浓香型白酒窖池中可培养细菌多样性研究.pdf
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1、浓香型白酒窖池中可培养细菌多样性研究食品与发酵工业FOODANDFERMENTATIONINDUSTRIESD0I:10.13995/ki.11-1802/ts.035105引用格式:刘瑞娜,奚文韬,赵东,等.浓香型白酒窖池中可培养细菌多样性研究J.食品与发酵工业,2 0 2 3,49(17):8 2-9 3.LIURuina,XI Wentao,ZHAO Dong,et al.Diversity of cultivable bacteria in cellars of strong-flavor BaijiuJJ.Food and Fermen-tation Industries,2023,
2、49(17):82-93.刘瑞娜”,奚文韬,赵东”,张天圆,郑佳”,张京涛,姚栗*,翟磊1*1(中国食品发酵工业研究院有限公司,中国工业微生物菌种保藏管理中心,北京,10 0 0 15)2(宜宾五粮液股份有限公司,四川宜宾,6 440 0 0)摘要利用可培养组技术,通过设计和优化筛选培养基,结合基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(matrix-as-sisted laser desorption/ionization time of flight mass spectrometry,M A L D I-T O FM S)和16 SrDNA基因鉴定技术,大规模筛选鉴定浓香型白酒窖池中可培养细菌,重
3、点突破厌氧菌的分离培养。研究结果表明,采用5种特定的厌氧培养基和2 种好氧培养基,从浓香型白酒窖池中共分离得到了来自2 1个属44个种的12 4株细菌,包括9 株潜在细菌新种。其中,厌氧条件分离得到10 0 株,好氧条件分离得到2 4株;窖泥样品分离得到6 0 株,酒样品分离得到6 4株。芽胞杆菌属(Bacillus sp.)和梭菌属(Clostridiumsp.)是窖池样品中分离的优势菌种。根据不同分离筛选条件和分离生境的可培养细菌种类和丰度,确定了6 株浓香型白酒窖池特征菌,并解析了特征菌的生物学特性。该研究为浓香型白酒窖池中潜在新种的挖掘,特征性菌种资源的定向筛选、互作机制解析、功能性研
4、究开发及产业化应用奠定了基础。关键词浓香型白酒;窖泥;酒;可培养细菌白酒在中国有着悠久的酿造和饮用历史,是中国各种传统酒类(除果酒、米酒外)的统称。19 7 9 年全国第三届评酒大会根据不同酿造工艺、制曲方式和风味特征等首次正式提出并确立了浓香型、清香型、酱香型、米香型和其他香型5种白酒香型1-2 。目前市场上的白酒香型主要是以4种基础香型为主的12 种香型,其中作为行业占比第一大香型的浓香型白酒因其“窖香浓郁、绵柔甘、香味协调、尾净余长”的风味特点被誉为“中国白酒典范”2-4。2 0 2 1年浓香型白酒最新标准GB/T10781.12021白酒质量要求第1部分:浓香型白酒正式发布,对浓香型白
5、酒给出明确定义:以粮谷为原料,采用浓香大曲为糖化发酵剂,经泥窖固态发酵,固态蒸馏、陈酿、勾调而成的,不直接或间接添加食用酒精及非自身发酵产生的呈色呈香呈味物质的白酒。浓香型白酒采用泥窖作为发酵载体,已有研究表明在“泥窖生香”的微生态机制中主要包含2 个发酵体系:酒发酵体系和窖泥发酵体系。2 个优势菌群全然不同的体系中,微生物在发酵过程中发生了菌群的迁移富集和代谢产物的传递交换,共同影响着浓香型白酒典型“窖香”的形成。老窖出好酒,在连续不断的生产过程中,窖泥中的营第一作者:硕士,工程师(姚粟正高级工程师和翟磊正高级工程师为共同通信作者,E-mail:y a o s u c h i n a-c i
