棉类纺织品文物霉变菌株的分离与鉴定.pdf

第 卷 第 期 年 月文物保护与考古科学 .收稿日期:修回日期:基金项目:年度开封市哲学社会科学规划调研课题()资助作者简介:曾祥鹤()年毕业于北京服装学院服装设计与工程专业研究方向传统服饰与文物 :.文章编号:():././.棉类纺织品文物霉变菌株的分离与鉴定曾祥鹤(开封大学艺术设计学院河南开封)摘要:纺织品文物霉变研究在纺织品文物保护、修复、贮藏中占重要地位 为了确定馆藏棉类纺织品文物霉变微生物的种类了解棉织物纺织品文物真菌病害特点本研究采用 培养基对棉类纺织品文物上霉变部位提取微生物进行分离纯化对纯化后的霉菌进行 序列分析通过比较 核酸序列数据库序列同源性构建发育树 最终分离纯化共得到 株霉菌测序结果鉴定为青霉属、交链孢霉属、曲霉属、镰刀属该四种霉属可能是棉类纺织类文物的致霉优势霉属 利用形态学方法结合分子生物学手段对棉类纺织品文物霉变微生物进行分离鉴定确保获取结果更加快速和精准结合当前博物馆对纺织品文物的保护现状提出棉类纺织品文物综合保护措施为此类文物的防霉工作以及抗霉材料的开发提供理论依据关键词:纺织品文物菌种分离菌种鉴定 序列中图分类号:文献标识码:引 言纺织品文物作为我国文化遗产的重要组成部分是古代文明的载体之一也是我国文化软实力的重要代表 纺织品文物通常是由蚕丝、棉麻、葛布等天然材料织造而成在掩埋、挖掘以及保存的过程中易受侵蚀细菌、软腐真菌和腐生真菌等微生物的侵蚀和降解 霉菌对纺织品的危害是持久的、多样的霉菌能够将含有碳、硫等营养源的棉、毛和丝纤维分解为养分促进自身快速繁殖和生长同时霉菌分泌有机酸和色素对文物造成酸蚀、颜色污染甚至造成腐烂和降解等危害并且霉菌具有顽强的生命力有的能持续几十年的休眠期 目前留存在世的纺织品文物服饰通常是从棺椁、土壤中发掘有研究表明埋藏于地下的服饰类文物微生物降解主要来自侵蚀细菌和软腐真菌在纺织品文物中至今已发现 余属 多种霉菌 博物馆中常见的霉菌有根霉菌、曲霉菌、球毛壳菌、青霉菌等纺织品文物相较于瓷器文物、木质文物、金属文物等更容易受到腐蚀 陶娅妃对纺织物上霉变微生物进行分离鉴定共得到三种致霉菌分别为曲霉属、青霉属和根霉属 王毅婧对真丝文物上的霉变微生物进行分离鉴定共得到三种致霉菌孢霉属、曲霉属和芽枝霉属 纺织品文物又因其材质、染料、颜料、性质等因素在馆藏过程中易受外界环境影响 因此对纺织品文物上的真菌进行分离鉴定确定致霉优势菌属根据其生长规律和生理生化特性为纺织品文物开发长效防霉技术靶标菌株 对文物保护具有重要意义 目前对纺织品霉变菌株的研究多利用生物技术手段对霉变菌株进行分离纯化、形态学鉴定以及生物学鉴定从而确定致霉优势菌属为文物的清洗、修复、保存奠定理论基础 本研究从已发生霉变的棉类纺织品文物上的酶菌斑块提取霉菌利用 培养基分离纯化得到了单一的菌株再采用显微形态学观察与 序列分析相结合的方法对霉变微生物进行鉴定 确定致霉优势菌属为纺织品文物的博物馆防霉保护工作以及抗霉材料的开发提供理论依据 样品和方法.材料与仪器.霉变织物本次实验所采集的霉菌来自河南省开封市汴绣私人博物馆中一件表面明显发生霉变的棉织物文物(图)据记载该文物属于晚清年 文物保护与考古科学第 卷间文物常年保存在室内温度 相对湿度 之间的环境中 通过对织造组织以及毛边显微镜观察分析可知该文物是棉织物 霉菌附着在纺织品文物表面成散落状服装对襟领口处霉斑较为明显暂无侵蚀织物内部结构迹象图 霉变纺织品文物.试剂 培养基:马铃薯切块 煮沸 过滤滤液加入葡萄糖 琼脂 蒸馏水定容至 液体培养基与固体培养基成分和配制方法相同不加琼脂 以上培养基经过高压灭菌后使用 引物采用真菌通用引物(表)由上海生物工程有限公司合成 试剂盒购自上海生物工程有限公司 购自河南东格生物技术有限公司真菌基因组 提取试剂盒购自北京索莱宝科技有限公司表 引物序列 引物序列 .