柯乐猪和大白猪胎盘发育与繁殖性能的相关性分析.pdf

-10.Husbandry&Veterinary Medicine,2023,55(6)HU G L,SHEN T,WU Z M,et al.Correlation anafplacentaldevelopmentandperformance in Kele pigs and Yorkshire pigsJ.Animal10.胡光玲，申涛，伍治敏，等.柯乐猪和大白猪胎盘发育与繁殖性能的相关性分析J畜牧与兽医，2 0 2 3，55（6）：2023年第55卷畜牧与兽医第6 期柯乐猪和大白猪胎盘发育与繁殖性能的相关性分析胡光玲1.2.3，申涛1.2 3，伍治敏1-2.3，谭元成1.2.3，张依裕1.2.3，数政1.2.3*（1.贵州大学高原山地动物遗传育种与繁殖教育部重点实验室，贵州贵阳550 0 2 5；2.贵州省动物遗传育种与繁殖重点实验室，贵州贵阳550 0 2 5；3.贵州大学动物科学学院，贵州贵阳550 0 2 5）摘要：旨在探讨柯乐猪与大白猪胎盘组织形态及营养转运、血管生成、抗氧化应激和细胞亡与其繁殖性能差异的相关性。比较大白猪与柯乐猪窝均产仔数、产活仔率、初生重、胎盘绒毛数量、血管数量，以及胎盘营养转运、血管生成、抗氧化应激、细胞调亡相关基因的mRNA表达水平。结果显示：柯乐猪的窝均产仔数、产活仔率和平均初生重均显著低于大白猪（P0.05）；通过组织形态学分析发现，柯乐猪胎盘相较于大白猪表现为绒毛数量不足和发育不良；实时荧光定量PCR显示，柯乐猪胎盘中葡萄糖转运基因溶质载体家族2 成员1（SLC2A1）和氨基酸转运基因溶质载体家族38 成员10（SLC38A10），抗氧化应激相关基因铜锌超氧化物歧化酶（CuZn-SOD）、锰超氧化物歧化酶（Mn-SOD）和过氧化氢酶（CAT），抗细胞凋亡基因B淋巴细胞瘤-2 基因（BCL-2）的转录水平显著低于大白猪胎盘（P0.05），而脂肪酸转运蛋白4（FATP4）的转录水平显著高于大白猪胎盘（P0.05）；柯乐猪胎盘中超氧化物歧化酶（SOD）、CA T 酶活性显著低于大白猪胎盘（P0.05），而活性氧（ROS）自由基水平显著高于大白猪胎盘（P0.05）；通过TUNEL分析显示，柯乐猪胎盘组织的细胞调亡水平极显著高于大白猪胎盘（P0.01）。结论：胎盘组织形态发育不良以及营养转运、抗氧化、抗调亡能力不足可能是造成柯乐猪胎儿数量少和初生重低的重要原因，这可为探究柯乐猪繁殖性能的调控机制提供重要依据关键词：柯乐猪；初生重；胎盘；营养转运；抗氧化应激中图分类号：S814.4文献标志码：A文章编号：0 52 9-5130(2 0 2 3)0 6-0 0 0 1-10Correlation analysis of placental development and reproductive performancein Kele pigs and Yorkshire pigsHU Guanglig,SHEN Tao,U Zhimin2,AN Yuancheng,HANG Yiy-,O Zheng1,2.3*(1.Key Laboratory of Animal Genetics,Breeding and Reproduction in the Plateau Mountainous Region,Ministry of Education,Guizhou University,Guiyang 550025,China;2.Guizhou Province Key Laboratory of Animal Genetics,Breeding and Reproduction,Guizhou University,Guiyang 550025,China;3.College of Animal Science,Guizhou University,Guiyang 550025,China)Abstract:This study was to investigate the correlation of differences in placental morphologies,nutrient transport,angiogenesis,antioxi-dant stress and apoptosis with reproductive performances in Kele pigs and Yorkshire