液中的黄酮质量浓度标注为 M,mg/L;芹菜黄酮提取液的总体积标注为 V1,L;芹菜粉干重标注为 W,g。1.4 酪氨酸酶的酶活性和抑制率测定本研究采用张洪梅等11的方法,利用 L-多巴的酶促反应速率来测定酪氨酸酶活性,其测定原理为:利用酪氨酸酶催化L-多巴的氧化反应,其反应可生成红色产物多巴醌,而多巴醌在波长为 475 nm 处有最大吸光度。因此,本实验可通过测得多巴醌中的二酚酶的酶活性来衡量酪氨酸酶的活性。操作步骤如下12:在试管中加入 0.5 mL 的 1.0 mg/mL 的L-多巴溶液;后加入 2 mL 的 pH 6.8 磷酸盐缓冲溶液(PBS 溶液),在 30 的恒温加热器中油浴加热10 min;后加入0.5 mL的 250 U/mL 酪氨酸酶,并将其均匀混合后立即放入分光光度计中并开始记时。利用紫外分光光度计的动力学分析,在475 nm 波长下设置每 30 s 测定一次吸光度,测至 7 min,来测定吸光度随时间的变化曲线。以每分钟 A475(在 475 nm 下的光吸收值)增加 0.001 为一个酶活力单位(U/min),用每分钟 A475增加值来表示该反应的反应速度。该实验反应体系见表 1,相对酶活力以及酶抑制率公式如表 1 所示。表 1 反应体系的组成Table 1 Composition ofreaction system(mL)组分1 组2 组3 组4 组样品000.50.5L-多巴0.500.50酪氨酸酶0.50.50.50.5PBS 溶液2.02.51.52.0相对酶活力=A3-A4A1-A2100%酶抑制率=1-A3-A4A1-A2()100%式中:A1为无芹菜黄酮提取液有反应底物时的吸光度;A2为无芹菜黄酮提取液无反应底物时的吸光度;A3为芹菜黄酮提取液有反应底物时的吸光度;A4为有芹菜黄酮提取液无反应底物时的吸光度。2 结果与分析2.1 芦丁标准曲线按照“1.3.2”中的方法操作,测得不同芦丁黄酮质量浓度(C)在 510 nm 处的吸光度(A)。并建立以芦丁标准溶液浓度(C)为 x 轴,510 nm 处的吸光度(A)为 y 轴的坐标系,绘制出大致呈线性关系的芦丁标准曲线,见图 1。最终得到线性方程:y=8.8380 x-0.0233,R2=0.9847。图 1 芦丁标准曲线Fig.1 Rutin standard curve第 51 卷第 9 期何方颖,等:芹菜黄酮类提取物对酪氨酸酶活性抑制作用的研究101 2.2 芹菜黄酮类提取物中的黄酮得率根据测定的四组芹菜在510 nm 处的吸光度,对照图1 中的芦丁标准曲线得出四组芹菜中黄酮的质量浓度。经计算得出不同种类及部位的芹菜黄酮得率,见表 2。表 2 不同种类及部位的芹菜黄酮得率Table 2 Yield of flavonoids from celery of different types and parts芹菜种类及部位黄酮得率/%西芹茎0.08西芹叶0.22香芹茎0.08香芹叶0.13表 2 结果表明,对比西芹茎、西芹叶、香芹茎、香芹叶这四种不同种类及部位的芹菜,其中西叶茎的黄酮得率为0.22%,远高 于 其 它 三 种,其 次 为 香 芹 叶,黄 酮 得 率 为0.13%。而西芹和香芹两种芹菜茎的黄酮得率都较低,仅为0.08%。因此,我们可以初步得出西芹和香芹中的叶黄酮含量要比茎的黄酮含量高这一结论。2.3 芹菜黄酮类提取物对酪氨酸酶活性的抑制作用2.3.1 芹菜黄酮类提取物对酪氨酸酶的相对酶活力经“1.4”中的相对酶活力公式计算得到不同种类及部位的芹菜提取物对酪氨酸酶的相对酶活力,见图 2 和图 3。图 2 不同种类及部位的芹菜黄酮类提取物对酪氨酸酶的相对酶活力Fig.2 Relative enzyme activity of different kinds andparts of celery flavonoids extracts totyrosinase2.3.2 芹菜黄酮类提取物对酪氨酸酶的抑制率经“1.4”中的酶抑制率公式计算得到不同种类及部位的芹菜提取物对酪氨酸酶的抑制率,见图 3。通过图 3 和图 4 可以得出,香芹叶和西芹叶对酪氨酸酶有较强的抑制作用,其抑制率分别为 91.03%和 70.68%;而香芹茎和西芹茎的抑制作用较弱,抑制率仅有 25.16%和 18.82%。该结果与测得的四组芹菜黄酮含量数据较符合。因此,可以得到初步结论:芹菜叶黄酮含量相对较高,对酪氨酸酶有较强的抑制作用;而芹菜茎的黄酮含量较低,对酪氨酸酶的抑制作用较弱。图 3 不同种类及部位的芹菜黄酮类提取物对酪氨酸酶的抑制率Fig.3 Inhibition rate of Tyrosinase of different kindsand parts of celery flavonoids extracts3 结 论本研究结果表明芹菜叶黄酮含量较高,对酪氨酸酶有较强的抑制作用;而芹菜茎的黄酮含量较低,对酪氨酸酶的抑制作用较弱。因此,芹菜作为酪氨酸酶抑制剂具有一定的可行性,其中芹菜叶中的黄酮含量较高,能有效抑制酪氨酸酶活性。本研究为进一步提取并筛选新型酪氨酸酶抑制剂、开发天然抗氧化剂和美白剂原料提供了实验基础和理论依据。参考文献1DMello S A,Finlay G J,Baguley B C,et al.Signaling pathways inmelanogenesisJ.Int.J.Mol.Sci.,2016,17(7):1144-1162.2 Dewi I K,Pramono S,Rohman A,et al.Potential of corncobs(Zeamays)fraction as tyrosinase inhibitor and natural antioxidant in vitroJ.Food Res.Int.,2021,5(2):67-73.3 余晓红,申玉香,陈洪兴,等.海蓬子提取物抑制酪氨酸合成酶活性的研究J.食品科学,2010,31(21):131-133.4 尹德航,施乐洋,叶雨涵,等.天然产物及其有效成分在化妆品领域的研究与开发J.化学试剂,2022,44(7):960-967.5 张龙.间苯二酚类黄酮衍生物对酪氨酸酶抑制机理研究D.无锡:江南大学,2017.6 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