Accutase和胰蛋白酶消化传代对人胚纹状体来源神经干细胞凋亡的影响.pdf

中 国 医 学 科 学 院 学 报ACTA ACADEMIAE MEDICINAE SINICAEVol.37 No.2185基金项目:国家自然科学基金青年基金(81100057)和长治医学院创新团队项目(CX201408)Supported by the National Natural Sciences Youth Founda-tion of China(81100057)and Changzhi Medical College Innovation Team Project(CX201408)论著Accutase 和胰蛋白酶消化传代对人胚纹状体来源神经干细胞凋亡的影响李婷1，2，李晨1，张翠英1，赵杰31长治医学院生理学教研室，山西长治 0460002中南大学湘雅医学院病理生理学系，长沙 4100083中南大学湘雅医院神经外科，长沙 410008通信作者:张翠英电话:[phone]，电子邮件:;赵杰电话:[phone]，电子邮件:摘要:目的探讨 Accutase 和胰蛋白酶消化神经干细胞(NSCs)后对其凋亡过程的影响。方法来自人类 12 16周自然流产胚胎纹状体组织，分离并体外培养 NSCs，将体外培养的第 3 5 代神经球，分别用胰蛋白酶、Accutase 消化，消化过程中仅振荡打散，避免巴斯德吸管反复吹打。将神经球打散成的单细胞悬液接种。用 Annexin V/碘化丙啶染色、Hoechst 33342 活细胞染色镜下观察等方法，在培养传代后 2 和 24 h 时间点检测神经干细胞凋亡率。结果两种酶消化后立即用台盼蓝染色判断细胞活性，Accutase 消化后活细胞比例为(91.65 4.43)%，胰蛋白酶仅有(83.10 6.76)%，二者比较差异有统计学意义(P 0.05)。体外培养的第 3 5 代人胚纹状体 NSCs 形成的神经球传代后 2 h，Accutase 和胰蛋白酶传代的细胞凋亡率差异有统计学意义(P 0.01)，而到24 h 时间点，Accutase 消化的细胞凋亡率经 Annexin V/碘化丙啶、Hoechst 33342 活细胞染色两种方法检测已经达到 50%，而胰蛋白酶消化后的细胞凋亡率在此时间点维持在 15%20%。Accutase 消化后的 NSCs 生长 4 d 后，克隆形成率和神经球直径分别为(7.83 1.32)%和(43.5 9.76)m，均显著低于胰蛋白酶传代组的(19.22 3.66)%和(58.4 18.73)m(P 0.01)。结论虽然台盼蓝染色显示 Accutase 消化神经球后的细胞存活比胰蛋白酶更多，但消化后 24 h 内，Accutase 消化的细胞凋亡率显著升高，最终神经球新克隆形成率低，直径更小。胰蛋白酶消化振荡打散神经球后的凋亡率较 Accutase 具有明显优势;神经球消化后台盼蓝即时染色的结果不足以预示后期 NSCs 凋亡率。关键词:神经干细胞;神经球;Accutase;胰蛋白酶;凋亡中图分类号:392.2+8文献标志码:A文章编号:1000-503X(2015)02-0185-10DOI:10.3881/j.issn.1000-503X.2015.02.009Effect of Accutase or Trypsin Dissociation on the Apoptosis of HumanStriatum-derived Neural Stem CellsLI Ting1，2，LI Chen1，ZHANG Cui-ying1，ZHAO Jie31Department of Physiology，Changzhi Medical College，Changzhi，Shanxi 046000，China2Department of Pathophysiology，Xiangya School of Medicine，Central South University，Changsha 410008，China3Department of Neurosurgery，Xiangya Hospital，Central South University，Changsha 410008，ChinaCorresponding author:ZHANG Cui-yingTel:0355-3151440，E-mail:;ZHAO JieTel:0731-84327039，E-mail:中 国 医 学 科 学 院 学 报186April，2015ABSTACT:ObjectiveTo observe the apoptosis of neural stem cells(NSCs)at differential time pointsafter the dissociation of neurospheres by Accutase or trypsin.MethodsThe NSCs were isolated from striatum ofhuman fetals that