地黄功能因子提取物体外抗氧化活性及α-葡萄糖苷酶抑制活性研究.pdf

通过体外试验，探讨了DHTW抗氧化活性及-葡萄糖苷酶的抑制活性，为地黄降糖功能因子的开发利用提供理论依据.采用紫外分光光度法（UV）测定DHTW清除DPPH、ABTS等自由基的能力，利用酶标仪测定DHTW抑制-葡萄糖苷酶的活性.结果表明：DHTW均具有抗氧化活性，质量浓度在06 mg/mL内，随着浓度的增加，抗氧化活性也不断增加，当溶液达到一定浓度后，抗氧化性趋于稳定.DHTW的DPPH自由基清除能力IC50值分别为：醇洗脱物DHY（0.087 mg/mL）、粗提物DHC（2.987 mg/mL）、水洗脱物DHS（3.024 mg/mL），故自由基清除能力表现为：DHYDHCDHS.DHTW的ABTS自由基清除能力IC50值分别为：DHY（0.137 mg/mL）、DHC（1.463 mg/mL）、DHS（2.168 mg/mL），ABTS自由基清除率表现为：DHYDHCDHS.DHTW对-葡萄糖苷酶均有明显的抑制作用，其中，DHY有较明显的抑制能力，-葡萄糖苷酶抑制活性明显优于DHC、DHS.关键词：DHTW；功能因子；抗氧化活性；-葡萄糖苷酶抑制活性中图分类号：R 284.2文献标识码：AAntioxidative Activity and-glucosidase Inhibitory Activity of Rehmanniaglutinosa Functional Factor Extract in VitroLI Zihong1，ZHANG Taotao1，ZHANG Yanchang2，SONG Mengjiao1，LI Feifei1，WEI Yue1（1.Henan Natural Product Biotechnology Co.Ltd.，Zhengzhou 450002，China；2.Henan Academy of Sciences，Zhengzhou 450002，China）Abstract：In this paper，the antioxidant activity of DHTW and the inhibitory activity of-glucosidase werediscussed through in vitro experiments，which provided a theoretical basis for the development and utilization ofRehmannia glutinosa hypoglycemic functional factors.The ability of DHTW to scavenge free radicals such as DPPHand ABTS was determined by ultraviolet spectrophotometry（UV），and the activity of DHTW to inhibit-glucosidasewas determined by microplate reader.The results show that：DHTW has antioxidant activity，and the concentrationis within 0-6 mg/mL.With the increase of concentration，the antioxidant activity also increases continuously.Whenthe concentration reaches a certain concentration，the antioxidant activity tends to be stable.The IC50values ofDHTW DPPH free radical scavenging ability are as follows：Alcohol eluate DHY（0.087 mg/mL），crude extract DHC（2.987 mg/mL），water eluate DHS（3.024 mg/mL），so the free radical scavenging abilities are arranged in order：DHYDHCDHS.The IC50values of DHTW ABTS free radical scavenging ability are as follows：DHY（0.137 mg/mL），DHC（1.463 mg/mL），DHS（2.168 