仪器 超净工作台:苏州苏洁净化设备股份有限公司振荡培养箱:上海智诚科学仪器公司可见分光光度计:海精密科学仪器有限公司灭菌锅:上海申安医疗器械厂显微镜:凝胶成像系统:东胜有限公司.方法.霉变菌株采集、分离、纯化用无菌棉签轻轻擦拭汴绣文物表面霉斑部位轻轻涂在 培养基平板中于 培养箱中恒温培养 形成菌落 挑选菌落在新的 培养基平板中划线继续培养 后选择菌落形态典型、分离效果明显的平板分别挑取单菌落边缘的菌丝转接到新的 培养基平板上继续培养经此方法 次纯化后获得单菌落菌株.形态学鉴定利用无菌接种环挑取少量纯化后的菌落菌丝在 培养基平板中间点植接种 于 霉菌培养箱中恒温培养 形成菌落观察菌落的生长情况和形态特征并拍照按照真菌鉴定手册 对分离得到的霉菌进行初步鉴定 利用乳酸石炭酸染料对菌丝进行染色观察显微结构并拍照.霉菌 提取 取纯化过的菌落或菌丝接种于 液体培养基中于 条件下于摇床震荡培养 收集 菌液离心弃上清 根据试剂盒说明书对霉菌 进行提取.分子生物学鉴定 扩增真菌 序列使用通用引物 和 反应体系以及条件如表 所示 产物进行 的琼脂糖凝胶检测观察条带形状 同时委托上海生工公司对其进行序列测定 将测序结果提交至 核酸序列数据库中进行 分析对比使用 软件构建系统发育树表 反应体系以及反应条件 反应体系物理量/反应条件 ()()个循环模板(/)合计 保存 结果和讨论.分离纯化结果通过分离纯化获得 株霉菌 依次编号为、(图).形态观察结果菌株:生长速度缓慢 培养 菌落直径约 菌落呈绒毛状初期呈白色后变为绿褐色但边缘呈白色 培养基中未见菌丝但在液体 培养基中有菌丝且呈白色 反面观呈淡黄色 显微结果发现菌丝较长分生孢子梗在顶端分枝产生小梗如帚状偶有单论生或不规则者孢子多数呈双胞呈球形或卵圆形壁光滑分生孢子第 期曾祥鹤:棉类纺织品文物霉变菌株的分离与鉴定 链疏松不规则菌株:生长速度比较缓慢 培养 菌落直径约 菌落初期呈白色后期呈绿色边缘为白色未见菌丝 反面观呈淡黄色 显微结果发现菌丝细长菌丝上有较多散落的孢子大多数为单孢且易脱落有些孢子聚团形成孢囊呈圆盘状 分子孢子梗发生于基质梗基紧凑瓶梗呈柱状菌株:生长速度较快 培养 菌落直径约 菌落呈绒毛状初期呈白色后期变为墨绿色中央凹陷颜色较深反面观中央呈墨绿色边缘呈白色 显微结构发现菌丝细长上面有较多散落的孢子菌丝不易被乳酸石炭酸棉蓝色染液染色呈淡黄色孢梗茎呈褐色表面光滑分生孢子呈圆形或椭圆形灰褐色图 霉菌菌落形态与显微形态().()菌株:生长速度适中 培养 菌落直径达 菌落呈菊花心样结构中央呈绿色边缘呈白色带有放射性沟纹 初期为黄色中期变为黄绿色最后颜色变淡反面观呈淡黄色 显微结构发现菌丝较短分生孢子梗无横隔梗的定端形成球状膨胀形成顶囊上面附着许多分生孢子菌株:生长速度较快 培养 菌落直径约 菌丝体较长、呈白色绒状、纤细、具隔膜中央凸起呈辐射状向周围生长 背面观中央呈红色其余为白色 显微结构发现菌丝分叉较多孢子较小呈纺锤形附着在菌丝上菌核形状多为球形单生或丛生菌株:生长速度较快 培养 菌落直径约 菌落呈绒毛状菌丝较长呈灰白色中央凸菌丝较少呈墨绿色反面观呈墨绿色边缘呈白色 显微结构发现菌丝细长成簇孢子梗较短单生或丛生大多不分枝分生孢子较长呈淡褐色附着在菌丝上呈纺锤状或倒棒状顶端呈喙状成链生长.分子生物学鉴定结果.的琼脂糖凝胶检测 按照试剂盒说明书提取菌株基因组 按照上述条件对 基因片段进行 扩增 产物经 琼脂糖凝胶电泳进行检测 结果发现 基因片段的 扩增产物在 到 之间有特异性扩增条带大小与预期值相符.