suffered abortion at 12-16 weeks of pregnancy.The 3rd-5thpassages of NSCs were digested byAccutase or trypsin.Only vortexing was applied，and the triturating by Pasteur pipette was avoided to attenuatethe injury to the cells during the dissociation.The single cells were then stained by Annexin V/propidium iodideand Hoechst 33342.The apoptosis rates 2 and 24 hours after passaging were evaluated.esultsThe trypan bluestaining confirmed that immediately after the dissociation，the viability of cells digested by trypsin was(83.10 6.76)%，which was significantly lower than that digested by Accutase，which was(91.65 4.43)%(P 0.05).The apoptosis of the NSCs digested by Accutase was higher than that digested by trypsin at both 2 and 24hours after passaging(P 0.01).Four days after the passaging，both the new clone formation rate and diame-ter of new spheres after trypsin digestion were significantly higher than those after Accutase digestion(P 0.01)ConclusionsAlthough the viability of NSCs immediately after the disassociation by trypsin is lowerthan that digested by Accutase，the apoptosis of NSCs subsequently caused by trypsin is lower than that causedby Accutase.Trypan blue test immediately after the disassociation can not be used as an indicator in estimating theapoptosis of NSCs during the expanding.Key words:neural stem cells;neurosphere;Accutase;trypsin;apoptosisActa Acad Med Sin，2015，37(2):185 194神经干细胞(neural stem cells，NSCs)的维持对于神经系统发育的正常进行至关重要。哺乳动物成年后，仅在海马齿状回和室管膜下区能够检测到神经干细胞，这些 NSCs 的维持与认知等高级神经活动以及嗅觉的产生等有关1-3。另有研究表明，体外利用神经干细胞可以分化为多种神经细胞的特性，通过在患者体内进行神经干细胞移植，具有治疗神经退行性疾病等多种神经系统疾病的潜力4-7。在研究各种基因对神经干细胞增殖、分化等生命活动影响过程中，不可避免地涉及 NSCs 传代培养的问题，目前常用的有剪切传代8，或者用 Accutase9、胰蛋白酶传代的方法。剪切传代过程需要将细胞置于无液体的环境中，容易增加污染危险，而且无法得到单个细胞，不利于进行转基因等操作。新的消化酶 Accutase 因为传代后用台盼蓝染色发现存活细胞显著高于胰蛋白酶传代，所以近年来 Accutase 消化逐渐成为 NSCs 消化传代的主要方法10。笔者在前期实验中发现，人类神经干细胞体外培养的自我更新率，即形成新的神经球的比率，通常小于 10%，不能成球生长的细胞必然在培养液中凋亡并逐渐死亡，显然 NSCs 传代后台盼蓝染色的高存活率没有预示出随后发生的细胞凋亡和死亡过程的程度，很有可能在传代后的一段时间里，较大量的 NSCs 经历了凋亡、死亡的过程。而且，Accutase 和胰蛋白酶传代对 NSCs 凋亡过程的影响也需要进一步了解，此外，目前对于人类 NSCs 体外生长过程中的凋亡状况缺乏详细的实验观察。常用的检测细胞凋亡的方法，例如 Annexin/碘化丙啶(propidium io-dide，PI)，Hoechst 33342 等应用于 NSCs 凋亡的特点也未深入研究过。