中医气虚血瘀证斑马鱼模型的构建与评价_郭帅杰.pdf

基金项目：国家自然科学基金项目（）作者简介：郭帅杰（.），男，硕士研究生在读，研究方向：中西医结合防治心血管病研究，：.通信作者：周明学（.），男，博士，研究员，研究方向：中西医结合防治心血管病研究，：.中医气虚血瘀证斑马鱼模型的构建与评价郭帅杰，李思耐，刘卫红，刘红旭 周明学，（首都医科大学附属北京中医医院，北京，；北京市中医药研究所，北京，）摘要 目的：对中医气虚血瘀证斑马鱼模型进行构建与评价。方法：随机选取 尾受精后 （）野生型 品系斑马鱼于 孔板中，每孔均处理 尾斑马鱼。分为正常对照组、气虚血瘀证组和药物验证组。采用无水亚硫酸钠和异丙肾上腺素盐酸盐联合刺激建立气虚血瘀证斑马鱼模型。药物验证组斑马鱼在造模基础上给予水溶脑心通胶囊。每组随机选取 尾斑马鱼，使用行为学分析仪分析斑马鱼的总运动距离；采用乳酸和 试剂盒测定斑马鱼体内乳酸和 水平；置于荧光显微镜下拍照，图像处理软件分析斑马鱼心脏凋亡细胞心肌细胞凋亡荧光强度；采用心跳血流分析系统分析斑马鱼血流速度和心输出量。结果：与正常对照组比较，气虚血瘀证组斑马鱼总运动距离和 水平均明显降低（.，.），气虚血瘀证组斑马鱼体内乳酸水平和心肌细胞凋亡荧光强度明显高于正常对照组（.，.），而血流速度和心输出量明显低于正常对照组（.，.）。与气虚血瘀证组比较，药物验证组斑马鱼总运动距离、体内 水平、血流速度和心输出量明显升高（.，.），斑马鱼心肌细胞凋亡荧光强度和体内乳酸水平明显降低（.）。结论：无水亚硫酸钠和异丙肾上腺素盐酸盐联合干预可成功建立气虚血瘀证斑马鱼模型。关键词 气虚血瘀；斑马鱼；动物模型制备；证候模型；脑心通胶囊；无水亚硫酸钠；异丙肾上腺素盐酸盐 ，（，；，）：（），（），（），：，（.，.）（.，.），（.，.），（.，.），（.）：；中图分类号：.；文献标识码：据最新心血管健康与疾病报告显示，中国心血管病患病率和病死率仍处于持续上升阶段，对心血管病的防治是中西医刻不容缓的任务。气虚血瘀证是中医心血管病辨证的重要证型，其基本内涵 ，是气虚无力推动血液循行，进而出现血行不畅甚至瘀滞，最终导致气虚血瘀证，在临床上以倦怠乏力、自汗、气少懒言、局部疼痛、舌淡紫或有瘀斑、脉沉涩等症状为具体表现。建立合适的气虚血瘀证实验动物模型，对于研究中医药治疗心血管疾病的疗效和机制至关重要。既往气虚血瘀证动物模型多采用大小鼠模型，通过观察实验动物出现符合中医证候的宏观表征、肢体行为学，并采用血液流变学指标等对造模方法进行评价。近年来斑马鱼模型因其可视性强、观察方便、成本低和周期短等优势，在药理药效学研究中应用逐渐增多。但是采用斑马鱼模型进行气虚血瘀证候研究尚未见相关报道。因此，本研究尝试选用野生型 品系斑马鱼，给予无水亚硫酸钠和盐酸异丙肾上腺素干预，致其缺氧诱发乳酸堆积、疲劳和一定程度的心功能受损，最后在观察运动能力、血流速度和心输出量的基础上检测乳酸、水平和心肌细胞凋亡情况来评价模型，并采用具有益气活血作用的复方脑心通胶囊进行验证，以期建立一种新颖的气虚血瘀证动物模型，为中医证候学研究提供一个新的思路和方法。材料与方法.材料.实验动物 野生型 品系斑马鱼，年龄为，以自然成对交配繁殖方式进行，斑马鱼均饲养于 的养鱼用水中（水质：每 反渗透水中加入 速溶海盐，电导率为 ；值为.；硬度为 ），由杭州环特生物有限公司提供并饲养。