浓香型白酒窖池中可培养细菌多样性研究.pdf

浓香型白酒窖池中可培养细菌多样性研究食品与发酵工业FOODANDFERMENTATIONINDUSTRIESD0I:10.13995/ki.11-1802/ts.035105引用格式：刘瑞娜，奚文韬，赵东，等.浓香型白酒窖池中可培养细菌多样性研究J.食品与发酵工业，2 0 2 3，49（17）：8 2-9 3.LIURuina,XI Wentao,ZHAO Dong,et al.Diversity of cultivable bacteria in cellars of strong-flavor BaijiuJJ.Food and Fermen-tation Industries,2023,49(17):82-93.刘瑞娜”，奚文韬，赵东”，张天圆，郑佳”，张京涛，姚栗*，翟磊1*1（中国食品发酵工业研究院有限公司，中国工业微生物菌种保藏管理中心，北京，10 0 0 15）2（宜宾五粮液股份有限公司，四川宜宾，6 440 0 0）摘要利用可培养组技术，通过设计和优化筛选培养基，结合基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（matrix-as-sisted laser desorption/ionization time of flight mass spectrometry，M A L D I-T O FM S）和16 SrDNA基因鉴定技术，大规模筛选鉴定浓香型白酒窖池中可培养细菌，重点突破厌氧菌的分离培养。研究结果表明，采用5种特定的厌氧培养基和2 种好氧培养基，从浓香型白酒窖池中共分离得到了来自2 1个属44个种的12 4株细菌，包括9 株潜在细菌新种。其中，厌氧条件分离得到10 0 株，好氧条件分离得到2 4株；窖泥样品分离得到6 0 株，酒样品分离得到6 4株。芽胞杆菌属（Bacillus sp.）和梭菌属（Clostridiumsp.）是窖池样品中分离的优势菌种。根据不同分离筛选条件和分离生境的可培养细菌种类和丰度，确定了6 株浓香型白酒窖池特征菌，并解析了特征菌的生物学特性。该研究为浓香型白酒窖池中潜在新种的挖掘，特征性菌种资源的定向筛选、互作机制解析、功能性研究开发及产业化应用奠定了基础。关键词浓香型白酒；窖泥；酒；可培养细菌白酒在中国有着悠久的酿造和饮用历史,是中国各种传统酒类（除果酒、米酒外）的统称。19 7 9 年全国第三届评酒大会根据不同酿造工艺、制曲方式和风味特征等首次正式提出并确立了浓香型、清香型、酱香型、米香型和其他香型5种白酒香型1-2 。目前市场上的白酒香型主要是以4种基础香型为主的12 种香型,其中作为行业占比第一大香型的浓香型白酒因其“窖香浓郁、绵柔甘、香味协调、尾净余长”的风味特点被誉为“中国白酒典范”2-4。2 0 2 1年浓香型白酒最新标准GB/T10781.12021白酒质量要求第1部分：浓香型白酒正式发布，对浓香型白酒给出明确定义：以粮谷为原料，采用浓香大曲为糖化发酵剂，经泥窖固态发酵，固态蒸馏、陈酿、勾调而成的，不直接或间接添加食用酒精及非自身发酵产生的呈色呈香呈味物质的白酒。浓香型白酒采用泥窖作为发酵载体，已有研究表明在“泥窖生香”的微生态机制中主要包含2 个发酵体系：酒发酵体系和窖泥发酵体系。2 个优势菌群全然不同的体系中，微生物在发酵过程中发生了菌群的迁移富集和代谢产物的传递交换，共同影响着浓香型白酒典型“窖香”的形成。老窖出好酒,在连续不断的生产过程中，窖泥中的营第一作者：硕士，工程师（姚粟正高级工程师和翟磊正高级工程师为共同通信作者，E-mail：y a o s u c h i n a-c i c c.o r g;z h a i l e i c h i n a-c i c c.o r g）基金项目：中国轻工业浓香型白酒固态发酵重点实验室开放基金项目（2 0 2 1JJ008）收稿日期：2 0 2 3-0 2-12，改回日期：2 0 2 3-0 3-16822023 Vol.49 No.17(Total 485)养成分和特征特性不断发生变化，微生物的群落结构不断的进行演替,形成了适合于白酒酿造的特有的微生物群落，并最终决定了浓香型白酒的品质5-8 。目前对浓香型白酒酿造过程中窖池微生物体系与其酒体品质及风味特征相关机理的研究有了一定的进展，但三者之间的互作机制和内在关联仍未完全解析。