6、 c c.o r g;z h a i l e i c h i n a-c i c c.o r g)基金项目:中国轻工业浓香型白酒固态发酵重点实验室开放基金项目(2 0 2 1JJ008)收稿日期:2 0 2 3-0 2-12,改回日期:2 0 2 3-0 3-16822023 Vol.49 No.17(Total 485)养成分和特征特性不断发生变化,微生物的群落结构不断的进行演替,形成了适合于白酒酿造的特有的微生物群落,并最终决定了浓香型白酒的品质5-8 。目前对浓香型白酒酿造过程中窖池微生物体系与其酒体品质及风味特征相关机理的研究有了一定的进展,但三者之间的互作机制和内在关联仍未完全解析。
7、浓香型白酒窖池中微生物群落结构的解析以及特征微生物资源的发掘对揭示白酒酿造风味机理、提升白酒品质、加强质量管理具有重要意义。目前白酒窖池中微生物群落结构研究主要采用聚合酶链式反应变性梯度凝胶电泳(PCR-denatured gradient gelelectrophoresis,PCR-DCCE)9 、聚合酶链式反应单链构象多态性分析(PCR-single strand conformation poly-morphism,PCR-SSCP)10)、实时荧光定量PCR(quanti-tative real-timePCR,qPCR)、宏基因组学和宏转录组学12-14 及高通量测序5.15 等非
8、培养技术,该类技术可以获得窖泥微生物菌群的定性及相对定量信息16 ,但对其中功能微生物的筛选与作用机制解析仍需获得微生物纯培养物。可培养组学(cul-turomics)是综合利用多种培养条件进行微生物菌种的分离培养,并通过基质辅助激光解吸电离飞行时间研究报告质谱(matrix-assisted laser desorption/ionization time of菌培养基、苛养厌氧菌琼脂培养基、改良PYG培养基flight mass spectrometry,MALDI-TOF MS)和 16 S rDNA和蛋白瘤胃球菌培养基作为厌氧微生物分离培养基,基因测序技术对分离菌种进行大规模鉴定,尽可
9、能多分别用于片球菌属/乳杆菌属、梭菌属、苟养厌氧菌、地获得在常规培养条件下不可培养微生物的一种技喜热菌属/普雷沃氏菌属和瘤胃球菌属等厌氧或兼性术17-18 。本研究依据浓香型白酒窖池中微生物群落厌氧微生物的选择性分离。7 种培养基的配方如下,结构特征,设计和优化了7 种筛选培养基,开展了窖灭菌条件均为12 1、15min。池中功能微生物,尤其是难培养厌氧微生物资源的发TSA培养基(g/L):胰蛋白陈15.0,大豆蛋白陈掘。根据不同分离筛选条件和分离生境的可培养细5.0,NaCl5.0,琼脂15.0。菌种类和丰度,确定了浓香型白酒窖池特征菌,并解R2A琼脂培养基(g/L):蛋白陈0.5,酵母粉析
10、特征菌的生物学特性。0.5,酪蛋白陈0.5,葡萄糖0.5,可溶性淀粉0.5,1材料与方法K,HP040.3,丙酮酸钠0.3,MgS040.024,琼脂15.0加热溶解。1.1实实验材料1.1.1仪器与试剂HG-50高压灭菌锅,日本平山制作所株式会社;移液器(10 0 L、1m L、5m L),德国Eppendorf公司;AC2-4S1生物安全柜,新加坡艺思高科技有限公司;DG-250厌氧工作站,英国DonWhitleyScientific公司;DLQ120-B智能厌氧制备仪,北京爱思普科技有限公司;BHG-8082型恒温培养箱,上海一恒科学仪器有限公司;LX-165T2R医用离心机,青岛海特生