测序结果根据生工公司(上海)测序结果将得到的基因序列与 核酸序列数据库中收录的基因序列进行同源性比对选取数据库中得分最高的序列作为参比对象测序比对结果见表 菌株 和菌株 与青霉菌属()霉菌同源性高达但是菌株 和菌株 的 序列有所差异因此猜测菌株 和菌株 为同属不同种初步断定为青霉菌属菌株 和菌株 与交链孢霉属()霉菌同源性分别为 和但是菌株 和菌株 的 序列有所差异因此猜测菌株 和菌株 为同属不同种初步断定为交链孢霉属而菌株 与曲霉属()霉菌同源性高达初步断定为曲霉属菌株 与镰刀菌属()霉菌的同源性高达 初步断定为镰刀菌属在.中构建 种霉菌 序列的统进化树 系统进化树的自展值均超过 表明构建的系统进化树可信 根据系统发育树分析结 文物保护与考古科学第 卷果菌株 和菌株 与草酸青霉在一个分支均为青霉属菌株 与链格孢霉在一个分支均为交链孢霉属菌株 与米曲菌在一个分支为曲霉属菌株 与赤霉菌在一个分支为镰刀菌属菌株 与交链孢霉在一个分支为交链孢霉属 通过以上分析得出菌株 和菌株 为青霉属菌株 和菌株 为交链孢霉属而菌株 为曲霉属菌株 为镰刀属但以上 种菌株无法确定到种表 霉变微生物的 序列分析 编号属同源性最高的菌种同源性青霉属 (.)青霉属 (.)交链孢霉属 (.)曲霉属 (.)镰刀属 (.)交链孢霉属.(.).讨论针对本研究鉴定出的霉菌种类与其生存特征对后期博物馆贮藏棉类纺织品文物提出以下建议:博物馆在保存纺织品文物时应注意环境卫生可选用防霉建筑材料做到空气净化文物入库与出库均需要经过消毒处理库房还可通过熏蒸的方式进行环境消毒微生物适宜生存的温度为 相对湿度为 因此博物馆可通过控制环境温度、湿度降低霉菌活性博物馆还可通过放置霉敌、灭霉净、邻位苯基苯酚钠等防霉剂抑制霉菌的生命活动目前国内多家单位均进行了博物馆防霉、杀虫等技术研究通过抑菌实验测量各类试剂抑菌程度 然而各类防霉剂是否对纺织品文物直接或间接产生损害还需进一步的研究单纯的抑菌实验只能判断药剂是否抑菌却不一定能应用于实际当中如植物提取精油虽能有效抑菌但会影响纺织品面料表面色泽给文物保护带来不可逆转的损害 肖雨嫣等对霉变棉织物上的霉菌进行了抑菌实验采用山梨酸钾、硫酸锌和苯甲酸钠作为抑菌剂虽证明此类试剂对霉菌的抑制作用但无法排除此类试剂对棉类纺织品文物的伤害因此纺织品文物抑菌实验的实现与突破需要生物技术手段、文物复制技术等多方面努力 根据不同菌属的生长习性和纺织品文物特性有针对性地开发防霉剂以及选择合适的储存条件对纺织类文物的保护具有重要意义 结 论本研究选取已产生霉变的棉类纺织品文物衣襟上的霉株利用 培养基分离纯化共得到 种不同形态的霉菌 通过对 种霉菌基因组 的 区扩增测序同时与 核酸数据库中已知菌种序列对比以及构建系统发育树鉴定结果显示 种为青霉属、种为交链孢霉属、种为曲霉属、种为镰刀属但无法鉴定到种 通过上述实验发现该件棉类纺织品文物霉变菌属分别为青霉菌属、交链孢霉属、曲霉属、镰刀属霉菌的产生原因暂时不明人体皮脂污染、穿着污染、保存环境等均会对文物的侵蚀产生一定的影响参考文献:黄建利.古代纺织品文物修复技术及实践研究.化纤与纺织技术():.():.郝俊琦.前期准备在纺织品文物保护修复中的影响分析.文物鉴定与鉴赏():.():.路智勇惠任.纺织品文物霉害预防性控制.四川文物():.():.中国纺织品鉴定保护中心.纺织品鉴定保护概论.北京:文物出版社.:.田双娥.三种植物精油对博物馆空气霉菌的抑菌活性研究.文物保护与考古科学():.第 期曾祥鹤:棉类纺织品文物霉变菌株的分离与鉴定 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