pigs.The average litter size,live birth rate,birth weightand number of placental villi,number of blood vessels,placental nutrition transport,angiogenesis,antioxidant stress and apoptosis-relatedgenes mRNA expression levels were compared between Yorkshire pigs and Kele pigs.We found that the average litter size,live birth rate andbirth weight of Kele pigs were significantly lower than those of Yorkshire pigs(P0.05).Histomorphological analysis revealed that the pla-centa of the Collembola pigs had an insufficient number of villi and poorly developed villi as compared to that of the white pigs.Real-timequantitative PCR results showed that the transcription levels of the glucose transporter solute carrier family 2 member 1 Gene(SLC2A1)and收稿日期：2 0 2 2-0 7-2 1；修回日期：2 0 2 3-0 3-2 1基金项目：促进与加拿大、澳大利亚、新西兰及拉美地区科研合作与高层次人才培养项目（留金美【2 0 2 110 9号）；贵州省优秀青年科技人才培养计划（黔科合平台人才【2 0 2 1】56 30 号）；贵州省普通高等学校青年科技人才成长项目（黔教合KY字【2 0 2 1】0 8 1号）；贵州省2 0 2 2年财政第二批种业发展项目（黔农计财【2 0 2 2 】10 号）第一作者：胡光玲，女，硕士研究生*通信作者：敖政，讲师，主要从事猪遗传育种与繁殖研究，E-mail：z a o g z u.e d u.c n。No.6Vol.552023Animal Husbandry&Veterinary Medicinethe amino acid transporter solute carrier family 38 member 10 Gene(SLC38A10),the antioxidant stress-related genes cytoplasmic copper/zinc superoxide dismutase(CuZn-SOD),the manganese superoxide dismutase(Mn-SOD)and catalase(CAT)and anti-apoptotic geneB-cell lymphoma-2(BCL-2)in the placenta of the Kele pigs were significantly lower(P0.05),but the transcription level of the fattyacid transporter gene fatty acid transport protein 4(FATP4)were significantly higher than those in the placenta of the Yorkshire pigs(P0.05).Furthermore,the enzyme activities of superoxide dismutase(SOD)and CAT in the placentas of the Kele pigs were significantly lower(P0.05)and the level of the reactive oxygen species(ROS)was significantly higher than that of the Yorkshire pigs(P0.05).TheTUNEL analysis showed that