11、物医疗有限公司;MALDI-TOFMS基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱仪,德国BrukerDaltonikGmbH公司;全自动革兰氏染色仪,青岛澜澈生物科技有限公司;厌氧盒,日本三菱化学公司;ECLIPSE80i光学显微镜,尼康仪器(上海)有限公司。0.85%生理盐水,北京君立康科技发展有限责任公司;厌氧产气袋,日本三菱化学公司;细菌基因组DNA提取试剂盒、dNTPs、T a q D NA 聚合酶、DNAMarker,天根生化科技(北京)有限公司;溶菌酶、琼脂糖,北京全式金生物技术有限公司;其他试剂均为国产或进口分析纯。1.1.2培养基的选择和制备通过对浓香型白酒窖池中微生物群落结构和窖池中特
12、征菌种生理代谢特征研究相关文献的调研5.19-2 0),参考 KOMODO(Known Media Database)网站(http:/k o m o d o.m o d e l s e e d.o r g/)中对不同种属厌氧微生物培养基配制的建议要求2 1,最终选择了7种培养基进行浓香型白酒窖池中可培养细菌的分离培养研究。TSA培养基和R2A琼脂培养基作为好氧微生物分离培养基,其中TSA培养基主要用于分离常见好氧菌和不动杆菌属;R2A琼脂培养基则用于分离苛养好氧菌。改良MRS琼脂培养基、强化梭改良MRS琼脂培养基(g/L):蛋白陈10.0,牛肉膏10.0,酵母粉5.0,葡萄糖2 0.0,柠檬
13、酸铵2.0,吐温8 0 1.0 mL,半胱氨酸盐酸盐0.5,CH,CO0Na5.0,K,HP042.0,MgS047H,0 0.1,MnS040.05,琼脂15.0。强化梭菌培养基(g/L):胰蛋白陈10.0,牛肉膏10.0,酵母粉3.0,葡萄糖5.0,NaCl5.0,可溶性淀粉1.0,CH,CO0Na5.0,半胱氨酸盐酸盐0.5,琼脂15.0。苟养厌氧菌琼脂培养基(g/L):混合蛋白陈23.0,NaCl5.0,可溶性淀粉1.0,葡萄糖1.0,C,H,Na0,1.0,L-精氨酸1.0,琥珀酸钠0.5,半胱氨酸盐酸盐0.5,NaHCO,0.4,可溶性焦磷酸0.2 5,氯化血红素0.0 1,维生素
14、K0.001,琼脂15.0。改良PYG培养基(g/L):胰蛋白陈5.0,蛋白陈5.0,酵母粉10.0,牛肉膏5.0,葡萄糖5.0,K,HP042.0,吐 温-8 0 1.0 mL,Na H C O,0.4,Na C l 0.0 8,KH,P04 0.04,MgS047H,0 0.02,CaCl,2H,0 0.01,刃天青1.0 mg/L。加热煮沸3 5min,冷却后添加氯化血红素5mg/L、维生素K,1mg/L、半胱氨酸盐酸盐0.5g/L和琼脂15.0 g/L,pH7.2。蛋白瘤胃球菌培养基(g/L):胰蛋白陈5.0,酵母粉2.0,葡萄糖3.0,纤维二糖2.0,(NH4)SO 40.8,NaC
15、10.48,KH,PO4 0.24,K,HPO04 0.24,MgSO4 7H,00.1,CaCl,7H,00.064,刃天青1.0 mg/L。加热煮沸35min,冷却后添加Na,CO,4.0 g/L、脂肪酸溶液1mL/L、半胱氨酸盐酸盐0.5g/L和琼脂15.0 g/L,pH 7.0。1.1.3样品采集样品采集自四川省宜宾市某浓香型白酒生产企2023 年第 49 卷第17 期(总第 48 5 期)8 3食品与发酵工业FOODANDFERMENTATIONINDUSTRIES业3个车间的窖池,3个窖池的窖龄分别为30 年、20年和15年,样品来源包括窖泥和酒酷。窖泥样品分别从距地面约0.3、1
