千年健多糖提取工艺的优化及其生物活性研究.pdf

第 51 卷第 9 期2023 年 5 月广 州 化 工Guangzhou Chemical IndustryVol.51 No.9May.2023科学实验千年健多糖提取工艺的优化及其生物活性研究冯 娟,王笑丹,宋 卉(广东食品药品职业学院,广东 广州 510520)摘 要:本研究优化了千年健多糖提取工艺,考察千年健多糖降血糖的活性。以提取温度、提取时间、料液比和醇沉浓度为影响因子,多糖得率为指标,寻找最优提取方案。通过考察对-淀粉酶和-D-葡萄糖苷酶的抑制活性,研究其降血糖活性。最佳提取参数:提取温度 70,提取时间 70 min,料液比 1 50,醇沉浓度 80%,对-淀粉酶和-D-葡萄糖苷酶活性均具有较强的抑制作用,EC50分别为 2.58、2.49 mg/mL。该工艺稳定可靠,千年健多糖具有较强的降血糖能力。关键词:千年健;提取;多糖;降血糖中图分类号:TS201.1 文献标志码:A文章编号:1001-9677(2023)09-0026-03 基金项目:广东食品药品职业学院校级自然科学(一般项目)课题(项目编号:2020ZR26)。第一作者:冯娟(1981-),女,医学博士,讲师。Study on Optimization of Extraction Process of Polysaccharide ofHomalomena Occulta and Its Biological ActivityFENF Juan,WANG Xiao-dan,SONG Hui(Guangdong Food and Drug Vocational College,Guangdong Guangzhou 510520,China)Abstract:To optimize the extraction process of Homalomena occulta and investigate its biological activity,the effectsof extraction temperature,extraction time,material-liquid ratio and alcohol precipitation volume fraction on the extractionrate of polysaccharides were investigated to find the optimal extraction scheme.By examining the inhibitory activity of-amylase and -D-glucosidase,the hypoglycemic activity was investigated.The best extraction parameters were asfollows:extraction temperature was 70,extraction time was 70 min,material-liquid ratio was 1 50,alcoholprecipitation concentration was 80%.Polysaccharides had a strong inhibitory effect on both -amylase and -D-glucosidase activities,with EC50of 2.58 and 2.49 mg/mL,respectively.The process was stable and reliable.Homalomena occulta polysaccharide had strong hypoglycemic capacity.Key words:Homalomena occulta;extraction;polysaccharide;hypoglycemic千年键,别名一包针、千颗针、千年见,始载于 本草纲目拾遗,是我国传统中药材,主要分布于广东、广西、云南等地1,为天南星科植物千年健 Homalomena occulta(Lour.)Schott 的干燥根茎,具有祛风湿、舒筋活络、止痛、消肿等功效,临床上常用于治疗风湿腰腿痛、风湿及类风湿性关节炎、骨折、跌打损伤等2。现代研究表明,千年健具有多种药理活性。本课题组前期研究发现,千年健多糖对 DPPH、OH、ABTS+、O-2均表现出较好的清除效果,具有较强的抗氧化能力,对 DPPH清除率最高达 78%3.2%,对 OH清除率最高为 68%3.4%,对 ABTS+最高清除率为 66%2.6%,对 O-2最高清除率为 65%2.4%,EC50分别为 2.04、2.53、2.99、2.35 mg/mL3。尹伟等4从千年健乙醇提液中分离得到的 10 个新型化合物,与抗肿瘤药物甲氨蝶呤的体外细胞毒性及单细胞凝胶电泳对比试验表明,化合物的抗肿瘤细胞效果显著,对 4T1、A549、Hela 及 HepG2 肿瘤细胞有很强的毒性。除此以为,千年健中的黄酮5、倍半萜类6等化合物的活性研究也备受关注。为提高千年健这一药用植物资源的开发价值,本实验优化了千年健多糖提取工艺,并考察其降血糖能力。1 试药与仪器1.1 药 材千年健,广东清源中药饮片有限公司(1932146)。