浓香型白酒窖池中微生物群落结构的解析以及特征微生物资源的发掘对揭示白酒酿造风味机理、提升白酒品质、加强质量管理具有重要意义。目前白酒窖池中微生物群落结构研究主要采用聚合酶链式反应变性梯度凝胶电泳（PCR-denatured gradient gelelectrophoresis,PCR-DCCE）9 、聚合酶链式反应单链构象多态性分析（PCR-single strand conformation poly-morphism,PCR-SSCP)10)、实时荧光定量PCR(quanti-tative real-timePCR,qPCR)、宏基因组学和宏转录组学12-14 及高通量测序5.15 等非培养技术,该类技术可以获得窖泥微生物菌群的定性及相对定量信息16 ,但对其中功能微生物的筛选与作用机制解析仍需获得微生物纯培养物。可培养组学（cul-turomics)是综合利用多种培养条件进行微生物菌种的分离培养，并通过基质辅助激光解吸电离飞行时间研究报告质谱(matrix-assisted laser desorption/ionization time of菌培养基、苛养厌氧菌琼脂培养基、改良PYG培养基flight mass spectrometry,MALDI-TOF MS)和 16 S rDNA和蛋白瘤胃球菌培养基作为厌氧微生物分离培养基，基因测序技术对分离菌种进行大规模鉴定,尽可能多分别用于片球菌属/乳杆菌属、梭菌属、苟养厌氧菌、地获得在常规培养条件下不可培养微生物的一种技喜热菌属/普雷沃氏菌属和瘤胃球菌属等厌氧或兼性术17-18 。本研究依据浓香型白酒窖池中微生物群落厌氧微生物的选择性分离。7 种培养基的配方如下，结构特征,设计和优化了7 种筛选培养基,开展了窖灭菌条件均为12 1、15min。池中功能微生物,尤其是难培养厌氧微生物资源的发TSA培养基（g/L）：胰蛋白陈15.0,大豆蛋白陈掘。根据不同分离筛选条件和分离生境的可培养细5.0,NaCl5.0,琼脂15.0。菌种类和丰度，确定了浓香型白酒窖池特征菌,并解R2A琼脂培养基（g/L）：蛋白陈0.5，酵母粉析特征菌的生物学特性。0.5，酪蛋白陈0.5，葡萄糖0.5，可溶性淀粉0.5，1材料与方法K,HP040.3,丙酮酸钠0.3,MgS040.024,琼脂15.0加热溶解。1.1实实验材料1.1.1仪器与试剂HG-50高压灭菌锅，日本平山制作所株式会社；移液器（10 0 L、1m L、5m L），德国Eppendorf公司；AC2-4S1生物安全柜，新加坡艺思高科技有限公司；DG-250厌氧工作站，英国DonWhitleyScientific公司;DLQ120-B智能厌氧制备仪，北京爱思普科技有限公司;BHG-8082型恒温培养箱，上海一恒科学仪器有限公司;LX-165T2R医用离心机，青岛海特生物医疗有限公司；MALDI-TOFMS基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱仪，德国BrukerDaltonikGmbH公司；全自动革兰氏染色仪，青岛澜澈生物科技有限公司；厌氧盒，日本三菱化学公司；ECLIPSE80i光学显微镜,尼康仪器（上海)有限公司。0.85%生理盐水，北京君立康科技发展有限责任公司；厌氧产气袋，日本三菱化学公司；细菌基因组DNA提取试剂盒、dNTPs、T a q D NA 聚合酶、DNAMarker,天根生化科技（北京）有限公司；溶菌酶、琼脂糖，北京全式金生物技术有限公司；其他试剂均为国产或进口分析纯。1.1.2培养基的选择和制备通过对浓香型白酒窖池中微生物群落结构和窖池中特征菌种生理代谢特征研究相关文献的调研5.19-2 0),参考 KOMODO(Known Media Database)网站（http：/k o m o d o.m o d e l s e e d.o r g/）中对不同种属厌氧微生物培养基配制的建议要求2 1，最终选择了7种培养基进行浓香型白酒窖池中可培养细菌的分离培养研究。TSA培养基和R2A琼脂培养基作为好氧微生物分离培养基,其中TSA培养基主要用于分离常见好氧菌和不动杆菌属；R2A琼脂培养基则用于分离苛养好氧菌。改良MRS琼脂培养基、强化梭改良MRS琼脂培养基（g/L）：蛋白陈10.0,牛肉膏10.0，酵母粉5.0，葡萄糖2 0.0，柠檬酸铵2.0，吐温8 0 1.0 mL,半胱氨酸盐酸盐0.5,CH,CO0Na5.0，K,HP042.0,MgS047H,0 0.1,MnS040.05,琼脂15.0。