the level of apoptosis in the placentas of the Kele pigs was significantly higher than that of the Yorkshire pigs(P0.01).Poor morphological development,defects in placental nutrient transport,antioxidant and anti-apoptotic abilities might be the im-portant reasons for the low number of fetus and birth weight of the Kele pigs,which provided important basis for exploring the regulationmechanism of reproductive performance of Kele pigs.Keywords:Kele pigs;birth weight;placenta;nutrient transport;antioxidant stress柯乐猪是我国优良地方猪种之一，是乌金猪系列的一个品种，属于西南高原放牧型猪种，具有抗寒、耐粗饲、抗逆性强、肉质优良、后腿发达等特征，是制作火腿的优质原料，主产地为贵州省威宁县和赫章县。然而，柯乐猪的繁殖性能较差，严重制约了柯乐猪的开发利用。柯乐猪的乳头数多在6 对左右1，经产母猪的窝均产活仔数为6 8 头2-3。前期研究发现，胎次和季节是影响柯乐猪繁殖性能的重要因素，柯乐猪产仔性能的最佳胎次为第3胎，夏季的窝产活仔数和窝断奶仔猪数均显著低于其他季节3。Liu等2 发现柯乐猪卵泡刺激素亚基（folliclestimulating hormone-subunit，FSH-）基因第一内含子内存在多态性可能与其繁殖性能有关。柯乐猪乳头数性状的全基因组关联分析显示候选基因含有E3泛素蛋白连接酶的-转导蛋白重复序列（BTRC）、成纤维生长因子5（fibroblastgrowthfactor5，FCF5）、成纤维生长因子8（FGF8）、骨形态发生蛋白基因（b o n e mo r p h o g e n e t i c p r o t e i n s 3,BM P3）、Ra s G EF域家族成员1B（RA SCEF1B）、高迁移率族蛋白-B1（H M CB3），可能影响猪的乳头数或繁殖性状)。然而，影响柯乐猪繁殖性能的潜在调控机制仍然不清晰。胎盘是母体与胎儿进行物质交换和信号传导的重要纽带，对宫内胎儿的生长发育发挥着重要调控作用。大量研究证据表明在胚胎附植和胎儿快速生长阶段，胎盘形态异常和胎盘功能障碍是造成宫内胎儿发育不良的主要原因之一4。随着胚外滋养层细胞的快速增殖，滋养层细胞以类似“手套”的方式嵌人到子宫内膜的基质内而形成胎盘褶皱，进一步加大胎盘与子宫内膜的接触面积，胎盘绒毛深人并连通子宫内膜的毛细血管，建立母-胎血液循环，负责母胎的营养物质交换5-6 。因此，胎盘的形态发育和转运功能都可能是造成母猪繁殖性能差异的关键因素。前期研究发现，妊娠后期梅山猪的胎盘褶皱宽度小于大白猪，但是其滋养层细胞的增殖能力更强7 胎盘的主要功能之一是通过被动扩散、主动转运、胞饮等方式为胎儿转运营养物质和氧气。在胎盘中，氨基酸、葡萄糖、脂肪酸等营养物质转运需要溶质载体（solute carrier，SL C）的参与，这些溶质载体的表达与胎儿的生长发育密切相关。绵羊和大鼠的相关研究发现，下调胎盘葡萄糖转运基因溶质载体家族2成员3（SLC2A3）表达水平与胎儿体重降低有关8-9。血管生成和形成也会影响到胎盘的转运效率，血管内皮生长因子（vascular endothelialgrowthfactor，VECF）及其受体（VEGFR）是调控血管生成的主要基因，胎盘VEGF-A和VECFR表达失调被发现参与多种妊娠并发症的发生和发展10-1。此外，在胎盘生长发育过程中不可避免地受到氧化应激和细胞凋亡的影响。在临床研究中发现，先兆子痫、宫内发育迟缓（intrauterine growth retardation，IU G R）等患者胎盘中抗氧化和抗凋亡性能减弱，造成胎盘形态异常和功能障碍，从而诱发胎儿宫内发育不良12 。因此，本研究通过比较柯乐猪与大白猪胎盘组织形态及营养转运、血管生成、抗氧化应激和细胞凋亡基因转录水平差异，分析与其繁殖性能的相关性，为解析柯乐猪母猪繁殖性能的调控机制提供重要依据。