本研究通过体外培养人类胚胎纹状体来源的 NSCs 形成神经球，并分别用 Accutase 和胰蛋白酶将神经球打散成单细胞后传代培养，观察不同时间点的 NSCs 凋亡，从而探讨不同酶消化神经干细胞对其凋亡过程的影响。材料和方法材料细胞培养试剂 DMEM/F12、DMEM、胎牛血清、牛血清白蛋白、N2、双抗(青链霉素)、消化用酶 Accutase、胰蛋白酶以及培养板铺底的层黏连蛋白等购自美国 Life technoloty 公司。碱性成纤维细胞生长因子、表皮生长因子购自美国 D 公司。铺板用多聚鸟氨酸购自 Sigma 公司。巢蛋白、Sox-2 抗体购自美国 D 公司。-型微管蛋白(-tubulin，Tuj-1)，神经 胶 质 酸 性 蛋 白(glial fibrillary acidic protein，GFAP)抗体购自美国 Promega 公司。Annexin V、Ho-echst 33342 和 PI 染色试剂盒购自美国 B D 公司。神经干细胞培养和鉴定取12 16 周自然流产的新鲜人胚胎(由长治医学院附属和平医院产科提供，经长治医学院医学伦理委员会批准，获患方签署知情同意书)，无菌操作下取出纹状体，在 Hank s 平衡盐Accutase 和胰蛋白酶消化传代对人胚纹状体来源神经干细胞凋亡的影响Vol.37 No.2187溶液中漂洗掉血迹。剪碎后用巴斯德管轻轻吹打 2 3次，于 75 m 孔径滤网过滤，去除组织块和细胞团等，制成单细胞悬液，经台盼蓝染色镜下计数活细胞，按(0.5 1)105/cm2密度接种于细胞培养皿中培养，用于 NSCs 的培养液成分包括:DMEM/F12+B27+20 ng/ml 碱性成纤维细胞生长因子+20 ng/ml表皮生长因子+左旋谷氨酰胺+双抗10。原代培养2 3 d 后会有大量聚集而成的细胞团，第1、2 次传代采用剪切和巴斯德管吹打的机械方法，第 2 次传代后调整细胞密度为(2 4)104/cm2，置于37，5%CO2环境中培养，每 2 天半量换液。为进行染色鉴定，将传代后培养3 d 的神经球移至预先用20 g/ml 多聚鸟氨酸和 20 g/ml 层黏连蛋白包被过的 24 孔板中。用NSCs 细胞培养基继续培养。培养 7 d，进行神经干细胞巢蛋白，Sox-2 特异性标志物检测。一抗分别为抗人巢蛋白 IgG(1400)、Sox-2 IgG(1400)。40 倍荧光显微镜下于6 9 个点摄像计数，取其平均值。计数后计算巢蛋白、Sox-2 阳性细胞占全部细胞的百分数。酶消化过程消化需要达到的标准是尽量打散神经球获得单细胞，同时尽量避免消化对细胞的损伤。预实验显示，0.25%胰蛋白酶的破坏力较强，甚至少于 1 min 的时间就会导致多量细胞死亡;而 Accutase是一种消化能力较弱的酶，对其进行稀释不利于其消化作用。所以本研究使用 0.05%胰蛋白酶和所购Accutase 原液。对于培养时间较长，例如超过 1 周的致密神经球，无论胰蛋白酶还是 Accutase 通过 8 10 min的消化经常还会剩余部分未被打散的细胞团，对于分析结果不利。研究中采用第 3 5 代，传代后3 4 d 的神经球，此时新神经球明显形成，但不是非常致密，易于被胰蛋白酶或者 Accutase 分散开。由空调控制的23 25 室温情况下，收集神经球，离心去掉培养基，PBS 洗 1 遍。加胰蛋白酶或者 Accutase 后，在振荡器上间断涡旋震荡，0.05%胰蛋白酶需要 3 5 min、Accutase 通常需要 5 7 min 可分散神经球。一旦无肉眼可见的神经球，立即加 5 倍体积完全培养基，离心去除含酶的消化液。凋亡检测凋亡检测时间点为传代后第 2、24 小时。在预实验中显示神经球打散后的凋亡进展速度较快，在传代后次日即达到 50%。选择传代后 2 h 用来代表酶消化后早期的状况，选择 24 h 的原因在于呈现较多表现为核质浓缩、甚至碎裂的凋亡中后期的细胞，并整体上展示凋亡细胞数量和严重程度上的进展。Annexin V/PI 染色:第3 代 NSCs 形成的神经球传代 4 d 后经 Accutase 或胰蛋白酶打散后贴壁培养，细胞密度5 104/cm2，于2、24 h 立即进行 Annexin V 和PI 染色测定。具体操作过程按照试剂盒的要求简述如下，弃去培养液。用孵育缓冲液洗涤 1 次，加入结合有异硫氰酸荧光素(fluorescein isothiocyanate，FITC)的 Annexin V 染液和 PI 染液室温下避光孵育 10 min，期间轻柔震荡混匀。染色完成后不可洗涤，在 1 h 内直接用 488 nm 波长为激发光，于 515 nm 波长检测FITC 荧光。Hoechst 33342 活细胞染色:第 3 代 NSCs 形成的神经球经 Accutase 或胰蛋白酶打散后贴壁培养，细胞密度 5 104/cm2，于 2、24 h 立即进行 Hoechst 33342染色测定。贴壁细胞用 1 mg/ml Hoechst 33342 室温作用 10 min，荧光显微镜下观察并计数凋亡率，或称凋亡指数。