强化梭菌培养基（g/L）：胰蛋白陈10.0,牛肉膏10.0，酵母粉3.0，葡萄糖5.0,NaCl5.0，可溶性淀粉1.0,CH,CO0Na5.0，半胱氨酸盐酸盐0.5，琼脂15.0。苟养厌氧菌琼脂培养基（g/L）：混合蛋白陈23.0,NaCl5.0，可溶性淀粉1.0，葡萄糖1.0,C,H,Na0，1.0,L-精氨酸1.0,琥珀酸钠0.5,半胱氨酸盐酸盐0.5,NaHCO,0.4,可溶性焦磷酸0.2 5,氯化血红素0.0 1,维生素K0.001,琼脂15.0。改良PYG培养基（g/L）：胰蛋白陈5.0,蛋白陈5.0,酵母粉10.0，牛肉膏5.0,葡萄糖5.0,K,HP042.0,吐 温-8 0 1.0 mL，Na H C O，0.4,Na C l 0.0 8,KH,P04 0.04,MgS047H,0 0.02,CaCl,2H,0 0.01,刃天青1.0 mg/L。加热煮沸3 5min，冷却后添加氯化血红素5mg/L、维生素K,1mg/L、半胱氨酸盐酸盐0.5g/L和琼脂15.0 g/L,pH7.2。蛋白瘤胃球菌培养基（g/L）:胰蛋白陈5.0,酵母粉2.0,葡萄糖3.0,纤维二糖2.0，（NH4）SO 40.8，NaC10.48,KH,PO4 0.24,K,HPO04 0.24,MgSO4 7H,00.1,CaCl,7H,00.064,刃天青1.0 mg/L。加热煮沸35min,冷却后添加Na,CO，4.0 g/L、脂肪酸溶液1mL/L、半胱氨酸盐酸盐0.5g/L和琼脂15.0 g/L,pH 7.0。1.1.3样品采集样品采集自四川省宜宾市某浓香型白酒生产企2023 年第 49 卷第17 期(总第 48 5 期）8 3食品与发酵工业FOODANDFERMENTATIONINDUSTRIES业3个车间的窖池，3个窖池的窖龄分别为30 年、20年和15年，样品来源包括窖泥和酒酷。窖泥样品分别从距地面约0.3、1、2 m的窖池四壁和底部采集，3个窖池的窖泥样品混匀作为窖泥待检样品；酒样品采用五点取样法，从四周和中间采集，3个窖池的酒酷样品混匀作为酒酷待检样品。窖泥和酒样品均从出池当天（2 0 2 2 年1月13日）的一批窖池中采好氧培养稀释涂布窖泥稀释酒酷样品稀释液样获得，采集后的样品密封，-2 0 保存备用。1.2实验方法设计7 种不同筛选分离培养基，采用好氧和厌氧的培养方式,结合MALDI-TOFMS和16 SrDNA基因测序技术对浓香型白酒窖泥和酒样品中的细菌进行大规模分离筛选和鉴定，本实验建立的白酒窖池中可培养细菌多样性研究的技术路线如图1所示。好氧分离培养涂布厌氧盒分离培养厌氧培养滚管分离培养MALDI-TOFMS保藏16S rRNA基因鉴定纯化鉴定图1浓香型白酒窖池中可培养细菌多样性研究技术路线Fig.1 Technical route of culturable bacteria diversity research in strong-flavor Baijiu cellars1.2.1好氧微生物的分离纯化在生物安全柜中分别称取2 5g窖泥待检样品和酒待检样品于2 2 5mL无菌生理盐水中，充分混匀制备成1：10 样品稀释液，吸取1mL稀释液加入9mL无菌生理盐水，充分混匀制备成1:10 0 样品稀释液，重复上述操作对样品进行梯度稀释，取2 3个合适浓度的稀释液分别涂布于TSA培养基和R2A琼脂培养基平板上,37 培养3d。从2 种培养基平板上选取菌落形态不同的单菌落，在对应的培养基平板上四区划线分纯,37 培养3d。重复上述操作对分离菌株进行纯化，根据菌落形态和革兰氏染色镜检确认，将纯化后的分离菌株编号并转移至含15%无菌甘油的甘油管中，-8 0 冰箱保藏备用。1.2.2厌氧微生物的分离纯化为最大限度地分离获得浓香型白酒窖池中不同生长特性的厌氧微生物，对厌氧菌的分离采用2 种方法：平板涂布法和滚管法。平板涂布法：试验前一天将无菌生理盐水、5种厌氧微生物分离培养基放置于厌氧工作站中过夜置换除氧，刃天青作为指示剂确认氧气除净。试验当天，在厌氧操作台分别称取2 5g窖泥待检样品和酒842023 Vol.49 No.17(Total 485)酷待检样品于2 2 5mL无菌生理盐水中，充分混匀制备成1:10 样品稀释液，吸取1mL稀释液加人9 mL无菌生理盐水，充分混匀制备成1：10 0 样品稀释液，重复上述操作对样品进行梯度稀释，取2 3个合适浓度的稀释液分别涂布于5种厌氧培养基平板上，37厌氧培养3d后参考好氧微生物纯化及保藏方法在厌氧操作台中对厌氧分离菌株四区划线分纯和-80冰箱甘油管保藏。