中医气虚血瘀证斑马鱼模型的构建与评价_郭帅杰.pdf
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1、基金项目:国家自然科学基金项目()作者简介:郭帅杰(.),男,硕士研究生在读,研究方向:中西医结合防治心血管病研究,:.通信作者:周明学(.),男,博士,研究员,研究方向:中西医结合防治心血管病研究,:.中医气虚血瘀证斑马鱼模型的构建与评价郭帅杰,李思耐,刘卫红,刘红旭 周明学,(首都医科大学附属北京中医医院,北京,;北京市中医药研究所,北京,)摘要 目的:对中医气虚血瘀证斑马鱼模型进行构建与评价。方法:随机选取 尾受精后 ()野生型 品系斑马鱼于 孔板中,每孔均处理 尾斑马鱼。分为正常对照组、气虚血瘀证组和药物验证组。采用无水亚硫酸钠和异丙肾上腺素盐酸盐联合刺激建立气虚血瘀证斑马鱼模型。药物
2、验证组斑马鱼在造模基础上给予水溶脑心通胶囊。每组随机选取 尾斑马鱼,使用行为学分析仪分析斑马鱼的总运动距离;采用乳酸和 试剂盒测定斑马鱼体内乳酸和 水平;置于荧光显微镜下拍照,图像处理软件分析斑马鱼心脏凋亡细胞心肌细胞凋亡荧光强度;采用心跳血流分析系统分析斑马鱼血流速度和心输出量。结果:与正常对照组比较,气虚血瘀证组斑马鱼总运动距离和 水平均明显降低(.,.),气虚血瘀证组斑马鱼体内乳酸水平和心肌细胞凋亡荧光强度明显高于正常对照组(.,.),而血流速度和心输出量明显低于正常对照组(.,.)。与气虚血瘀证组比较,药物验证组斑马鱼总运动距离、体内 水平、血流速度和心输出量明显升高(.,.),斑马鱼
3、心肌细胞凋亡荧光强度和体内乳酸水平明显降低(.)。结论:无水亚硫酸钠和异丙肾上腺素盐酸盐联合干预可成功建立气虚血瘀证斑马鱼模型。关键词 气虚血瘀;斑马鱼;动物模型制备;证候模型;脑心通胶囊;无水亚硫酸钠;异丙肾上腺素盐酸盐 ,(,;,):(),(),(),:,(.,.)(.,.),(.,.),(.,.),(.):;中图分类号:.;文献标识码:据最新心血管健康与疾病报告显示,中国心血管病患病率和病死率仍处于持续上升阶段,对心血管病的防治是中西医刻不容缓的任务。气虚血瘀证是中医心血管病辨证的重要证型,其基本内涵 ,是气虚无力推动血液循行,进而出现血行不畅甚至瘀滞,最终导致气虚血瘀证,在临床上以倦怠
4、乏力、自汗、气少懒言、局部疼痛、舌淡紫或有瘀斑、脉沉涩等症状为具体表现。建立合适的气虚血瘀证实验动物模型,对于研究中医药治疗心血管疾病的疗效和机制至关重要。既往气虚血瘀证动物模型多采用大小鼠模型,通过观察实验动物出现符合中医证候的宏观表征、肢体行为学,并采用血液流变学指标等对造模方法进行评价。近年来斑马鱼模型因其可视性强、观察方便、成本低和周期短等优势,在药理药效学研究中应用逐渐增多。但是采用斑马鱼模型进行气虚血瘀证候研究尚未见相关报道。因此,本研究尝试选用野生型 品系斑马鱼,给予无水亚硫酸钠和盐酸异丙肾上腺素干预,致其缺氧诱发乳酸堆积、疲劳和一定程度的心功能受损,最后在观察运动能力、血流速度
5、和心输出量的基础上检测乳酸、水平和心肌细胞凋亡情况来评价模型,并采用具有益气活血作用的复方脑心通胶囊进行验证,以期建立一种新颖的气虚血瘀证动物模型,为中医证候学研究提供一个新的思路和方法。材料与方法.材料.实验动物 野生型 品系斑马鱼,年龄为,以自然成对交配繁殖方式进行,斑马鱼均饲养于 的养鱼用水中(水质:每 反渗透水中加入 速溶海盐,电导率为 ;值为.;硬度为 ),由杭州环特生物有限公司提供并饲养。实验动物使用许可证号为:(浙)。饲养管理符合国际 认证(认证编号:)的要求。本实验由杭州环特生物科技股份有限公司实验动物管理委员会批准(伦理审批号:)。.药物脑心通胶囊(陕西步长制药有限公司,国药