1材料与方法1.1主要试剂Omega总RNA提取试剂盒（R6934-02），疏基乙醇（M8210-100），St a r St a i n Re d Pl u s 核酸染料（E110-0 1），琼脂糖（118 6 0），50 TAE缓冲液（T 10 6 0 -50 0），G e n s t a r 的 2 Taq PCR StarMix（A 0 12-10），购自贵州西宝生物有限公司；4%多聚甲醛（G1101-500ML）购自武汉塞维尔生物科技有限公司；反转录试剂盒（TaKaRaPrimeScriptRTreagent Kit with gDNA Eraser,RR047A),DL500 DNAMarker（3590 A），购自宝日医生物技术（北京）有限公司；SYBRSelectMasterMix（447 2 90 8）购自赛默飞世尔科技（中国）有限公司；活性氧（ROS，20233年第55卷畜牧与兽医第6 期E004-1），总超氧化物歧化酶（SOD，A 0 0 1-1），谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px，A 0 0 5-1），过氧化氢酶（CAT)汉测定试剂盒（A007-1），均购自南京建成生物工程研究所；CD31一抗（G5001），荧光二抗，4，6-二基-2-苯基吲哚（DAPI）（G 10 12），抗荧光淬灭封片剂（G1401），T U NEL 试剂盒（G1501），均购自武汉赛维尔生物科技有限公司；荧光定量96孔板(MQ50501S)购自莫纳生物科技有限公司1.2动物与组织样品试验动物为遗传背景清楚、胎次为2 4胎、健康的大白猪和柯乐猪，其体重范围分别为197 228kg和148 16 7 kg，由贵州优农谷生态产业有限公司饲养。妊娠期第90 天根据文献描述的技术方法13，测定母猪P2位点的背骠厚。母猪正常分娩后，根据脐带标记区分每头仔猪的胎盘，采集后立即放入液氮中暂存，后放人-8 0 冰箱保存。此外，采集2 cm2cm的胎盘组织置于4%多聚甲醛中，用于制作石蜡切片观察胎盘组织形态。此外，母猪分娩时记录其产仔数、死胎数、存活仔猪数以及仔猪初生重，计算死胎数和存活仔猪数分别占产仔数的比例得到死胎率和产活仔率。1.3胎盘组织形态观察随机选择6 头柯乐猪和6 头大白猪胎盘组织制作石蜡切片，经HE染色后观察组织形态。胎盘组织的石蜡包埋、切片和HE染色由武汉塞维尔生物科技有限公司完成。利用正置显微镜，每头猪胎盘组织取3个不同的视野，在40 倍和2 0 0 倍视野下观察胎盘整体组织形态、绒毛数量和血管数量1.4免疫荧光检测胎盘组织CD31的表达石蜡切片厚度为4m，石蜡切片脱蜡至水，用EDTA抗原修复缓冲液高温修复抗原，自然冷却后PBS洗涤3次（每次5min）；甩干PBS，滴加BSA封闭30 min；去掉封闭液后在切片上滴加CD31一抗并4孵育过夜；PBS洗涤3次（每次5min），加入二抗，避光室温孵育50 min；PBS洗涤3次（每次5min），滴加DAPI染液，避光室温孵育10 min；PBS洗涤3次（每次5min），加人自发荧光淬灭剂5min，流水冲洗10 min；用抗荧光淬灭封片剂封片，选用SpOrange滤光块类型，置于荧光显微镜下观察并采集图像。采用AIPATHWELL软件自动定位阳性细胞的细胞核并扩展胞质范围，计算阳性细胞面积，累计光密度和组织面积进行计算分析1.5胎盘组织的TUNEL检测利用TUNEL法检测胎盘组织的细胞凋亡情况。将石蜡切片经二甲苯浸泡2 次（5min/次），乙醇（7 0%10 0%）水合，PBS漂洗2 次。参照细胞调亡检测试剂盒说明书操作试验：滴加蛋白酶K工作液覆盖组织，37 孵育2 2 min，PBS洗涤3次（每次5min）；切片稍甩干后滴加破膜工作液并常温孵育20min，PBS洗涤3次（每次5min）；稍甩干后滴加buffer并常温孵育10 min；取适量TDT酶、dUTP、buffer按1：5：50 比例混合并覆盖组织，37 孵育2h；PBS洗涤3次（每次5min），滴加DAPI染液，避光室温孵育10 min；洗涤3次（每次5min），封片，选用SpGreen滤光块类型，镜下观察并拍照。通过计算TUNEL阳性细胞占总细胞数的比例来测定TUNEL调亡指数。TUNEL调亡指数为TUNEL-FITC染色（绿色）与细胞核DAPI染色（蓝色）的比值。