16、、2 m的窖池四壁和底部采集,3个窖池的窖泥样品混匀作为窖泥待检样品;酒样品采用五点取样法,从四周和中间采集,3个窖池的酒酷样品混匀作为酒酷待检样品。窖泥和酒样品均从出池当天(2 0 2 2 年1月13日)的一批窖池中采好氧培养稀释涂布窖泥稀释酒酷样品稀释液样获得,采集后的样品密封,-2 0 保存备用。1.2实验方法设计7 种不同筛选分离培养基,采用好氧和厌氧的培养方式,结合MALDI-TOFMS和16 SrDNA基因测序技术对浓香型白酒窖泥和酒样品中的细菌进行大规模分离筛选和鉴定,本实验建立的白酒窖池中可培养细菌多样性研究的技术路线如图1所示。好氧分离培养涂布厌氧盒分离培养厌氧培养滚管分离培
17、养MALDI-TOFMS保藏16S rRNA基因鉴定纯化鉴定图1浓香型白酒窖池中可培养细菌多样性研究技术路线Fig.1 Technical route of culturable bacteria diversity research in strong-flavor Baijiu cellars1.2.1好氧微生物的分离纯化在生物安全柜中分别称取2 5g窖泥待检样品和酒待检样品于2 2 5mL无菌生理盐水中,充分混匀制备成1:10 样品稀释液,吸取1mL稀释液加入9mL无菌生理盐水,充分混匀制备成1:10 0 样品稀释液,重复上述操作对样品进行梯度稀释,取2 3个合适浓度的稀释液分别涂布于T
18、SA培养基和R2A琼脂培养基平板上,37 培养3d。从2 种培养基平板上选取菌落形态不同的单菌落,在对应的培养基平板上四区划线分纯,37 培养3d。重复上述操作对分离菌株进行纯化,根据菌落形态和革兰氏染色镜检确认,将纯化后的分离菌株编号并转移至含15%无菌甘油的甘油管中,-8 0 冰箱保藏备用。1.2.2厌氧微生物的分离纯化为最大限度地分离获得浓香型白酒窖池中不同生长特性的厌氧微生物,对厌氧菌的分离采用2 种方法:平板涂布法和滚管法。平板涂布法:试验前一天将无菌生理盐水、5种厌氧微生物分离培养基放置于厌氧工作站中过夜置换除氧,刃天青作为指示剂确认氧气除净。试验当天,在厌氧操作台分别称取2 5g
19、窖泥待检样品和酒842023 Vol.49 No.17(Total 485)酷待检样品于2 2 5mL无菌生理盐水中,充分混匀制备成1:10 样品稀释液,吸取1mL稀释液加人9 mL无菌生理盐水,充分混匀制备成1:10 0 样品稀释液,重复上述操作对样品进行梯度稀释,取2 3个合适浓度的稀释液分别涂布于5种厌氧培养基平板上,37厌氧培养3d后参考好氧微生物纯化及保藏方法在厌氧操作台中对厌氧分离菌株四区划线分纯和-80冰箱甘油管保藏。滚管法:5种分装到厌氧管中的厌氧微生物分离培养基经智能厌氧制备仪置换除氧后高温灭菌,将灭菌后的液态琼脂培养基厌氧管于50 水浴锅中保温备用。用无菌注射器吸取10 0
20、 L于厌氧工作站中稀释至适宜梯度的样品稀释液加入到厌氧管中,平放至盛有碎冰块的容器中迅速滚动,使带菌培养基在厌氧管内壁形成均匀的薄膜,完全凝固的厌氧管置于厌氧袋中37 厌氧培养3d。在厌氧工作站中用无菌针头挑取厌氧管内壁上菌落形态不同的单菌落,转接至相应的液体培养基厌氧管中37 厌氧培养2 d。将梯度稀释后的厌氧管中的菌液用无菌注射器再次加人到液态琼脂培养基厌氧管中冰浴滚管。重复上述操作对厌氧管分离菌株进行纯化,至观察菌落和菌体研究报告形态均一后编号保藏于-8 0 冰箱备用。双向测序。1.2.3分离菌株MALDI-TOFMS鉴定1.2.5特征菌种系统发育分析采用MALDI-TOFMS鉴定系统对