滚管法：5种分装到厌氧管中的厌氧微生物分离培养基经智能厌氧制备仪置换除氧后高温灭菌,将灭菌后的液态琼脂培养基厌氧管于50 水浴锅中保温备用。用无菌注射器吸取10 0 L于厌氧工作站中稀释至适宜梯度的样品稀释液加入到厌氧管中，平放至盛有碎冰块的容器中迅速滚动，使带菌培养基在厌氧管内壁形成均匀的薄膜,完全凝固的厌氧管置于厌氧袋中37 厌氧培养3d。在厌氧工作站中用无菌针头挑取厌氧管内壁上菌落形态不同的单菌落，转接至相应的液体培养基厌氧管中37 厌氧培养2 d。将梯度稀释后的厌氧管中的菌液用无菌注射器再次加人到液态琼脂培养基厌氧管中冰浴滚管。重复上述操作对厌氧管分离菌株进行纯化，至观察菌落和菌体研究报告形态均一后编号保藏于-8 0 冰箱备用。双向测序。1.2.3分离菌株MALDI-TOFMS鉴定1.2.5特征菌种系统发育分析采用MALDI-TOFMS鉴定系统对分离菌株进行根据不同分离筛选条件和分离生境的可培养细快速鉴定，以初步确定分离菌株的分类学地位2 。菌种类和丰度，结合文献调研确定6 株浓香型白酒窖该方法主要通过采集微生物稳定表达的核糖体蛋白池潜在特征菌并对特征菌种进行了系统发育分析。指纹图谱，与已知微生物菌种蛋白指纹图谱数据库比将测序得到的各菌株序列整理拼接后提交至Gen-对分析后，得到待测菌株的鉴定结果及置信水平，实Bank,运用Clusta-X软件对序列进行校正2 6 ,通过现微生物菌种的快速鉴定2 3-2 4。本研究使用的NCBI进行BLAST比对后利用MEGA软件中的邻接MALDI-TOFMS鉴定数据库包括10 8 33株菌，其中法（Neighbor-Joining）开展序列同源性分析及系统发革兰氏阴性菌4318 株,革兰氏阳性菌557 2 株，酵母育树的构建，自展值（bootstrapvalue）设置重复取样菌和丝状真菌943株。1 000次。根据GB/T33682一2 0 17 基质辅助激光解析电1.2.6特征菌种形态学特征和生理生化试验离飞行时间质谱鉴别微生物方法通则中甲酸提取将纯化后的6 株浓香型白酒窖池特征菌种代表菌法对分离菌株进行MALDI-TOFMS鉴定：分别挑取株接种于相应分离培养基上，观察不同菌株菌落形态各待测菌株菌落于盛有30 0 L超纯水的1.5mL离特征。同时将分离株菌落通过戊二醛固定、无菌水漂心管中，充分混匀后加人9 0 0 L无水乙醇（色谱洗、乙醇梯度脱水、干燥及离子溅射仪喷金后固定于样纯），旋涡振荡1min离心菌体细胞（130 0 0 r/min，品台上，利用扫描电镜观察菌株菌体微观形态。结合2min）弃去上清液，重复离心操作,用移液器吸净上宏观和微观形态特征参照伯杰氏细菌鉴定手册2 7 ，清液后向沉淀中加入50 L70%的甲酸水溶液，旋涡按照梅里埃API50CHB和API20A鉴定试剂盒说明振荡重悬菌体，再加入50 L乙腈混合均匀，书对分离菌株进行碳源利用等生理生化指标检测。13000r/min离心2 min，吸取1L上清液点样在样品靶板孔中,待室温下晾干后滴加1L-氰基-4-羟基肉桂酸（-cyano-4-hydroxycinnamic acid,HCCA）基质溶液覆盖在每个样本上，室温下自然晾干。将点样完成的靶板放入仪器中，按照仪器操作规程设置参数后采集待测菌株蛋白指纹图谱。采集到的质谱数据导人本地微生物指纹图谱库，在鉴定系统中得到待测菌株的鉴定结果。1.2.4分离菌株DNA提取和16 SrDNA及功能基因测序对于MALDI-TOFMS鉴定未得到结果的菌株，则采用16 S rDNA及功能基因测序技术进行进一步鉴定。按照TIANGEN细菌基因组DNA提取试剂盒说明书的操作步骤提取各分离菌株的基因组DNA，-20保存备用。分离菌株的16 SrDNA测序PCR扩增以2 7 F和1492 R为引物，功能基因gyrB测序PCR扩增以gyrB-F(5-GAAGTCATCATGACCGTTCT-GCAYGCNGGNGGNAARTTYGA-3)和 gyrB-R(5-AG-CAGGATACGGATGTGCGAGCCRTCNACRTCNGCRTC-NGTCAT-3)为上下游引物，反应体系参考文献2 5的方法。PCR完成后对扩增产物进行1.5%琼脂糖凝胶电泳,以检测DNA提取质量。