每个样本随机观察 10 20 个视野进行计数。凋亡指数=凋亡细胞数/细胞总数 100%。细胞的克隆形成数和新生神经球的直径检测传代后新神经球形成率和新神经球直径可以代表原神经球中具有克隆形成能力的 NSCs 的数量和增殖能力。本研究用这些定量数据检测 Accutase 和胰蛋白酶消化对 NSCs 的影响11。将两种酶消化传代后的 NSCs 以相同的密度(3000/孔)分别接种于 96 孔板中，培养1 周后，在 100 倍显微镜下计数每个孔内形成的新克隆总数，新克隆以细胞数8 个为标准。将 96 孔板底面划分为 9 个面积近似的区域，每个区域随机取 1 个视野并照相，用图像分析软件测量图像中新生神经球的直径。比较两种酶消化后的神经干细胞在克隆形成率和新生神经球直径方面的区别。细胞分化观察两种酶消化后第 4 天，将无血清培养的神经干细胞球接种到铺有 20 g/ml 层黏连蛋白和 20 g/ml 多聚鸟氨酸的 24 孔培养板上，使其贴壁。加入分化培养基 DMEM/F12+B27+1%胎牛血清+谷氨酰胺，连续培养 14 d，每 2 天半量换液。分化完成后进行神经元标志物 Tuj-1、神经胶质细胞标志物GFAP 的免疫荧光染色。取神经球周围放射状的单层细胞区中间部分进行计数，40 倍荧光显微镜下于 6 9 个点照相计数，取其平均值。计数后计算 GFAP、Tuj-1 阳性细胞占全部细胞的百分数。统计学处理采用 SPSS 13.0 统计软件，对两组实验数据进行配对样本 t 检验，实验均重复 3 次，实验数据以均数 标准差表示。P 0.05 为差异有统计学意义。中 国 医 学 科 学 院 学 报188April，2015结果NSCs 的体外培养和鉴定结果人胚胎纹状体NSCs 在无血清培养基中原代培养2 3 d，即有“神经球”形成。神经球较松散、形态不规则，大小不一，不排除由多个细胞聚集而成，还不是严格意义上的单克隆神经球。神经球的周围有散在的单个细胞(图1A)。随着神经球不断增大，当其直径达 200 300m 时，用剪切法传代。从第 3 代开始用 Accutase 或胰蛋白酶传代，传代后细胞生长良好，代谢较快，约3 d 后即可重新长成球形，即可进行再次传代，随着传代次数的增加，神经球变得致密，周边散在的单个细胞，随着换液而逐渐减少(图 1B)。每次传代后都有多量细胞不能形成新的神经球，Accutase 消化的NSCs 形成新的克隆的形成率只有 6%8%。这在对NSCs 进行染色鉴定或分化前的贴壁培养时更加明显，贴壁的 NSCs 呈现扁平和梭形倾向，周围可见明显的圆形单个细胞(图 1C)。对培养的 NSCs 的免疫荧光染色验证显示，培养细胞高表达 NSCs 的标志抗原巢蛋白(图 1D、1E、1F)和 Sox-2(图 1G、1H、1I)，巢蛋白和 Sox-2 的阳性细胞数均 95%。传代 2 h 后的凋亡检测结果神经球被酶消化后即时进行台盼蓝检测，结果显示 Accutase 消化后的细胞大于(91.65 4.43)%的都是拒染的活细胞，而胰蛋白酶消化后的细胞只有(83.10 6.76)%是拒染的，二者差异具有统计学意义(P 0.05)。Accutase消化传代后2 h，正常细胞为圆形，体积较大(图 2A)，直径达到(16.3 2.4)m，不被 Annexin V/PI 着色，Hoechst 33342 染色为弱蓝色(图2B)。作为凋亡的标志物，Annexin V FITC 绿色和 Hoechst 33342 高蓝只要具有其中之一，就是凋亡细胞。在传代后 2 h 检测到具NSCs:神经干细胞;DAPI:4，6-联脒-2-苯基吲哚NSCs:neural stem cells;DAPI:diamidino-phenyl-indoleA.悬浮培养的第 2 代的神经球;B.长时间培养的神经球;C.传代后贴壁培养的神经干细胞;D.神经球的巢蛋白染色;E.同一视野的细胞核 DAPI 染色;F.D 和 E 的合并图;G.贴壁生长的神经干细胞 Sox-2 染色;H.同一视野光镜下的 NSCs;I.G 和 H 合并图显示培养的 NSCs 为 Sox-2 阳性A.neurospheres of passage 2 in suspension culture;B.with the elongation of culture time，the single cells around the spheres become less andless;C.the NSCs were cultured adherently after passaging;D.identification of neurospheres by nestin staining;E.DAPI staining of the sameview-field;F.merged image of D and E;G.the Sox-2 staining of the adherently cultured neurospheres;H.phase contrast of NSCs at the sameview-field;I.merged image of G and H图 1NSCs 的体外培养和鉴定Fig 1In vitro culture and identification of NSCsAccutase 和胰蛋白酶消化传代对人胚纹状体来源神经干细胞凋亡的影响Vol.37 No.2189有 Hoechst 33342/PI 染 色 的 凋 亡 NSCs，其 直 径 为(8.72 1.43)m，比正常细胞显著缩小。