每片在10 0 倍视野下随机取5张照片，用ImageJ计算TUNEL阳性细胞占总细胞数的比例，确定TUNEL调亡指数。1.6胎盘总RNA提取及cDNA合成根据Omega总RNA提取试剂盒的说明书提取柯乐猪和大白猪胎盘组织的总RNA，用超微量分光光度计测定RNA的浓度与纯度值后，用TaKaRa反转录试剂盒合成cDNA，去除基因组DNA反应：5gDNA Eraser Buffer 2L,gDNA Eraser 1L总RNA1g，再加ddH,0至10 L，反应条件是42，2min，再转到4；逆转录反应：在去除基因组DNA反应体系中加人1.OLPrimeScriptRTEnzymeMix I,1.0 L RT Primer Mix,4.0 L 5xPrimeScriptBuffer，4.0 LRNase FreeddH,O。反应条件是37，15m i n；8 5，5s；4，10 m i n。反转录产物置于-2 0 保存备用。1.7引物合成及PCR验证通过查阅文献获取猪氨基酸、葡萄糖、脂肪酸转运相关基因，血管生成和氧化应激相关基因的引物序列14-15。根据GenBank中细胞凋亡相关基因的序列，应用PrimerPremier6.0软件设计引物，通过NCBI的PrimerBLAST进行特异性验证后，由北京擎科生物科技有限公司合成，具体引物序列信息见表1。合成的引物通过普通PCR验证其特异性，2 0 LPCR反应体系：2 TaqPCRStarMix10L，上、下游引物(10 mol/L)各 0.4 L,cDNA 1 L,ddH,0 8.2 L。PCR反应程序：94预变性2 min；94变性30 s，60退火30 s，7 2 延伸30 s，共30 个循环；725m in。PC R扩增产物用2.0%琼脂糖凝胶检测。No.6Animal Husbandry&Veterinary MedicineVol.552023表1实时荧光定量PCR引物信息基因名引物序列（5 3)长度/bp基因序列号F:GTCCTGGTGATGGACGAACTGGFATP1180XM_021076151R:GCCTGCTTTGCCCTCTACTCCTF:TATGGTGTGGAGCTGCCAGGAAFATP4198XM_013993903R:CCGCAGGTCTGTCTTCTGTAGCF:CGCAAAGACCTCACCATCAAAFABP5182NM_001039746R:CTTGTGATTGTGCTCTCCTTCCF:AGGACCCTGAGACCCACACACD36116NM_001044622R:TGCCACAGCCAGATTGAGAACAF:TCGTCGTCGGCATCCTCATCSLC2A1178XM_021096908R:CGGTTCTCCTCATTGCGGTTGF:TGGGCATCGTCATCGGGATTCTSLC2A3134XM_021092392R:AAAGGGAAGGGCGGCACACTF:CCTATCGGTCAGTGGCATTGGSLC2A10148XM_005672994R:CGGCAGCAGACGTGGAGATAF:CATCTGTCACGCCTCCTGTCSLC2A12243XM_021087654R:AGACCAGGCTTCCAACTCCAAF:GCTGCGGCGAACAACAAGGASLC2A13167XM_021092534R:AACTGCCCTCCCGTGATGAAGAF:ACCTGAAGGCTCTCGTGGACATSLC7A2223NM_001110420R:AAGAAGGCTCGCAGGCTGAATCF:CAGCAACGCCACCAGGACATSLC7A4137NM_001243816R:CCGATCACCACCCAGAGGAAGAF:GCCATGATCCACGTCAGACACTSLC7A10140XM_003127014R:ACGCCGTAGCAGAGGTAGTTGAF:CATGTTCGTGATCGTGCTCTCCSLC38A10168XM_005668573R:TCGTCCAGGCTGTCGTAGGTF:GCCTTGCTGCTCTACCTCCAVECF-A271NM_214084R:TGCCGATGTTGAACTCCTCAGTF:GAGTGGCTCTGAGGAACGAGVECFR2209BQ603967R:ACACAACTCCATGCTGGTCAF:GAACCCAGCCCTGACAAGATGCCAT229NM_214301