1.2 试 剂-淀粉酶、-D-葡萄糖苷酶,阿拉丁试剂公司;葡萄糖、苯酚、硫酸、乙醇、石油醚(60 90)等其他试剂均为分析纯,广州化学试剂厂;所用水为蒸馏水。1.3 仪 器DFT-150 多功能粉粹机,温岭市戴德科技有限公司;SHZ-DIII 循环水真空泵,巩义予华仪器有限责任公司;TDL-40B-II低速大容量离心机,上海安亭科学仪器厂;N-1210 旋转蒸发仪,东京理化;BT125D 电子天平(十万分之一),瑞士梅特勒-托利多公司;UV-2600 紫外可见分光光度计,日本岛津;FDU-1200 冷冻干燥机,东京理化;DF-101S 集热式恒温磁力搅拌第 51 卷第 9 期冯娟,等:千年健多糖提取工艺的优化及其生物活性研究27 器,巩义予华仪器有限责任公司。2 方法与结果2.1 葡萄糖标准溶液的配制将葡萄糖在 105 下干燥至恒重,精密称取 10 mg 于100 mL 容量瓶中,加适量水溶解,定容至刻度,摇匀,配成0.1 mg/mL 的标准葡萄糖溶液,备用。2.2 绘制标准曲线精密吸取 0.1 mg/mL 的葡萄糖标准溶液 0.2,0.4,0.6,0.8,1.0 mL 于 25 mL 具塞试管中,加水至 2 mL,得到浓度为0.01,0.02,0.03,0.04,0.05 mg/mL 的标准溶液,采用苯酚-硫酸法7-8,往试管依次滴加 1.0 mL 的 5%苯酚溶液,轻轻振荡加摇动,小心准确地加入浓硫酸5.0 mL,反应30 min 后,于490 nm 处测定吸光度值。横坐标 X:葡萄糖溶液的浓度(mg/mL),纵坐标 Y:葡萄糖溶液的吸光度(A),对这些数据回归处理,即得线性方程 y=13.55x+0.0195,R2=0.9999,在 0.01 0.05 mg/mL 范围内线性良好。以 2 mL 多糖溶液代替葡萄糖溶液同步测定吸光度,进而求得多糖含量。其原理是多糖在浓硫酸作用下水解成单糖,并迅速脱水形成糠醛衍生物,进一步又与苯酚缩合形成一种颜色稳定的橙黄色物质,该物质在 490 nm最大吸收波长处测得的吸光度与多糖的浓度在一定浓度范围内呈正相关。图 1 葡萄糖标准曲线Fig.1 Glucose standard curve2.3 千年健的脱脂处理千年健含有丰富粗脂肪、粗蛋白和可溶性多糖。脂质含量较高,在水浸提多糖的过程中会阻碍水溶液渗透到样品内部,使多糖的提取率下降。将买来的千年健干品进行手工粉碎至细碎或细粉状,准确称取适量的千年健细粉,装进用脱脂滤纸折叠成的纸筒并放入索氏提取器中,以 125 mL 石油醚,恒温下回流脱脂,至虹吸溶剂变为无色,取出纸筒,药渣置于通风处晾干,得到脱脂千年健干粉,备用。2.4 千年健的除杂处理将适量脱脂的千年健装入纸筒的,以 80%乙醇溶液进行回流除杂,去除千年健中可能含有的单糖、低聚糖、生物碱、苷类及其它醇溶性的干扰成分,还能除去一部分色素,有利于减少在多糖提取过程中的杂质干扰至溶剂变为无色,取出纸筒,药渣置于通风处晾干,得到除杂的脱脂千年健干粉,备用。2.5 千年健粗多糖的提取称取适量的处理好的千年健细粉,以适当固液比和温度进行水浴提取,水提液用纱布滤过除渣。滤液加入 1.5%活性炭,并于40 恒温水浴下搅拌脱色50 min,用4000 r/min 离心机离心 15 min,取上清液,再减压抽滤至滤纸上无活性炭残渣,将滤液置于 90 水浴中搅拌浓缩。最后,按一定醇沉浓度加入乙醇,密封,置于 4 冰箱中醇析 24 h,得絮状沉淀,减压抽滤,收集沉淀。2.6 千年健多糖 Sevage 法脱蛋白试验将沉淀加适量水溶解后,加入溶液 1/3 倍体积的 Sevage 试剂(正丁醇 三氯甲烷=1 4,充分混合),剧烈震荡 20 30 min,3000 r/min 离心 15 min,除去水相与有机相交界处的变性蛋白,收集水层,继续用 Sevage 法脱蛋白,同法操作 2 次。将所得液体再加入约 200 mL 无水乙醇,充分搅拌摇匀,密封,于 4 冰箱中进行二次醇析,放置 24 h,减压抽滤,收集沉淀。沉淀依次经无水乙醇、丙酮和无水乙醚洗涤两次,自然挥干,得纯化多糖。2.7 正交设计优化多糖提取工艺根据单因素试验结果3,设计以提取温度(60,70,80)、提取时间(50,60,70 min)、料液比(1 30,1 40,1 50)和醇沉体积分数(60%,70%,80%)作为影响因素,溶液经脱蛋白、脱色后,再次过滤,浓缩,醇沉过夜,离心得粗多糖,冷冻干燥机冷冻 24 h,取出存好,备用。以多糖提取率作为评价指标,设计 L9(34)正交试验,每组 3 个平行,多糖得率=多糖质量/脱脂千年健粉末的质量100%。从表 1 可知,千年健多糖提取各因素影响程度依次为料液比提取时间提取温度醇沉体积分数,最优提取工艺为 A2B3C3D3,即提取温度为 70,提取时间 70 min,料液比为 1 50,醇沉体积分数为 80%。表 1 试验设计及结果Table 1 Experimental design and results试验号因素(A)提取温度/(B)提取时间/min(C)料液比(D)体积分数/%取率/%111112.15212222.45313332.68421232.44522312.68623122.31731322.44832132.18933212.39K17.287.036.647.22-K27.437.317.287.20-K37.017.387.807.30-k12.432.342.212.41-k22.482.442.432.40-k32.342.462.602.43-R0.050.090.210.03-28 广 州 化 工2023 年 5 月2.8 多糖提取的验证为验证工艺的稳定性,按照优化的工艺平行提取三次,多糖提取率分别为 2.71%、2.75%、2.69%,工艺稳定性良好。