实验动物使用许可证号为：（浙）。饲养管理符合国际 认证（认证编号：）的要求。本实验由杭州环特生物科技股份有限公司实验动物管理委员会批准（伦理审批号：）。.药物脑心通胶囊（陕西步长制药有限公司，国药准字，批号：）；无水亚硫酸钠（阿拉丁试剂有限公司，批号：）；异丙肾上腺素盐酸盐（东京化成工业株式会社，日本，批号：）。.试剂与仪器 体式显微镜（公司，日本，型号：）；相机（上海土森视觉科技有限公司，型号：）；电动聚焦连续变倍荧光显微镜（公司，日本，型号：）；心跳血流分析系 统（公 司，法 国，型 号：.）；行为分析仪（公司，法国，型号：.）；多功能酶标仪（公司，瑞士，型号：）；紫外可见光分光光度计（公司，美国，型号：）。吖啶橙染料（公司，批号：）；乳酸（）测定试剂盒（南京建成生物研究所，货号：）；试剂盒（公司，货号：）。.方法.模型制作 采用 无水亚硫酸钠和 盐酸异丙肾上腺素处理 野生型 品系斑马鱼，处理 ，建立斑马鱼气虚血瘀模型。.动物分组和药物干预随机选取 尾 野生型 品系斑马鱼于 孔板中，每孔（观察组）均处理 尾斑马鱼。水溶给予脑心通胶囊.，设置正常对照组和气虚血瘀组，每孔容量为 。除正常对照组外，其余观察组均给予 无水亚硫酸钠和 盐酸异丙肾上腺素处理建立斑马鱼气虚血瘀模型。处理 后，每个观察组随机选取 尾斑马鱼，进行相关检测。.检测指标与方法.各组斑马鱼运动能力检测使用行为学分析仪采集数据，分析斑马鱼的总运动距离，以该指标的统计学分析结果评价各组斑马鱼的运动能力。.各组斑马鱼体内乳酸水平检测利用乳酸试剂盒测定各组斑马鱼体内乳酸水平，使用 紫外可见光分光光度计软件采集数据，分析各组斑马鱼体内乳酸水平。.各组斑马鱼体内 水平的检测利用 水平检测试剂盒，使用多功能酶标仪软件采集数据，分析各组斑马鱼体内 水平。.各组斑马鱼心脏心肌细胞凋亡情况检测 使用吖啶橙进行染色，染色后置于荧光显微镜下拍照，使用 .高级图像处理软件采集数据，分析各组斑马鱼心肌细胞凋亡荧光强度。.各组斑马鱼血流速度和心输出量检测 置于显微镜下拍照，使用心跳血流分析系统采集数据，分析斑马鱼的血流速度和心输出量，以该指标统计学分析结果评价各斑马鱼的血流速度和心输出量。.统计学方法数据采用 .软件进行统计分析，实验数据采用均数 标准误（?世界中医药 年 月第 卷第 期）表示，组之间比较采用单因素方差分析，以 .为差异有统计学意义。结果.各组斑马鱼运动能力比较与正常对照组斑马鱼比较，气虚血瘀组斑马鱼总运动距离明显减少，差异有统计学意义（.），而脑心通胶囊药物验证组（药物验证组）斑马鱼总运动距离，与气虚血瘀组比较明显增加，差异有统计学意义（.）。提示气虚血瘀组斑马鱼的运动能力明显降低，而验证药物脑心通胶囊可明显改善气虚血瘀组斑马鱼降低的运动能力。见表，图。图 行为学分析仪记录各组斑马鱼运动轨迹典型图 注：黑色线为慢速运动距离、绿色线为中速运动距离、红色线为快速运动距离表 各组斑马鱼的总运动距离比较（?，）组别总运动距离正常对照组 气虚血瘀组 药物验证组（.）注：与正常对照组比较，.；与气虚血瘀组比较，.各组斑马鱼体内乳酸水平比较与正常对照组比较，气虚血瘀组斑马鱼体内乳酸水平明显升高，差异有统计学意义（.），而脑心通胶囊气虚血瘀药物验证组（药物验证组）斑马鱼体内乳酸水平与气虚血瘀组比较明显降低，差异有统计学意义（.）。见表。