mg/mL），and the free radical scavenging rates of ABTS are arranged in order：DHYDHCDHS.DHTW also has obvious inhibitory effect on-glucosidase.Among them，DHY has obvious inhibitoryability，and the inhibitory activity of-glucosidase is obviously better than that of DHC and DHS.Key words：DHTW；functional factor；antioxidant activity；-glucosidase inhibitory activity地黄（Rehmannia Glutinosa Libosch.）属于玄参科植物，味甘、苦，性寒，可以起到清热凉血，养阴生津的作用1.它的主要成分包含苷类、低聚糖类、环烯醚萜类、苯乙醇类、氨基酸、有机酸2-3，具有降血糖、抗衰老、抑瘤的作用，同时还具备调整人体免疫机能和多种治疗的功能药理作用4-5，其中大部分与抗氧化活性有关6.研究结果表明，地黄中很多活性成分不仅可以入药，也有可用于临床治疗，如高血压、糖尿病的治疗.近年来，关于地黄的研究多集中于化学成分及结构鉴定方面7-20，而对其实际发挥功效的活性物质基础研究较少.本研究采用体外实验法对DHTW抗氧化活性和-葡萄糖苷酶抑制活性进行研究，为地黄降糖功能因子的开发及降糖机理的研究提供理论依据.1仪器和材料1.1仪器酶标仪，产自美国伯乐公司；AUW220D十万分之一天平，产自日本岛津；ME204万分之一天平，产自梅特勒-托利多仪器有限公司；粉碎机，产自瑞安市永历制药机械有限公司；TU1810紫外分光光度法，产自北京普析通用仪器责任有限公司；TDL-5-A离心机，产自上海安亭科学仪器厂；DGX-9143B鼓风干燥箱，产自上海福玛.1.2材料PNPG 4-硝基苯基-D-吡喃葡萄糖苷，产自上海安谱璀氏标准技术服务有限公司；-葡萄糖苷酶，产自上海源叶生物科技有限公司；阿卡波糖，产自中检院；无水碳酸钠，产自北京化工厂；磷酸氢二钾，产自洛阳市化学试剂厂；磷酸二氢钾，产自天津市风船化学试剂科技有限公司；过硫酸钾，产自天津市风船化学试剂科技有限公司；抗坏血酸，购自天津市恒兴化学试剂制造有限公司；无水乙醇，产自天津市科密欧化学试剂；甲醇，产自天津市致远化学试剂有限公司；DPPH 1，1-二苯基-2-三硝基苯肼；ABTS 2，2联氨-双3-乙基苯并噻唑-6-磺酸二铵盐.1.3试剂1）-葡萄糖苷酶溶液：0.1 mol/L缓冲液（pH=6.8）稀释为0.2 U/mL.2）PNPG溶液：用0.1 mol/L缓冲液溶解制成5 mmol/L的溶液.3）碳酸钠溶液：加入去离子水超声溶解，制成0.5 mol/L的溶液.4）0.1 mol/L磷酸盐缓冲液（pH=6.8）：49.7 mL 0.1 mol/L K2HPO4和50.3 mL 0.1 mol/L KH2PO4的混合溶液.5）DPPH溶液：用无水乙醇制成0.1 mg/mL的DPPH储备液.6）ABTS溶液：准确称取ABTS粉末0.192 0 g并精密量取50 mL甲醇，超声溶解，即为A试液；依次取0.094 6 g过硫酸钾加入50 mL蒸馏水中超声溶解为B试液，然后A和B混合使用，避光静置12 h.2地黄功能因子提取物（DHTW）的制备称取地黄饮片粉末200 g，用15倍量的蒸馏水浸泡5 h，7080 加热1 h，冷却后用400目纱布过滤，离心10 min（3000 r/min），合并滤液浓缩至干即为地黄粗提物（DHC）.上清液过柱，用1 L蒸馏水冲洗，收集液体浓缩至干即为地黄水洗脱物（DHS）.然后用1 L 95%乙醇冲洗，收集醇提部分，浓缩至干即为醇洗脱物（DHY）.3方法与结果3.1-葡萄糖苷酶活性抑制试验地黄功能因子提取物对-葡萄糖苷酶活性抑制试验方法参考Xu等21方法，并对此加以改动.样品组试验方法为：用移液枪将20 L酶液和20 L样品溶液加至96孔板上，再置于鼓风干燥箱37 内放置约10 min；然后加入20 L PNPG溶液，将反应物再次置于鼓风干燥箱（37）30 min；然后加入80 L碳酸钠溶液.停止反应后，利用酶标仪于405 nm处测定吸光度.按照表1设置的空白组、对照组、样品空白组不同组别的反应体引用格式：李自红，张桃桃，张延昌，等.地黄功能因子提取物体外抗氧化活性及-葡萄糖苷酶抑制活性研究 J.河南科学，2023，41（8）：1112-1117.