R:CCAAGCCCGAATGCGTCTCTTF:GGACAAATCTGAGCCCTAACGMn-SOD159NM_214127.2R:CCTTGTTGAAACCGAGCCF:CTCTCCCGCTGCTTCTGGTACuZn-SOD121NM_001190422.1R:CGAAGTAGATGGTGCCCTGCF:CTGACGGCAACTTCAACTGBAX270XM_013998624R:TCTTCTTCCAGATGGTGAGCF:GCGACTTTGCCGAGATGTBCL-2260XM_021099602R:AATCCAGCCTCCGTTATCCTF:CCACGAGACCACCTTCAACTC-actin131DQ845171R:TGATCTCCTTCTGCATCCTGT注：脂肪酸转运蛋白家族（FATPs），溶质载体家族7 成员（SLC7As），溶质载体家族38 成员（sSLC38As），B淋巴细胞瘤-2（BCL-2），BCL-2 关联X蛋白（BAX）1.8实时荧光定量PCR利用实时荧光定量PCR技术检测和比较柯乐猪和大白猪胎盘中氨基酸、葡萄糖、脂肪酸转运、血管生成、抗氧化应激和细胞调亡相关基因的mRNA表达水平差异。PCR反应体系（10 L）：SYBRSe l e c tMasterMix5L，上、下游引物（10 mol/L）各0.3L，c D NA 1L，d d H,O 3.4L。PCR反应程序：50 尿嘧啶DNA糖基酶（UDG）激活2 min,20233年畜牧与兽医第6 期第55卷95预变性2 min；95变性15s，6 0 退火15s，72延伸1min，共40 个循环；9515s，6 0 1min，9515s。每个样品做4个技术重复，将大白猪组设为对照组，采用2-AACI法计算相对表达量。1.9氧化应激相关指标测定取0.1g胎盘放人PBS中冲洗1次，再置于1mL生理盐水中匀浆，然后按照试剂盒说明书用化学荧光法检测ROS水平，用黄嘌呤氧化酶法测定SOD活性，用钼酸铵法测定CAT活性，用二硫代二硝基苯甲酸法测定谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)活性。1.10数据统计与分析仔猪死胎率和产活仔率采用卡方检验进行差异性分析，母猪窝均产仔数、初生重、胎盘绒毛数量、血管数量、基因相对表达水平和免疫荧光定量分析利用SPSS19.0软件的One-wayANOVA方法进行分析。数值用“平均值标准误”表示，P0.05表示差异显著，P0.01表示差异极显著。2结果与分析2.1柯乐猪与大白猪的繁殖性能比较通过比较可以看出（表2），柯乐猪的窝均产仔数、产活仔率和平均初生重均显著低于大白猪（P0.05），而背骠厚和死胎率显著高于大白猪首（P0.05)。表2柯乐猪与大白猪的繁殖性能的比较品种窝数背骠厚/mm窝均产仔数死胎率/%产活仔率/%平均初生重/柯乐猪1831.62.1*8.91.915.53*84.471045206大白猪2021.81.514.41.3*6.1193.89*1.344224*注：*表示品种间差异显著(P0.05)2.2柯乐猪与大白猪胎盘组织形态比较从图1A中可以看出，柯乐猪胎盘的绒毛较大白猪胎盘的绒毛发育较差，绒毛数量极显著低于大白猪胎盘（P0.01，图1B）。此外，通过胎盘组织形态观察和血管标记物CD31免疫荧光分析显示2 组猪胎盘单位长度的血管数量无显著差异（图1C和图2）。AB15*m10大白猪5200m大白猪柯乐猪C8650m柯乐猪2200m大白猪柯乐猪品种A.胎盘组织形态比较；B.胎盘绒毛数量比较；C.胎盘血管数量比较。红色箭头指示毛细血管；蓝色箭头指示滋养层细胞；*表示组间差异极显著（P0.01)，下同图1大白猪与柯乐猪的胎盘组织形态比较（n=6)Vol.552023Animal Husbandry&Veterinary MedicineNo.6ADAPISpOrangeDAPI+SpOrangeB6大白猪2柯乐猪大白猪柯乐猪品种A.胎盘CD31蛋白的免疫荧光图（2 0 0），黄色箭头指示胎盘毛细血管；B.胎盘CD31阳性细胞定量分析图2血管标记物CD31在大白猪和柯乐猪胎盘中的表达（n=6)2.3柯乐猪与大白猪胎盘营养转运相关基因mRNA表达水平比较图3比较了2 组猪胎盘中葡萄糖转运（SLC2A1、SLC2A3、SL C2 A 10、SL C2 A 12、SL C2 A 13）、氨基酸转运（SL C7 A 2、SL C7 A 4、SL C7 A 10、SL C38 A 10）和脂肪酸转运（FATP1、FA T P4、FA BP5、CD 36）相关基因的转录水平，柯乐猪胎盘中SLC2A1和SLC38A10的转录水平显著低于大白猪胎盘（P0.05），而FATP4的转录水平显著高于大白猪胎盘（P 0.0 5)。