表 各组斑马鱼乳酸水平比较（?，）组别斑马鱼体内乳酸正常对照组.气虚血瘀组.药物验证组（.）.注：与 正常对 照组比 较，.；与 气 虚 血 瘀 组 比较，.各组斑马鱼体内 水平比较与正常对照组比较，气虚血瘀组斑马鱼体内 水平明显降低，差异有统计学意义（.），而药物验证（脑心通胶囊）组斑马鱼体内 水平与气虚血瘀组比较明显升高，差异有统计学意义（.）。见表。表 各组斑马鱼 水平比较（?，）组别光信号强度正常对照组 气虚血瘀组 药物验证组（.）注：与正常对照组比较，.；与气虚血瘀组比较，.各组斑马鱼心肌细胞凋亡情况比较与正常对照组比较，气虚血瘀组斑马鱼体内心脏凋亡细胞荧光强度明显增加，差异有统计学意义（.），而气虚血瘀药物验证（脑心通胶囊）组斑马鱼体内心脏凋亡细胞荧光强度，与气虚血瘀组比较明显降低，差异有统计学意义（.）。提示气虚血瘀组斑马鱼的心肌细胞损伤明显，而益气活血中药脑心通胶囊可明显改善气虚血瘀组斑马鱼的心脏的心肌损伤程度。见表，图。图 各组斑马鱼心脏心肌凋亡情况比较（吖啶橙染色，）注：黄色虚线为分析部位心脏表 各组斑马鱼心脏心肌凋亡情况比较（?，）组别心脏凋亡细胞应荧光强度（像素）正常对照组 气虚血瘀组 药物验证组（.）注：与正常对照组比较，.；与气虚血瘀组比较，.各组斑马鱼血流速度和心输出量比较与正常对照组比较，气虚血瘀组斑马鱼血流速度和心输出量明显降低，差异有统计学意义（.，.）；而气虚血瘀药物验证（脑心通胶囊）组斑马鱼的血流速度和心输出量，与气虚血瘀组比较明显升高，差异有统计学意义（.，.）。提示气虚血瘀组斑马鱼出现一定程度的血流瘀滞，而益气活血中药脑心通胶囊可明显改善气虚血瘀组斑马鱼的血流瘀滞情况。见表。表 各组斑马鱼血流速度和心输出量比较（?，）组别血流速度（）心输出量（）正常对照组 .气虚血瘀组.药物验证组（.）.注：与正常对照组比较，.，.；与气虚血瘀组比较，.，.，讨论近年来斑马鱼作为一种模式生物，因其体积小、胚胎透明、易于大规模饲养、繁殖能力强和实验周期短，被广泛地用于疾病的研究中，在高通量筛选中药单味药或复方有效成分中有独特的优势。证候学是中医学的核心理论，基于证候学的辨证论治更是中医临床的基础。气虚血瘀证是中医心血管病的重要证候类型，毛静远等回顾 年中的冠心病患者，发现气虚血瘀证在冠心病所有证型中占，并且占比呈逐年上升的趋势。在中医临床诊疗术语国家标准（证候部分）将心气虚血瘀证定义为“心气虚弱，运血无力，心脉瘀阻，以心悸气短，胸闷心痛，神疲乏力，面色紫暗，舌淡紫，脉弱等为常见症的证候”。在气虚血瘀证心血管病的现代研究中，有学者主张将传统中医中的“气”归结为人所呼吸的空气和能量代谢的基础物质，认为气与 的生成有着极大的关联，而 可以将单个的细胞骨架（）组装成为肌动蛋白（），进而维持心肌收缩和舒张功能，发挥行血作用。心脏的能量储备有限，但为了维持恒定的收缩功能，心脏需要的能量代谢需求巨大，需要源源不断地生产。葡萄糖和脂肪酸是 产生的主要贡献者，葡萄糖通过无氧糖酵解产生丙酮酸和少量的，但是当能量需求低或者在无氧环境时丙酮酸转化为乳酸。当发生心血管疾病尤其缺血性心脏病时，由于能量代谢的基础物质缺乏，导致 的生成不足，心脏所需能量得不到补充，影响心肌的正常收缩和舒张，导致血液循环过程受影响，从而致使机体的正常功能下降，这一过程用来阐释中医的气虚有一定的参考意义。