此时的凋亡细胞表现为Annexin V 阳性(图2C)，或者Hoechst 33342 高蓝色和 PI 低红色(图 2B、2D)。Annexin V 染色和 Ho-echst 33342 以及 PI 的红色均可有重叠，但并非所有Annexin V 染色均和 Hoechst 33342 染色重叠(图 2B 2H)，Annexin V 染色和 PI 重合(图2H)，但未和 Ho-echst 33342 染色重叠(图 2F)。用胰蛋白酶消化的神经球，在消化后 2 h 可以明显看到细胞形态更完整(图 2I、2M)，部分细胞碎裂后释出的 DNA 在 Hoechst33342 染色下形成的拖尾痕迹(图 2J)，说明消化过程中有较多的细胞死亡，这一现象和用胰蛋白酶消化后台盼蓝染色显示的死亡细胞较多相吻合。胰蛋白酶消化的神经球形成的单细胞，Annexin V 着色的细胞染色较浅(图 2K)和 Hoechst 33342、PI 的染色不完全重叠(图 2N、2P);PI 的染色也较弱(图 2L)，但PI 和 Hoechst 33342 的高蓝色重叠形成双标记(图 2L、2O)。此时间点神经球经过 Accutase 消化后，通过计数显示，Annexin V 染色阳性的细胞为细胞总数的(23.75 5.21)%，以 Hoechst 33342/PI 染色确定的凋亡率为(28.63 6.24)%，二种方法的检测结果差异无统计学意义。经过胰蛋白酶消化 Annexin V 染色和Hoechst 33342 染色计数出的凋亡率为(11.53 3.63)%和(9.35 2.26)%，二种方法的检测结果差异无统计学意义。无论用何种凋亡鉴定方法，Accutase 消化后的凋亡率都显著高于胰蛋白酶(P 0.01)。传代 24 h 后的凋亡检测结果随着传代后时间的延长，用 Accutase 消化的 NSCs 的凋亡率明显增加，到24 h 达到50%60%。表现为部分细胞形态开始皱缩(图 3A)，Hoechst 33342 染成高蓝色的细胞核也比正常细胞核缩小(图3B)。和传代后2 h 比较，AnnexinV 染色更加明显(图3C)，同时，PI 活细胞染色的红色也更加显著(图3D)。从 Hoechst 33342 和光镜的合并图可以看出，Accutase 消化后的绝大多数的细胞核染色都可以和光镜中的细胞轮廓相对应(图 3E)。但是少数细胞没有明确的细胞核染色(图 3E、3F、3I、3K)，这些细胞在相应的 Annexin V 染色中显示绿色，但是在 PI 的染色中未着色，说明这些细胞的细胞核结构已经破坏，虽然可以看到细胞轮廓，但是已经开始崩解，Annexin V 染到的是尚未完全碎裂的细胞膜结构，这些细胞已经不是通常意义上的凋亡细胞(图3F)，而应当归入死亡并开始碎裂的细胞范围内，所以在凋亡细胞计数中未计算在内。此外，Hoechst33342 的亮蓝色和 Annexin V 携带 FITC 荧光(图 3F)以及和 PI 的红色荧光的重合率达到了 98%(图 3G)。与传代后 2 h 两种酶消化过的 NSCs 形态相似不同，在传代后 24 h，胰蛋白酶消化的 NSCs 细胞形态维持正常的数量比 Accutase 消化组更多(图 3I)。Hoechst33342 染色低蓝色(图3J)、Annexin V 阴性(图3K)，是本研究界定的正常细胞。Annexin V 阳性和/或 Ho-echst 33342 染色后为高蓝色的细胞仍是凋亡细胞(图3J)，细胞核碎裂为多瓣(图 3J)，Annexin V 使凋亡细胞着色(图 3K、3L)。Hoechst 33342 和光镜的合并图可见，到 24 h，即使已经显示高蓝色的凋亡细胞，其细胞形态依然相对于 Accutase 消化的 NSCs 比较完整(图 3M)。此时已经有部分细胞碎片存在，这些碎片仍然可以是 Annexin V 染色阳性(图 3N)。PI 染色和 Annexin V(图 3P)以及 Hoechst 33342 染色的重叠性较高(图 3O)。此时间点经过 Accutase 消化后 An-nexin V 染色和 Hoechst 33342 染色计数的凋亡率分别为(51.52 9.8)%和(49.32 8.71)%。而用胰蛋白酶消化后 Annexin V 染色和 Hoechst 33342 染色计数的凋 亡 率 分 别 为(18.98 3.50)%和(17.63 2.72)%。不同的染色方法得到的凋亡率差异无统计学意义，Accutase 消化后的 NSCs 凋亡率明显高于胰蛋白酶消化后的凋亡率(P 0.01)。