6、准字,批号:);无水亚硫酸钠(阿拉丁试剂有限公司,批号:);异丙肾上腺素盐酸盐(东京化成工业株式会社,日本,批号:)。.试剂与仪器 体式显微镜(公司,日本,型号:);相机(上海土森视觉科技有限公司,型号:);电动聚焦连续变倍荧光显微镜(公司,日本,型号:);心跳血流分析系 统(公 司,法 国,型 号:.);行为分析仪(公司,法国,型号:.);多功能酶标仪(公司,瑞士,型号:);紫外可见光分光光度计(公司,美国,型号:)。吖啶橙染料(公司,批号:);乳酸()测定试剂盒(南京建成生物研究所,货号:);试剂盒(公司,货号:)。.方法.模型制作 采用 无水亚硫酸钠和 盐酸异丙肾上腺素处理 野生型 品系
7、斑马鱼,处理 ,建立斑马鱼气虚血瘀模型。.动物分组和药物干预随机选取 尾 野生型 品系斑马鱼于 孔板中,每孔(观察组)均处理 尾斑马鱼。水溶给予脑心通胶囊.,设置正常对照组和气虚血瘀组,每孔容量为 。除正常对照组外,其余观察组均给予 无水亚硫酸钠和 盐酸异丙肾上腺素处理建立斑马鱼气虚血瘀模型。处理 后,每个观察组随机选取 尾斑马鱼,进行相关检测。.检测指标与方法.各组斑马鱼运动能力检测使用行为学分析仪采集数据,分析斑马鱼的总运动距离,以该指标的统计学分析结果评价各组斑马鱼的运动能力。.各组斑马鱼体内乳酸水平检测利用乳酸试剂盒测定各组斑马鱼体内乳酸水平,使用 紫外可见光分光光度计软件采集数据,分
8、析各组斑马鱼体内乳酸水平。.各组斑马鱼体内 水平的检测利用 水平检测试剂盒,使用多功能酶标仪软件采集数据,分析各组斑马鱼体内 水平。.各组斑马鱼心脏心肌细胞凋亡情况检测 使用吖啶橙进行染色,染色后置于荧光显微镜下拍照,使用 .高级图像处理软件采集数据,分析各组斑马鱼心肌细胞凋亡荧光强度。.各组斑马鱼血流速度和心输出量检测 置于显微镜下拍照,使用心跳血流分析系统采集数据,分析斑马鱼的血流速度和心输出量,以该指标统计学分析结果评价各斑马鱼的血流速度和心输出量。.统计学方法数据采用 .软件进行统计分析,实验数据采用均数 标准误(?世界中医药 年 月第 卷第 期)表示,组之间比较采用单因素方差分析,以
9、 .为差异有统计学意义。结果.各组斑马鱼运动能力比较与正常对照组斑马鱼比较,气虚血瘀组斑马鱼总运动距离明显减少,差异有统计学意义(.),而脑心通胶囊药物验证组(药物验证组)斑马鱼总运动距离,与气虚血瘀组比较明显增加,差异有统计学意义(.)。提示气虚血瘀组斑马鱼的运动能力明显降低,而验证药物脑心通胶囊可明显改善气虚血瘀组斑马鱼降低的运动能力。见表,图。图 行为学分析仪记录各组斑马鱼运动轨迹典型图 注:黑色线为慢速运动距离、绿色线为中速运动距离、红色线为快速运动距离表 各组斑马鱼的总运动距离比较(?,)组别总运动距离正常对照组 气虚血瘀组 药物验证组(.)注:与正常对照组比较,.;与气虚血瘀组比较
10、,.各组斑马鱼体内乳酸水平比较与正常对照组比较,气虚血瘀组斑马鱼体内乳酸水平明显升高,差异有统计学意义(.),而脑心通胶囊气虚血瘀药物验证组(药物验证组)斑马鱼体内乳酸水平与气虚血瘀组比较明显降低,差异有统计学意义(.)。见表。表 各组斑马鱼乳酸水平比较(?,)组别斑马鱼体内乳酸正常对照组.气虚血瘀组.药物验证组(.).注:与 正常对 照组比 较,.;与 气 虚 血 瘀 组 比较,.各组斑马鱼体内 水平比较与正常对照组比较,气虚血瘀组斑马鱼体内 水平明显降低,差异有统计学意义(.),而药物验证(脑心通胶囊)组斑马鱼体内 水平与气虚血瘀组比较明显升高,差异有统计学意义(.)。见表。表 各组斑马鱼
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