将条带清晰且无杂带的扩增产物送生工生物工程股份有限公司进行2结果与分析2.1浓香型白酒窖池中可培养细菌分离纯化结果经多次划线分纯及菌落菌体形态特征排重后，从浓香型白酒窖池中共分离得到来自2 1个属44个种的12 4株细菌，包括芽胞杆菌属（Bacillussp.）、泪珠状产孢菌属（Lacrimispora sp.）、嗜蛋白菌属（Protein-iphilumsp.）、类芽胞杆菌属（Paenibacillus sp.）和互营球菌属（Syntrophococcussp.）在内的9株潜在细菌新种。厌氧条件分离得到10 0 株分离株，其中PYG培养基35株,蛋白瘤胃球菌培养基18 株,苟养厌氧菌培养基18 株,强化梭菌培养基13株,MRS培养基16株。在好氧条件下2 种好氧培养基分离出2 4株可培养菌株：富集培养基TSA分离出14株，寡营养的R2A培养基分离出10 株。厌氧条件下分离得到的微生物数量显著高于有氧环境，表现出更高的丰度。在窖泥和酒酷2 种不同的分离生境中,获得的可培养微生物在数量方面相差不大，分别分离到6 0 株和6 4株。2.2分离菌株MALDI-TOFMS及16 SrDNA鉴定结果采用甲酸提取法通过MALDI-TOFMS快速鉴定2023 年第 49 卷第 17 期(总第 48 5 期)8 5 食品与发酵工业FOODANDFERMENTATIONINDUSTRIES系统对浓香型白酒窖池中分离到的12 4株可培养微生物进行分类学地位确认。结果显示8 1株分离株得到种水平的鉴定结果，占待检菌株的6 5.3%。采用16SrDNA测序技术对经MALDI-TOFMS鉴定未得到结果的43株细菌进行进一步鉴定。鉴定分析结果表Table 1 Identification results of strains isolated from the cellars of strong-flavor baijiu培养基鉴定结果（菌株数）AcinetobacterlwoffiEscherichia coliBacillus siamensisCorynebacterium callunaeTSA培养基Bacillus velezensis(2)ClostridiumtyrobutyricumR2A培养基Bacillus siamensis(3)Bacillus cabrialesii(3)Clostridium kluyveriClostridium leptumPYC培养基ClostridiumliquorisClostridium sporosphaeroidesClostridiumtyrobutyricum(2)Bacllus licheniformis(3)蛋白瘤胃球菌Enterococcus eurekensis培养基Enterococcus songbeiensisBacillus albus(2)Bacillus licheniformis苛养厌氧菌Caldibacillus hisashii(2)培养基Clostridium sartagoformeLacrimispora celerecrescensCaldibacillus hisashii强化梭菌培养基ClostridiumtyrobutyricumLacrimispora sp.Acetilactobacillus jinshanensisMRS培养基ClostridiumtyrobutyricumLactobacillusacetotolerans2.3浓香型白酒窖池中可培养细菌多样性分析2.3.1不同分离条件可培养细菌多样性分析从浓香型白酒窖池中分离得到的12 4株分离株中,厌氧环境分离到的10 0 株包含16 个属的34种。其中PYG培养基分离效果最好,共获到8 个属17 个种的共35株细菌，包括梭菌属（Clostridium sp.）、芽胞杆菌属（Bacilus sp.）、泪珠状产孢菌属（Lacrimis-pora sp.）、鼠伴菌属（Muricomes sp.）、嗜热芽胞杆菌属（Caldibacillus sp.）、嗜蛋白菌属（Proteiniphilumsp.）、氨基酸杆状菌属（Aminobacterium sp.）、互营球菌属（Syntrophococcus sp.）和3株潜在细菌新种，梭菌属和芽胞杆菌属为该培养基中的优势分离菌种，分别占该培养基总分离株的2 2.9%和34.3%；蛋白瘤胃球菌培养基分离到6 个属10 个种的共18 株分离株，862023 Vol.49 No.17(Total 485)明,12 4株分离菌株均得到种属水平的鉴定结果（表1），所有分离株分属于2 1个属的44种，包括Bacillussp.,Lacrimispora sp.,Proteiniphilum sp.,Paenibacillussp.