-1113第41卷 第期河 南 科 学2023年8月系，依次添加有关试剂进行反应，反应条件与样品组一致，以阿卡波糖作为阳性对照.每个样品均设3个平行，计算抑制率.表1-葡萄糖苷酶活性抑制试验反应体系Tab.1Reaction system of-glucosidase activity inhibition test试剂磷酸盐缓冲液样品-葡萄糖苷酶PNPG碳酸钠溶液空白组1002080对照组80202080样品空白组80202080样品组6020202080酶活抑制率计算方式：酶活抑制率=1-（A1-A2）/（A3-A0）100%.（1）式中：A1为样品组吸光度；A2为样品空白组吸光度；A3为空白组吸光度；A0空白对照组吸光度.3.2地黄功能因子提取物抗氧化活性的方法研究3.2.1清除DPPH自由基能力的测定DHS、DHC、DHY以及阳性对照抗坏血酸分别按如下步骤操作.1）在10 mL试管中准确添加2.0 mL DPPH溶液和2.0 mL无水乙醇，并充分混匀后，避光保存30 min.2）在10 mL试管中添加2.0 mL不同浓度的样品溶液和2.0 mL DPPH的溶液，摇匀，室温（25）避光放置反应30 min.3）在10 mL试管中加入2.0 mL样品溶液和2.0 mL无水乙醇，充分混匀，室温避光放置反应30 min.4）反应结束后，以无水乙醇为试剂空白，在517 nm处测定吸光度，记录各组的吸光值，重复三次平行实验.分别计算出不同浓度对应的清除率，绘制清除率对浓度的曲线.DPPH清除率=1-（A1-A2）/A0100%.（2）式中：A0为2 mL无水乙醇+2 mL DPPH溶液的吸光值；A1为2 mL样品溶液+2 mL DPPH溶液的吸光值；A2为2 mL样品溶液+2 mL无水乙醇的吸光值.3.2.2清除ABTS自由基能力的测定1）在10 mL试管中加入3.0 mL的ABTS溶液和0.5 mL甲醇，使其混匀，避光放置30 min.2）在10 mL试管中添加0.5 mL不同浓度的样品溶液，3.0 mL ABTS溶液，摇匀，室温（25）避光放置反应30 min.3）反应结束后，以甲醇为试剂空白，在734 nm处测定吸光度，记录各组的吸光值，重复三次平行实验.绘制出浓度对清除率的曲线图.其线性回归方程为：ABTS 自由基清除率=（A0-A）/A0100%.（3）式中：A0为0.5 mL甲醇+3 mL ABTS 检测液的吸光值；A为0.5 mL样品溶液+3 mL ABTS 检测液的吸光值.4结果与分析4.1DHTW不同浓度对-葡萄糖苷酶抑制活性的影响按照宋菲等22方法稍作改动，将地黄提取物浓度配制成1、2、4、6、8、10 mg/mL，以阿卡波糖作为阳性对照，按照表 1反应体系进行-葡萄糖苷酶抑制实验，根据抑制率与地黄提取物浓度关系，筛选出地黄提取物的不同质量浓度，如表2所示.单位：L-1114表2DHTW不同质量浓度对-葡萄糖苷酶抑制活性Tab.2Inhibitory activity of DHTW on-glucosidase at different concentrations提取物名称DHSDHCDHYDZT各质量浓度对-葡萄糖苷酶抑制率/%1 mg/mL36.970.0102.170.0217.900.0745.340.122 mg/mL46.650.0506.110.0322.500.0461.250.084 mg/mL54.810.1026.740.0154.820.0871.210.136 mg/mL56.550.0730.290.0579.890.0682.610.118 mg/mL70.190.1155.640.0392.420.1191.260.1610 mg/mL76.760.0754.540.0492.590.0898.210.09表2、图1结果表明，DHTW对-葡萄糖苷酶抑制活性与浓度呈正相关，即-葡萄糖苷酶抑制活性随浓度的提高而增强，其中DHY的抑制率在18 mg/mL范围内随浓度增加而增加，当质量浓度增加到10 mg/mL时，浓度趋于稳定.在110 mg/mL范围内，阿卡波糖的抑制率也随浓度的增加而增加，DHY的-葡萄糖苷酶抑制活性明显高于DHC、DHS.由表2可知，在同一质量浓度下（10 mg/mL），以DZT为阳性对照，-葡萄糖苷酶抑制活性结果显示，DHY、DHS、DHC抑制率分别达到92.59%（IC50：3.896 mg/mL）、76.76%（IC50：3.450 mg/mL）、54.54%（IC50：8.352 mg/mL）.DHTW对-葡萄糖苷酶抑制活性从小到大依次为：DHCDHSDHCDHS.