表 2 优化工艺多糖提取率Table 2 Polysaccharide extraction rate of optimized process提取条件提取温度/提取时间/min料液比醇沉体积分数/%提取率/%70701 50802.712.752.692.9 千年健多糖降血糖活性研究92.9.1 抑制-淀粉酶活性将体积为500 L 的1 U/mL-淀粉酶溶液和同体积的多糖溶液混合物在37 下孵育10 min,加同体积淀粉液,10 min 后加入 1 mL DNS 试剂,沸水浴 5 min,冷却后加水 10 mL,520 nm 处测定吸光值,卡波糖为阳性对照组。抑制率(%)=1-(A3-A4)/(A1-A2),测试参数见表3。从图2a 可知,千年健多糖浓度对-淀粉酶的抑制活性存在正相关,EC50为2.58 mg/mL。表 3-淀粉酶的抑制活性测定参数Table 3 Determination parameters of inhibitoryactivity of-amylase组别-淀粉酶溶液/L多糖/L淀粉溶液/LDNS溶液/mL水/mL吸光度空白组500-空白对照组-样品组500500背景对照组-500500110A1A2A3A42.9.2 抑制-D-葡萄糖苷酶活性将 pH 6.9 磷酸盐缓冲溶液2 mL,多糖溶液100 L,1 mg/mL还原谷胱甘肽 50 L 和 5.7 U/mL-D-萄糖苷酶 10 L 依次加入试管中,37 孵育,10 min 后加入浓度为 6 mmol/L 的对-硝基苯基-D-吡喃葡萄糖苷溶液(PNPG)200 L,20 min 后加入浓度为 0.1 mol/L 的 Na2CO3溶液 10 mL 终止反应,400 nm处测定吸光度,卡波糖为阳性对照组。抑制率(%)=1-(A2-A3)/A1,测试参数见表3。从图2b 可知,千年健多糖浓度对-D-葡 萄 糖 苷 酶 的 抑 制 活 性 存 同 样 存 在 正 相 关,EC50为2.49 mg/mL。表 3-D-葡萄糖苷酶的抑制活性测定参数Table 3 Determination parameters of inhibitory activity of-D-glucosidase组别PBS/mL多糖/L还原谷胱甘肽/L-D-葡萄糖苷酶/LPNPG/LNa2CO3/mL吸光度空白组样品组背景对照组2-100100501010-20010A1A2A3图 2 千年健多糖降血糖活性Fig.2 Hypoglycemic activity of Qianjian polysaccharide3 结 论千年健是我国传统的中药材,在广东、广西、云南等地区被广泛种植,植物资源丰富,药用历史悠久,是汉族、傣族、苗族的习用药材,临床应用广泛。本文对千年健多糖的提取工艺和降血糖活性进行了研究。前期用石油醚对穿破石先进行回流脱脂处理,降低脂质的干扰,促进了多糖的有效提取。用80%乙醇回流进一步除杂,除去千年健样品中可能含有的单糖、低聚糖、生物碱、苷类及其它醇溶性的干扰成分,还能除去一部分色素,进一步减少在多糖提取过程中的杂质干扰。通过正交设计优化提取工艺,发现最优提取工艺为提取温度 70,提取时间 70 min,料液比 1 50,醇沉浓度 80%。进一步研究发现,千年健多糖对两种糖尿病关键酶的抑制作用,多糖对-淀粉酶和-D-葡萄糖苷酶活性均具有较强的抑制作用,EC50分别为 2.58、2.49 mg/mL。本文通过对其多糖提取工艺及生物活性进行初步研究,对该资源的进一步研究提供了实验基础。参考文献1 中华人民共和国卫生部药政管理局,中国药品生物制品检定所.中药材手册M.北京:人民卫生出版社,1989:33.2 国家中医药管理局中华本草编委会.中华本草(第八册)M.上海:上海科学技术出版社,1998:501-502.3 冯娟,黄珊珊,蔡琳,等.千年健多糖提取工艺优化及其抗氧化活性研究J.海峡药学,2022,34(1):43-47.4 尹伟,胡琪,李新章,等.千年健的化学成分及抗肿瘤活性研究J/OL.天然产物研究与开发:1-112022-04-06.http:/ 叶静,肖美添,昝珂,等.瑶族药材千年健倍半萜类成分研究J.中国中药杂志,2016,41(14):2655-2659.7He N W,Zhai X C,Zhang X B,et al.Extraction,purification andcharacterization of water-soluble polysaccharides from green walnuthusk with antioxidant and antiproliferative capacities J.ProcessBiochemistry,2020,88(Jan.):170-179.8 何念武,秦娇娇,王新军.超声辅助提取灰灰菜多糖工艺优化及其体外抗氧化活性J.食品工业科技,2018,39(1):241-246.9 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