A1.5-B2.01大白猪柯乐猪1.5-1.0-1.00.5-0.5-0.0-0.0SLC2A1SLC2A3SLC2A10SLC2A12SLC2A13SLC7A2SLC7A4SLC7A10SLC38A10基因基因C2.5*2.0-1.5-1.00.5-0.0FATP1FATP4FABP5CD36基因A.葡萄糖转运相关基因；B.氨基酸转运相关基因；C.脂肪酸转运相关基因*表示组间差异显著（P0.05），下同图3柯乐猪与大白猪胎盘营养转运相关基因mRNA表达水平比较(n=4)2.4柯乐猪与大白猪胎盘血管生成、抗氧化应激和细胞凋亡相关基因mRNA表表达水平比较从图4中可知，柯乐猪胎盘中CuZn-SOD、M n-SOD、C A T 和BCL-2的转录水平显著低于大白猪胎盘（P0.05）。20233年畜牧与兽医第6 期第55卷1.5大白猪柯乐猪1.00.5.0.0.VEGFR2VECFACuZn-SODMn-SODCATBAXBCL-2血管生成基因抗氧化应激基因细胞调亡基因图4柯乐猪与大白猪胎盘血管生成、抗氧化应激和细胞凋亡相关基因转录表达水平比较（n=4）2.5柯乐猪与大白猪氧化应激相关指标和细胞凋亡水平的比较从图5可知，柯乐猪胎盘中ROS水平显著高于大白猪（P 0.0 5），而SOD和CAT酶水平显著低于大白猪（P 0.0 5）。通过TUNEL分析显示，柯乐猪胎盘组织切片的绿色荧光强度明显大于大白猪胎盘，柯乐猪胎盘的细胞凋亡水平显著升高（图6）。A2.0B3007C807D87*(.Su:n)/xxd-HSS*(ou:n)/xaos1.5.606200-1.04041000.5-202十0.0000大白猪柯乐猪大白猪柯乐猪大白猪柯乐猪大白猪柯乐猪品种品种品种品种A.ROS水平；B.SOD活性；C.GSH-Px活性；D.CAT活性图5柯乐猪与大白猪胎盘氧化应激相关指标的比较（n=10）ADAPISpOrangeDAPI+SpOrangeB25*20-大白猪15-10-5-柯乐猪0大白猪柯乐猪品种A.大白猪和柯乐猪胎盘组织的TUNEL免疫荧光图（10 0），绿色荧光表示TUNEL调亡阳性细胞；B.胎盘TUNEL阳性细胞定量分析图6TUNEL分析柯乐猪和大白猪胎盘的细胞凋亡水平（n=6）3讨论本研究发现柯乐猪的窝均产仔数、产活仔率和平均初生重均显著低于大白猪，而死胎率显著高于大白猪，这些结果与前期的研究结果一致3，反映出繁殖性能差是柯乐猪长期存在的一个劣势。在哺乳动物胎儿的发育过程中，胎盘作为沟通母体和胎儿的桥梁，承载着至关重要的作用，特别是在妊娠中后期，胎儿营养物质依赖于胎盘从母体血液摄取16 。因此，胎盘的生长发育可能是影响柯乐猪繁殖性能的潜在AnimalHusbandry&Veterinary Medicine82023No.6Vol.55原因。猪的胎盘属于上皮绒毛膜胎盘，其胎盘褶皱的形态发育和数量与胎儿摄取的营养存在密切关联。在猪的足月胎盘中，单位面积内的绒毛数量与胎儿的营养供给呈正相关。本研究发现柯乐猪的胎盘绒毛发育不良可能影响到母胎之间营养物质交换速率而不能充分满足胎儿对物质的需求进而造成胎儿发育缺陷，包括死胎和宫内发育迟缓（IUGR）【17 。近期研究发现，胎盘褶皱发育不良可能是克隆猪初生重低和死亡率高的潜在原因17 。因此胎盘绒毛发育不良很可能与柯乐猪死胎率高和仔猪初生重低有关。另一方面，褶皱的形成与滋养层细胞的增殖与迁移有关。因此，柯乐猪的滋养层细胞可能在增殖和迁移上有缺陷，降低了胚胎的附植成功率和存活率。这可能是其产仔数和存活率低的潜在原因大量研究表明背厚与繁殖性能之间存在较强的相关性13。背骠厚能够反映母猪体况，妊娠期母猪背厚过高或过低均不利于胎儿生长发育18 。本研究发现柯乐猪的背骠厚显著高于大白猪，而其窝均产仔数、产活仔率和平均初生重均显著低于大白猪。妊娠后期母猪背骠厚过高与死胎、难产、窝重降低的频率增加有关19。柯乐猪的背骠厚高于瘦肉型猪种是一个普遍现象，但是过高的背骠厚可能引发胎盘功能紊乱而影响母猪繁殖性能。研究发现，妊娠后期母猪背骠厚过高会导致胎盘异位脂质积聚而引起脂质中毒、氧化应激增多、促炎细胞因子表达升高和血管生成调节因子表达降低2 0-2 2】，从而降低了母猪的繁殖性能。