和Syntrophococcus sp.在内的9株潜在细菌新种。表1浓香型白酒窖池分离菌株鉴定结果窖泥样品鉴定结果（菌株数）Solibacillus silvestrisBacillus cabrialesiiLacrimispora sp.(2)Lacrimisporacelerecrescens(2)Muricomes intestini(2)ProteiniphilumacetatigenesAminobacteriummobileLacrimispora sp.Lacrimispora celerecrescensLacrimispora sphenoidesLacrimisporasphenoides(2)MuricomesintestiniProteiniphilum sp.Weizmannia coagulansMuricomes intestini(2)Weizmannia coagulansSedimentibacter saalensisLactobacillus acidophilusStreptococcus salivariusWeizmannia coagulans酒醋样品AminobacteriummobileMuricomes intestiniClostridiumbutyricumPropionibacterium acnesClostridium tyrobutyricumSolibacillus silvestrisBacillus sp.Bacllus safensisBacillus siamensis(3)Bacillus cabrialesiiBacillus cabrialesiiClostridiumljungdahliBacillus licheniformis(4)ClostridiumtyrobutyricumBacillus paralicheniformis(4)Muricomes intestini(3)Caldibacillus hisashi(3)Syntrophococcus sp.Bacillus licheniformis(4)Syntrophococcus sp.Bacillus paralicheniformisWeizmannia coagulans(3)Paenibacillus sp.Bacillus licheniformisClostridium ljungdahliClostridiumramosumBacillus licheniformisBacillus paralicheniformisClostridium ljungdahliAcetilactobacillus jinshanensisBacillus cabrialesiiClostridiumtyrobutyricumLactobacillusacetotoleransLactobacillusacidophilus包括芽胞杆菌属、泪珠状产孢菌属、互营球菌属、肠球菌属（Enterococcussp.）、类芽胞杆菌属（Paenibacillussp.）、魏茨曼氏菌属（Weizmannia sp.）和3株潜在新种微生物,芽胞杆菌属为该培养基中的优势分离菌种，占该培养基总分离株的44.4%；苛养厌氧菌培养基分离到7 个属的11种共18 株分离株,包括芽胞杆菌属、泪珠状产孢菌属、梭菌属、嗜热芽胞杆菌属、鼠伴菌属、嗜蛋白菌属、魏茨曼氏菌属和1株潜在细菌新种,芽胞杆菌属和泪珠状产孢菌属为该培养基中的优势分离菌种，均占该培养基总分离株的2 2.2%；强化梭菌培养基分离到7 个属的9 种共13株可培养细菌，包括梭菌属、芽胞杆菌属、泪珠状产孢菌属、嗜热芽胞杆菌属、鼠伴菌属、魏茨曼氏菌属、沉积物杆菌属（Se d im e n t ib a c t e r s p.）