21、分离菌株进行根据不同分离筛选条件和分离生境的可培养细快速鉴定,以初步确定分离菌株的分类学地位2 。菌种类和丰度,结合文献调研确定6 株浓香型白酒窖该方法主要通过采集微生物稳定表达的核糖体蛋白池潜在特征菌并对特征菌种进行了系统发育分析。指纹图谱,与已知微生物菌种蛋白指纹图谱数据库比将测序得到的各菌株序列整理拼接后提交至Gen-对分析后,得到待测菌株的鉴定结果及置信水平,实Bank,运用Clusta-X软件对序列进行校正2 6 ,通过现微生物菌种的快速鉴定2 3-2 4。本研究使用的NCBI进行BLAST比对后利用MEGA软件中的邻接MALDI-TOFMS鉴定数据库包括10 8 33株菌,其中法(
22、Neighbor-Joining)开展序列同源性分析及系统发革兰氏阴性菌4318 株,革兰氏阳性菌557 2 株,酵母育树的构建,自展值(bootstrapvalue)设置重复取样菌和丝状真菌943株。1 000次。根据GB/T33682一2 0 17 基质辅助激光解析电1.2.6特征菌种形态学特征和生理生化试验离飞行时间质谱鉴别微生物方法通则中甲酸提取将纯化后的6 株浓香型白酒窖池特征菌种代表菌法对分离菌株进行MALDI-TOFMS鉴定:分别挑取株接种于相应分离培养基上,观察不同菌株菌落形态各待测菌株菌落于盛有30 0 L超纯水的1.5mL离特征。同时将分离株菌落通过戊二醛固定、无菌水漂心管
23、中,充分混匀后加人9 0 0 L无水乙醇(色谱洗、乙醇梯度脱水、干燥及离子溅射仪喷金后固定于样纯),旋涡振荡1min离心菌体细胞(130 0 0 r/min,品台上,利用扫描电镜观察菌株菌体微观形态。结合2min)弃去上清液,重复离心操作,用移液器吸净上宏观和微观形态特征参照伯杰氏细菌鉴定手册2 7 ,清液后向沉淀中加入50 L70%的甲酸水溶液,旋涡按照梅里埃API50CHB和API20A鉴定试剂盒说明振荡重悬菌体,再加入50 L乙腈混合均匀,书对分离菌株进行碳源利用等生理生化指标检测。13000r/min离心2 min,吸取1L上清液点样在样品靶板孔中,待室温下晾干后滴加1L-氰基-4-羟
24、基肉桂酸(-cyano-4-hydroxycinnamic acid,HCCA)基质溶液覆盖在每个样本上,室温下自然晾干。将点样完成的靶板放入仪器中,按照仪器操作规程设置参数后采集待测菌株蛋白指纹图谱。采集到的质谱数据导人本地微生物指纹图谱库,在鉴定系统中得到待测菌株的鉴定结果。1.2.4分离菌株DNA提取和16 SrDNA及功能基因测序对于MALDI-TOFMS鉴定未得到结果的菌株,则采用16 S rDNA及功能基因测序技术进行进一步鉴定。按照TIANGEN细菌基因组DNA提取试剂盒说明书的操作步骤提取各分离菌株的基因组DNA,-20保存备用。分离菌株的16 SrDNA测序PCR扩增以2 7
25、 F和1492 R为引物,功能基因gyrB测序PCR扩增以gyrB-F(5-GAAGTCATCATGACCGTTCT-GCAYGCNGGNGGNAARTTYGA-3)和 gyrB-R(5-AG-CAGGATACGGATGTGCGAGCCRTCNACRTCNGCRTC-NGTCAT-3)为上下游引物,反应体系参考文献2 5的方法。PCR完成后对扩增产物进行1.5%琼脂糖凝胶电泳,以检测DNA提取质量。将条带清晰且无杂带的扩增产物送生工生物工程股份有限公司进行2结果与分析2.1浓香型白酒窖池中可培养细菌分离纯化结果经多次划线分纯及菌落菌体形态特征排重后,从浓香型白酒窖池中共分离得到来自2 1个属4
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