图1地黄不同提取物浓度对-葡萄糖苷酶抑制活性Fig.1-glucosidase inhibitory activity of different extracts from Rehmannia glutinosa图2抗坏血酸DPPH的清除率Fig.2Clearance rate of ascorbic acid DPPH抑制率/%024681012质量浓度/（mgmL-1）DHS DHC DHY DZT 10080604020DHS DHC DHY DZT DHSDHCDHYDZT清除率/%00.005 0.0100.015 0.020 0.025 0.030 0.035VC质量浓度/（mgmL-1）10080604020引用格式：李自红，张桃桃，张延昌，等.地黄功能因子提取物体外抗氧化活性及-葡萄糖苷酶抑制活性研究 J.河南科学，2023，41（8）：1112-1117.-1115第41卷 第期河 南 科 学2023年8月4.4ABTS阳性对照抗氧化活性按3.2.2小节所示测定阳性对照对ABTS自由基的清除率，以VC为阳性对照，在0.0010.030 mg/mL范围内时，ABTS自由基的清除效果随着VC浓度的增加而增加.如图4所示.4.5DHS、DHC和DHC（ABTS法）抗氧化活性分析根据图4、图5可知，ABTS法测定地黄功能因子提取物抗氧化活性时，DHY的抗氧化活性略低于VC；DHTW的IC50值分别为VC（0.016 mg/mL）、DHY（0.137 mg/mL）、DHC（1.463 mg/mL）、DHS（2.168 mg/mL），氧化（a）清除DPPH自由基能力（b）IC50值IC50mg/mLVCDHSDHCDHY3.53.02.52.01.51.00.50DHS DHC DHY DPPH清除率/%0510质量浓度/（mgmL-1）10080604020DHSDHCDHY图3不同提取物清除DPPH自由基能力及IC50值Fig.3DPPH radical scavenging ability and IC50value of different extracts图4阳性对照VC ABTS自由基清除率Fig.4VC ABTS radical clearance rate of positive control（a）ABTS自由基清除率（b）IC50值DHY DHS DHC ABTS清除率/%0246质量浓度/（mgmL-1）10080604020DHYDHSDHCIC50/（mgmL-1）VCDHSDHCDHY2.52.01.51.00.50图5地黄不同提取物ABTS自由基清除率及IC50值Fig.5ABTS radical scavenging rate and IC50value of different Rehmannia glutinosa extractsABTS清除率/%00.010.020.030.040.050.060.07VC质量浓度/（mgmL-1）10080604020-1116活性表现为：DHYDHCDHS.4.6统计学方法采用 IBM SPSS Statistics 26统计软件计算半数抑制浓度（IC50），所有的试验数据都是3次重复的均值.5结语DHTW具有抗氧化活性和-葡萄糖苷酶抑制活性，其中DHY最好，DHC其次，DHS最差.实验表明，DHTW具有很好的利用和开发价值.利用UPLC-MS对其功能因子进行定性定量分析，深入研究其降血糖作用机理，为下一步建立-葡萄糖苷抑制动力学模型和Hep G2细胞胰岛素抵抗模型奠定基础，也为地黄开发和治疗糖尿病的新型药物开发提供新的思路.参考文献：1 冯卫生，李孟，郑晓珂，等.生地黄化学成分研究 J.中国药学杂志，2014，49（17）：1496-1502.2 FRANCO S C，YONAMINE M.Measurement uncertainty for the determination of amphetamines in urine by liquid-phase microextraction and gas chromatographymass spectrometry J.Forensic Science International，2016，265：81-88.3 LIU H C，LIN D L，MCCURDY H H.Matrix effects in the liquidchromatography-tanderm mass 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