和1株潜在新种，梭菌属和鼠伴Lacrimispora sphenoidesMuricomes intestiniWeizmanniacoagulansClostridium tyrobutyricumMuricomes intestiniSedimentibactersaalensisLactobacillus paracaseiLactobacillus plantarumStreptococcus oralisStreptococcus salivariusWeissella confusa研究报告菌属为该培养基中的优势分离菌种,均占该培养基总MRS培养基外的4种厌氧培养基中均获得一定数量分离株的2 3.1%;MRS培养基分离到7 个属的11种的分离株；魏茨曼氏菌属则在除PYG培养基外的4共16 株分离株，包括梭菌属、芽胞杆菌属、魏茨曼氏种厌氧培养基中均有分离株出现；嗜热芽胞杆菌属和菌属、醋乳杆菌属（Acetilactobacillus sp.）、乳杆菌属鼠伴菌属在蛋白瘤胃球菌培养基和MRS培养基中未（La c t o b a c i l l u s s p.）、链球菌属（Streptococcus sp.）和魏有分离株获得,但在其余3种培养基中均得到了可培斯氏菌属（Weissella sp.），乳杆菌属和链球菌属为该养菌株。而部分种属的微生物只在特定培养基中有培养基中的优势分离菌种,分别占该培养基总分离株所分离：类芽胞杆菌属和肠球菌属只在蛋白瘤胃球菌的37.5%和18.8%。厌氧条件下获得的分离株中窖培养基中分离出,分别为1株和2 株；氨基酸杆状菌池优势微生物种属芽胞杆菌属、梭菌属及同属于梭菌属仅在PYG培养基中分离到1株；沉积物杆菌属只目（Clostridiales）的泪珠状产孢菌属分离株数量均占在强化梭菌培养基中分离到2 株；醋乳杆菌属、乳杆比较大：芽胞杆菌属分离到4个种共2 7 株，占厌氧分菌属、链球菌属和魏斯氏菌属则仅在MRS培养基中离株总数的2 7%；梭菌属分离到8 个种共16 株，占得到一定数量的分离株。与R2A相比,TSA培养基厌氧分离总数的16%；泪珠状产孢菌属得到4种共由于营养成分更丰富，体现出了更优良的细菌分离效12株，占总数的12%。其他如嗜热芽胞杆菌属2 8 、果：棒杆菌属、土壤芽胞杆菌属、不动杆菌属、丙酸杆乳杆菌属2 9、链球菌属30 1和嗜蛋白菌属31 等浓香型菌属和埃希氏菌属均仅在该培养基上得到了分离株。白酒窖池中已报道的常见微生物菌属也均获得了不2.3.2不同分离生境可培养细菌多样性分析同数量的分离株。浓香型白酒窖池的窖泥和酒醋分离得到的12 4好氧条件下的2 种培养基分离到9 个属14个种株可培养菌株中，6 0 株来源于窖泥样品，包括15个的2 4株可培养菌株。其中TSA培养基分离到9 个属的2 9个种：芽胞杆菌属、梭菌属、泪珠状产孢菌、醋属的11种共14株可培养细菌，包括梭菌属、芽胞杆乳杆菌属、氨基酸杆状菌属、嗜热芽胞杆菌属、棒杆菌菌属、鼠伴菌属、氨基酸杆状菌属、棒杆菌属（Coryne-属、肠球菌属、乳杆菌属、鼠伴菌属、嗜蛋白菌属、沉积bacterium sp.）、土壤芽胞杆菌属（Solibacillus sp.）、不物杆菌属、土壤芽胞杆菌属、链球菌属和魏茨曼氏菌动杆菌属（Acinetobacter sp.）、丙酸杆菌属（Propi-属。其中分离株数量占比较大的优势菌种芽胞杆菌onibacterium sp.）和埃希氏菌属（Escherichia sp.），梭属有5种16 株，占窖泥分离株总数的2 6.7%；泪珠菌属和芽胞杆菌属为该培养基中的优势分离菌种,均状产孢菌属有4种11株，占窖泥分离株的18.3%；占该培养基总分离株的2 1.4%；寡营养的R2A培养梭菌属有6 种10 株，占窖泥分离株的16.7%。除肠基分离到芽胞杆菌属的4种共10 株分离株，包括1球菌属和乳杆菌属有2 种分离株外，其余10 个属分株潜在芽胞杆菌属新种。有氧条件下分离到的2 4株离的可培养细菌均仅有1种分离株出现，且有4株泪可培养细菌优势菌属与厌氧条件分离株相似,数量较珠状产孢菌属疑似新种和1株嗜蛋白菌属疑似新种，多的也为芽胞杆菌属和梭菌属,前者得到5个种的表现出较高的微生物种属多样性。13株,后者包含2 个种共3株。此外丙酸杆菌属、土酒酷样品中共得到18 个属30 个种的6 4株分离壤芽胞杆菌属、棒杆菌属等可培养微生物菌属在有氧株，包括芽胞杆菌属、梭菌属、泪珠状产孢菌、醋乳杆分离培养条件下也均得到了一定数量的分离菌株。菌属、氨基酸杆状菌属、嗜热芽胞杆菌属、乳杆菌属、比较不同分离筛选条件下获得的可培养细菌种鼠伴菌属、沉积物杆菌属、土壤芽胞杆菌属、链球菌类和丰度，可以发现在厌氧条件下分离到的细菌种属属、魏茨曼氏菌属、不动杆菌属、埃希氏菌属、丙酸杆类型及数量均高于有氧环境，表现出更高的丰度和多菌属、类芽胞杆菌属、互营球菌属和魏斯氏菌属。