血瘀证是心血管病中最为常见的证型，血瘀即血行不畅，客观上可以表现为血流速度减慢、冠状动脉狭窄、血液流变学指标异常、凝血功能指标异常等等。心肌缺血时心肌细胞供氧量不足，导致葡萄糖无氧糖酵解增多，致使 生成减少而乳酸生成增多，心肌的正常收缩受到影响，进而出现血流速度减慢等等一系列血瘀表现。气虚血瘀证的核心症状是疲倦乏力，当机体疲劳时常常表现为肌肉出现僵硬、动作慢、不协调、反应迟钝等。而斑马鱼大部分器官的生理机制与人类高度相似，其生长发育快，运动轨迹易于记录等优势有利于开展中医气虚证的研究。为了模拟斑马鱼气虚证候，我们的研究尝试使用无水亚硫酸钠通过化学反应消耗水中氧气，营造缺氧的环境。斑马鱼由于氧气不足，机体需要迅速提供能量来维持生命需求，这一过程即为糖的无氧氧化，糖酵解在生成丙酮酸的过程中产生，最后丙酮酸被还原为乳酸。在缺氧的情况下，斑马鱼能量代谢产生大量的乳酸堆积，使局部 浓度增加，过量 作用于肌原纤维，可导致肌肉收缩力降低，运动减弱。我们的实验结果显示，气虚血瘀组斑马鱼的运动能力、水平与正常组比较明显降低，乳酸水平明显增加；而益气活血中药脑心通胶囊可明显改善气虚血瘀斑马鱼的这些指标。脑心通胶囊作为治疗气虚血瘀证冠心病临床常用药物，疗效肯定，作为本实验中气虚血瘀斑马鱼以方测证的药物合理。以上提示斑马鱼在无水亚硫酸钠处理的缺氧环境中出现运动能力降低、乳酸堆积和 水平减少，与中医气虚证的部分表征和评价指标相符合。气虚血瘀证表现的另一症状为心气虚弱，运血无力，血脉瘀阻，这一特点符合血流动力学中的血流速度减慢。在本实验中，我们通过斑马鱼血流检测系统观察到，盐酸异丙肾上腺素诱导可导致斑马鱼出现血流速度减慢和心输出量降低。盐酸异丙肾上腺素属于 受体激动剂，可使心脏收缩力增强、心率加快、传导加速、心排血量增加、心肌耗氧量增加，既往研究表明盐酸异丙肾上腺素可诱导动物心肌损伤。在我们的模型中可观察到斑马鱼体内心肌细胞凋亡荧光强度明显增加，提示心肌细胞损伤明显，还观察到血流速度和心输出量的明显降低，而益气活血中药脑心通胶囊可明显改善气虚血瘀组斑马鱼的这些指标。以上说明，采用盐酸异丙肾上腺素诱导的斑马鱼可出现明显的心肌损伤以及血瘀表现和体征。综上所述，我们尝试使用无水亚硫酸钠创造缺氧环境复合盐酸异丙肾上腺素提高斑马鱼心肌耗氧量和减弱血流动力学相关功能的方法构建气虚血瘀型的斑马鱼模型，并且对其运动能力、乳酸和 水平、心肌细胞凋亡情况、心输出量和血流速度进行检测，并在此基础上，采用益气活血中药脑心通胶囊进行验证，实验结果显示斑马鱼气虚血瘀模型构建成功，可用于中医气虚血瘀证候研究。本研究为模式动物中医证候研究提供了新的可能，具有一定的开创性。在未来的研究中，我们将进一步完善造模方法并深入探讨其相关机制，采用更丰富的检测手段和指标提供实验依据。利益冲突声明：无。参考文献中国心血管健康与疾病报告编写组 中国心血管健康与疾病报告世界中医药 年 月第 卷第 期 概要 中国循环杂志，（）：王少卿，刘强，高颖 气虚血瘀证诊断量表编制研究 中华中医药杂志，（）：李祥，张悦，张文智，等 气虚血瘀证动物模型的研究进展 中国实验方剂学杂志，（）：余景滔，周红玲，刘俊珊，等 基于斑马鱼炎症模型的凉膈散及其组分甘草不同极性部位的抗炎活性评价及作用机制 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