胎盘功能障碍与胎盘向胎儿的氧气和营养物质转移减少有关，可能导致胎儿生长受限2 3。因此，母体提供的葡萄糖、氨基酸和脂肪酸等营养素的可用性是胎儿充分生长的决定因素2 4。本研究发现柯乐猪胎盘中SLC2A1和SLC38A10的转录水平显著低于大白猪胎盘，而FATP4的转录水平显著高于大白猪胎盘。葡萄糖作为胎儿生长和发育的主要能量基质，从母体到胎儿的转运受多种因素影响，其中包括交换表面积和转运体表达，而葡萄糖可以通过SLC2A家族的易化扩散转运体运输2 5。SLC2A1在全身广泛表达，负责细胞的基础葡萄糖摄取。在大鼠中，IUGR胎盘中SLC2A1的蛋白表达降低2 6 ，而来自糖尿病女性的巨型婴儿胎盘的SLC2A1表达上调2 7 ，这与本研究结果相一致。氨基酸对胎儿充分发育具有特殊功能，是其结构蛋白质和非蛋白质物质（如多胺、一氧化氮、神经递质以及嘌呤和嘧啶核苷酸）的前体2 8 。SLC38A2是一种单向氨基酸转运蛋白，可将丙氨酸和脯氨酸等中性氨基酸转运到细胞中，并且还可以通过mTOR发出信号以增加滋养层增殖和分化，改善胎盘功能，从而帮助胎儿生长2 9。以前研究发现，抑制SLC38A2的活性会降低胎儿体重30 。本课题组前期探究了胎盘营养转运相关基因在母猪不同妊娠期的表达模式，发现妊娠后期胎盘中参与营养转运的相关基因SLC2A3、SL C 38 A 10、SL C 7 A 4、FA T P4及CD36的表达水平显著升高，这与妊娠后期胎儿快速生长所需的营养物质显著增加有关14。本研究中，柯乐猪胎盘中SLC2A3转录水平有下调趋势，暗示妊娠后期其胎儿的葡萄糖供应可能不足，而SLC38A10低表达可能降低了胎盘的氨基酸的转运效率，不能满足胎儿正常代谢的能量需求，导致胎儿生长发育受阻，增加了出现弱仔的概率。FATP4是FATPs成员之一，许多学者认为FATP4在吸收和利用长链脂肪酸中起着重要的调控作用31。FATP4表达上调可能是由于柯乐猪胎儿对多不饱和脂肪酸的需求在增加而导致的。然而，有研究结果显示，FATP表达上调，会导致胎盘中不同类型的脂肪酸沉积，从而可能引起胎盘代谢增强，从而使胎儿摄取的必需脂肪酸减少32 。但是针对柯乐猪胎儿的营养需求特点还需要进一步探究和发现。此外，血管数量和血流量是影响胎盘转运效率的关键因素，但本研究从组织形态观察和血管生成相关基因表达水平检测发现柯乐猪与大白猪胎盘的血管形成无显著差异。在妊娠过程中，由于胎盘的氧气转运可能会诱发氧化应激，造成氧化损伤和细胞死亡。超氧化物歧化酶在保护组织免受活性氧反应损害方面起着重要作用。本研究发现柯乐猪胎盘中CuZn-SOD、M n-SO D和CAT的转录水平显著低于大白猪胎盘。CuZn-SOD和Mn-SOD均是超氧化物歧化酶家族成员之一，其能够将活性氧和水转化为过氧化氢。而CAT则将过氧化氢分解为分子氧和水，从而保护细胞免受氧化损伤33。有研究表明，母猪遭受氧化应激会产生大量自由基，导致胎盘功能障碍和胎儿生长迟缓34。之前研究结果显示，早产儿中抗氧化酶SOD和CAT的活性降低35。补充CAT有助于提高母猪血清和脐带中的总抗氧化能力（T-AOC）水平36 。此外，徐涛等37 发现妊娠末期背过厚（2 3mm）的母猪胎盘会更容易遭受氧化应激。因此，柯乐猪胎盘中CuZn-SOD、M n-SO D 和CAT的转录水平和酶活性显著低于大白猪，且ROS水平显著升高可能导致其胎盘不能最大限度地消除活性氧，从而影响母猪的繁殖性能。细胞调亡是维持生命和细胞稳态的关键过程，在胎盘发育中发挥着重要作用。BCL-2是一种主要的抗调亡蛋白，通过阻断线粒体释放的细胞色素C，对2023年第6 期第55卷畜牧与兽医减少细胞调亡发挥了重要作用。本研究发现柯乐猪胎盘中BCL-2转录水平显著低于而细胞凋亡水平显著高于大白猪胎盘。大量研究发现妊娠并发症中胎盘的细胞调亡异常，在先兆子痫胎盘中，促凋亡基因BAX的转录水平显著升高，而BCL-2的mRNA表达水平显著降低38-39。此外凋亡标志物的上调被认为与同型半胱氨酸和氧化应激增加有关40 。细胞凋亡增多可能导致胎儿的营养物质运输减少41。胎儿的营养需求得不到满足，生长就会受到限制，从而造成仔猪出生率低。因此柯乐猪胎盘抗氧化和抗凋亡性能减弱可能影响胎盘的形态发育和功能发挥，进而降低了胎猪的发育质量。柯乐猪的窝均产仔数、产活仔率以及平均初生重均显著低于大白猪。柯乐猪的胎盘绒毛发