NSCs 传代后凋亡的特点Hoechst 33342 对凋亡细胞的染色经历了逐渐变化的过程，正常细胞为 Ho-echst 33342 低蓝色、PI 阴性、Annexin V 阴性，体积较大(图 3I)，凋亡开始后逐渐出现 Annexin V 和 PI染色(图 3F)，随后随着凋亡的进行 Hoechst 33342 逐渐变为高蓝色，细胞逐渐皱缩，细胞核也逐渐缩小(图 3B、3J)、蓝色进一步增强，与此相适应，PI 染色的变化也由低红色逐渐加强。最后细胞核崩解，蓝色和红色均变弱消失，因为 Hoechst 33342 的消失慢于PI，能观察到低蓝色而无红色的死亡细胞(图 3B)，但 Hoechst 33342 的蓝色也会很快消失(图 3I 3K)，随后细胞彻底崩解。所以判断 NSCs 传代后凋亡的依据，应是具有 Annexin V 染色，或者 Hoechst 33342 高蓝色。神经干细胞的克隆形成数和新生神经球的直径两种酶消化后的神经干细胞以相同的密度(3000/孔)分别接种于 96 孔板中，培养 96 h 计数克隆形成数和新生神经球直径。培养 96 h，胰蛋白酶(图 4A 4C)和 Accutase(图 4D 4F)消化后的 NSCs 相比较，新克隆较多，周边凋亡细胞较少。Hoechst 33342 不仅可中 国 医 学 科 学 院 学 报190April，2015PI:碘化丙啶;黑色三角形:正常神经干细胞;白色三角形:Hoechst 33342 亮蓝色的凋亡细胞;白色箭形:Annexin V+/Hoechst33342-细胞;加粗白色箭形:PI 阳性细胞PI:propidium iodide;Black triangle:normal NSCs;White triangle:Hoechst 33342 positive apoptotic cells;White arrow:Annexin V+/Ho-echst 33342-cells;Bold white arrow:PI positive cellsA H.Accutase 消化;I P.胰蛋白酶消化;A.光镜下的 NSCs，正常细胞为圆形，形态完整(黑色三角形);B.Hoechst 33342 染色后，可见亮蓝色凋亡细胞(白色三角形)和淡蓝色正常细胞;C.Annexin V 染色，部分 Annexin 阳性细胞没有 Hoechst 33342 着色(白色箭形);D.PI 染色(加粗白色箭形);E.A 和 B 合并图，凋亡细胞核在胞浆内(白色三角形);F.B 和 C 的合并图，E 中部分失去 Hoechst 33342 的细胞仍然是 Annexin V 阳性(白色箭形);G.B 和 D 的合并图，绝大多数 Hoechst 33342 阳性细胞也是 PI 阳性;H.C 和 D 的合并图，Annexin V 和 PI 重合良好;I.光镜下胰蛋白酶传代的 NSCs 大多为正常细胞，圆形、体积较大、没有皱缩;J.Hochest 33342 染色，部分凋亡细胞显示为高亮蓝色(白色三角形);K.Annexin V 染色很暗，但仍可见;L.PI 染色(加粗白色箭形);M.I 和 J 的合并图;N.J 和 K 的合并图，有弱 AnnexinV 阳性物质并不是完整的细胞;O.J 和 L 的合并图;P.K 和 L 的合并图A-H.Accutase passaging;I-P.trypsin passaging;A.phase contrast of NSCs，normal cells are round and integrate(black triangle);B.afterHoechst 33342 staining，the bright blue apoptotic cells(white triangle)exist together with dim blue normal cells;C.staining of Annexin V，some Annexin V+cells lost their nucleus staining of Hoechst 33342(white arrow);D.the staining of PI(bold white arrow);E.merged imageof A and B，the apoptotic nucleus were located within cytoplasm(white triangle);F.merged image of B and C，some cells which lost Hoechst33342 staining in E were still positive for AnnexinV(white arrow);G.merged image of B and D，most of the Hoechst 33342+cells are positivefor PI;H.merged image of C and D，the green staining of Annexin V