其样性。值得注意的是,在有氧和厌氧2 种分离培养环中菌株数量较多的优势分离菌种芽胞杆菌属有6 种境下获得的窖池分离菌株数量最多的均为芽胞杆菌24株，占酒酷分离株总数的37.5%；梭菌属有4种属和梭菌属。表明可以通过优化和改良培养基等方9株，占酒分离株的14.1%，鼠伴菌属有1种6 株，式获得在有氧条件下较难培养的梭菌属微生物，也可占酒酪分离株的9.4%。酒酪样品中4株乳杆菌属以在厌氧环境中分离得到部分需氧或兼性厌氧的芽分离株分属于4个种，在种类和数量上较其他非优势胞杆菌属微生物。但不同种类培养基对微生物分离分离菌种微生物均呈现出一定的多样性。其他14个筛选能力仍存在一定差异：泪珠状产孢菌属在除属的可培养微生物分离株在种和株的数量上相差不2023 年第 49 卷第17 期(总第 48 5 期）8 7食品与发酵工业FOODANDFERMENTATIONINDUSTRIES大，同时酒样品分离得到1株芽胞杆菌属疑似新种、1株类芽胞杆菌属疑似新种和2 株互营球菌属疑似新种。比较不同分离生境获得的可培养细菌种类和丰度,可以发现在窖泥和酒样品中分离到的细菌种属类型及数量均有较高的相似性，且2 种样品获得的分离株中芽胞杆菌属和梭菌属均有较高丰度,表明在2个采样位置的微生物数量及优势菌种差异较小，与前人研究结果一致，即在白酒酿造过程中窖泥和酒2个发酵体系之间可以通过黄水实现微生物代谢产物和不同菌种的传递和迁移,2 个发酵体系中的微生物在酒体风味成分的形成过程中存在一定的协同效应6-7 2 0 。其中,分离得到的梭菌属菌种种类最为丰富，主要包括酪丁酸梭菌（Clostridiumtyrobutyricum）、科氏梭菌（Clostridiumkluyveri）、丁酸梭菌（Clostridiumbutyricum）、永达尔氏梭菌（Clostridiumljungdahli）、柔嫩梭菌（Clostridiumleptum）和酒梭菌（Clostridiumliquoris）等。梭菌属菌种是窖泥中优势微生物，通常能够利用底物等有机物代谢产生已酸、丁酸、乙酸等重要风味香味物质。分离得到的芽胞杆属菌种种类也较为丰富，主要包括地衣芽胞杆菌（Bacillus licheni-formis）、副地衣芽胞杆菌（Bacillusparalicheniformis）、贝莱斯芽胞杆菌（Bacillus velezensis）、卡夫里亚莱斯氏芽胞杆菌（Bacillus cabrialesi）、暹罗芽胞杆菌（Ba-cillus siamensis）、白色芽胞杆菌（Bacillus albus）和沙福芽胞杆菌（Bacillus safensis）等。芽胞杆菌具有发达的水解酶系统，在白酒酿造过程中能够充分利用底物,产生吡嗪类、丁二醇、3-羟基-2-丁酮、有机酸等白酒中重要的香味成分。此外，梭菌属和芽胞杆菌属菌种的代谢产物还能促进窖泥中微生物的相互作用，调节窖泥中微生物群落结构,进而影响浓香型白酒的香气成分。但窖泥和酒醋2 种样品的分离株在种属水平上还是有一定差异：棒杆菌属、肠球菌属和嗜蛋白菌属3个属的微生物仅在窖泥样品中分离获得；而不动杆菌属、埃希氏菌属、类芽胞杆菌属、丙酸杆菌属、互营球菌属和魏斯氏菌属则仅在酒样品中分离到。侧面证实了窖池中2 种发酵体系通过物质交换和微生物转移共同决定和影响着浓香型白酒典型风味物质的形成，以及酒体品质的改善提升。综合来看,芽胞杆菌属为浓香型白酒窖池中分离数量最多的微生物种类，包含8 种40 株，约占总分离菌株数的32%；梭菌属包含9 种19 株，约占总分离株的15%；泪珠状产孢菌属共有4种12 株，约占总882023 Vol.49 No.17(Total 485)数的10%。对于文献报道较多的乳杆菌属、鼠伴菌属、魏茨曼氏菌属、氨基酸杆状菌属及魏斯氏菌属等在浓香型白酒酿造过程中对白酒中特定风味物质的形成、维持窖泥微生物结构稳定等方面发挥重要作用的微生物菌属也获得了一定数量的分离株。如乳杆菌属分离到4种共6 株，鼠伴菌属和魏茨曼氏菌属分别有11株和7 株。此外,在除TSA和MRS培养基外的其余5种培养基中,共有9 株分离株16 SrDNA测序结果显示与已知分类学地位模式菌株的16 SrDNA序列相似性均低于98.6 5%32 ,为潜在疑似新种，后续需进一步通过全基因组测序等分子生物学鉴定技术确定其分类学地位。2.4特征菌种鉴定及生物学特性分析浓香型白酒酿造体系中微生物的种类、数量、种群间的相互作用以及代谢的