overlapped well with PI;I.most of the NSCs after passaging by trypsin arenormal，round，big and without shrinkage;J.some apoptotic cells are stained bright blue by Hoechst 33342(white triangle);K.Annexin Vstaining was dim but detectable;L.PI staining of the same view field(bold white arrow);M.merged image of I and J;N.merged image of Jand K note that the tiny Annexin V+materials are not whole cells;O.merged image of J and L;P.merged image of K and L图 2NSCs 传代 2 h 后的凋亡检测Fig 2NSCs apoptosis at 2 hours after Accutase and trypsin digestionAccutase 和胰蛋白酶消化传代对人胚纹状体来源神经干细胞凋亡的影响Vol.37 No.2191黑色三角形:正常细胞;白色三角形:Hoechst 33342 亮蓝色的凋亡细胞;白色箭形:部分凋亡细胞失去了 Hoechst 33342 染色，但有Annexin V 染色;#1#8:NSCs 凋亡进展的代表性状态Black triangle:normal NSCs;White triangle:Hoechst 33342 positive apoptotic cells;White arrow:Annexin V+/Hoechst 33342-cells;#1-#8:representive image of NSCs apoptosis developmentA H.Accutase 消化;I P.胰蛋白酶消化;A.光镜下的 NSCs;B.Hoechst 33342 染色;C.Annexin V 染色;D.PI 染色;E.A 和 B 合并图，有些细胞没有 Hoechst 33342 核染色，但细胞尚未解体(白色箭形);F.B 和 C 的合并图，有细胞失去了 Hoechst 33342 的高蓝色，仍为 Annexin V 阳性(白色箭形);G.B 和 D 的合并图，绝大多数 Hoechst 33342 阳性细胞也是 PI 阳性;H.C 和 D 的合并图，An-nexin V 的绿色和 PI 的红色重合良好;I.绝大多数 NSCs 为正常状态(黑色三角)，圆形无皱缩;J.Hoechst 33342 亮蓝色的凋亡细胞具有不同的染色强度和细胞核完整性(白色三角形);K.与 Accutase 消化后的细胞类似，仍然可见 Annexin V+、Hoechst 33342的细胞(白色箭形);L.PI 染色;M.I 和 J 的合并图，亮蓝色细胞的直径比正常细胞显著缩小;N.Hoechst 33342 和 Annexin V 染色合并图，可见一些 Annexin V+的物质不是完整细胞;O.PI 和 Hoechst 33342 合并图;P.PI 和 Annexin V 合并图A-H.Accutase digestion;I-P.trypsin digestion;A.phase contrast of NSCs;B.the staining of Hoechst 33342;C.Annexin V staining;D.thered staining of PI;E.merged image of A and B，some cells lost nucleus staining，but still be found as a integrate cell(white arrow);F.merged image of B and C，the cells lost Hoechst 33342 staining in E were still positive for Annexin V(white arrow);G.merged image of Band D，most of the Hoechst 33342+cells could be found also positive for PI;H.merged image of C and D，the green staining of Annexin V cov-ered all the red of PI;I.most of the NSCs are normal(black triangle)，round in shape and without shrinkage;J.the apoptotic cells with brightHoechst 33342 blue are different in their stain