盐酸小檗碱对人血红蛋白拟过氧化物酶活性的影响_罗义佳.pdf

文章编号:1673-2995(2023)04-0249-04论著盐酸小檗碱对人血红蛋白拟过氧化物酶活性的影响罗义佳，耿泽男，易先德，姜鑫宇，许鹤译，刘雨柯，赵国志，隋春红*(吉林医药学院药学院，吉林 吉林132013)摘要:目的明确盐酸小檗碱(berberine hydrochloride，BH)对人血红蛋白(hemoglobin，Hb)拟过氧化物酶(peroxidase，POD)活性的影响并分析其作用机制。方法采用紫外吸收光谱法测定 Hb 拟 POD 活性，确定最适 pH 和最适温度。采用不同浓度 BH与 Hb 相互作用后测定 POD 活性，并通过 Lineweaver-Burk 双倒数作图判定其作用机制。采用荧光光谱法测定 BH 与 Hb 相互作用后荧光淬灭常数，判定荧光淬灭方式，计算结合位点数和结合常数。结果Hb 拟 POD 活性发挥的最适 pH 为 6 37，最适温度为 38 4。BH 与 Hb 相互作用后 POD 活性的米氏常数 Km和最大反应速度 Vmax均变小，Km/Vmax比值不变。荧光淬灭常数随温度升高而变小，即 BH 可静态淬灭 Hb 荧光。BH 与 Hb 具有 1 个结合位点，在 25、30、37 下的结合常数分别为为 8 63 103、8 25 103、7 39 103L/mol。结论BH 可反竞争性抑制 Hb 拟 POD 活性。关键词:盐酸小檗碱;人血红蛋白;过氧化物酶中图分类号:285文献标志码:AEffect of berberine hydrochloride on peroxidase like activity of human hemoglobinLUO Yijia，GENG Zenan，YI Xiande，JIANG Xinyu，XU Heyi，LIU Yuke，ZHAO Guozhi，SUI Chunhong*(School ofPharmacy，Jilin Medical University，Jilin City，Jilin Province，132013，China)Abstract:ObjectiveTo determine the effect of berberine hydrochloride(BH)on peroxidase(POD)-like activity of human hemoglobin(Hb)and its mechanism MethodsThe POD-like activity of Hb was determined by ultraviolet absorption spectroscopy to defined theoptimum pH and optimum temperature The POD activity was measured using different conentrations of BH mixed with Hb，and the mecha-nism of action was revealed by Lineweaver-Burk double reciprocal plot Fluorescence spectroscopy was used to determine the fluorescencequenching constant after BH and Hb interaction for identifying the fluorescence quenching mode and calculating the number of bindingsites and the binding constant esultsThe optimum pH and optimum temperature of POD-like activity exhibited by Hb were 6 37 and384，respectively The Michaelis constant Kmand maximum reaction rate Vmaxof POD activity decreased after the interaction of BHand Hb，and the ratio of Km/Vmaxdid not change The fluorescence quenching constant decreases with increaing temperature，indicating thatBH could statically quench the Hb fluorescence BH had only one binding site with Hb，and the binding constants were 8 63 103、8 25 103and 7 39 103L/mol at 25、30 and 37，respectively ConclusionBH could inhibit the POD-like activity of Hb in an anti-com-petitive mannerKey words:berberine hydrochloride;human hemoglobin;peroxidase新生儿黄疸是指出生 28 d 内因胆红素累积引起的皮肤、巩膜等器官黄染的现象，是新生儿中较为常见的疾病。超过一半的新生儿和 80%的早产儿出现黄疸的临床症状1。患病原因主要是红细胞破坏后释放出游离的血红蛋白(hemoglobin，Hb)增多，导致胆红素代谢异常，引起血液中胆红素含量的增高，继而出现皮肤黏膜及巩膜黄染的病症。游离的 Hb 具基金项目:2022 年度国家级大学生创新创业训练计划项目(202213706015)作者简介:罗义佳(2002 )，男(汉族)，本科生。通信作者:隋春红，副教授(E-mail:645692229 qq com)有拟过氧化物酶(peroxidase，POD)活性，能催化产生过多的氧自由基并对人体造成伤害2。因此降低 Hb拟 POD 活性可有效缓解新生儿黄疸发病过程中的氧化损伤。民间常用黄连治疗新生儿黄疸，小檗碱为黄连的主要有效成分，盐酸小檗碱(berberine hydrochlo-ride，BH)是目前主要的上市药品。黄疸动物模型研究发现，BH 可降低动物血浆中的游离 Hb 含量，从而间接降低了胆红素的产生3，还可发挥抗氧化保护作用4。本实验主要明确 BH 对人 Hb 拟 POD 活性的影响并分析其作用机制，为盐酸小檗碱在临床用药提供实验依据。942第 44 卷第 4 期2023 年 08 月吉林医药学院学报JournalofJilinMedicalUniversityVol 44No 4Aug 2023DOI:10.13845/ki.issn1673-2995.2023.04.0221材料与方法1 1主要试剂与仪器人血液样本来源于吉林医药学院直属医院，采血前均与体检者签署了知情同意书，实验获吉林医药学院伦理委员会批准;愈创木酚购于天津市光复精细化工研究所;过氧化氢购于辽宁泉瑞试剂有限公司;盐酸小檗碱购于上海博顿生物化工有限公司。UV-1800PC 紫外-可见分光光度计，翱艺仪器(上海)有限公司;F-6000 型荧光分光光度计，日本岛津公司。12血红蛋白拟过氧化物酶最适 pH 和最适温度的测定取新鲜抗凝全血 3000 r/min 离心 10 min，弃血浆，3 倍于红细胞体积的生理盐水清洗 2 次，加入 10倍体积蒸馏水，使红细胞破碎，过滤即得 Hb 溶液。紫外吸收光谱法测定 415、541 和 576 nm 处的特征吸收峰值，由公式 CHb=(A 稀释倍数)/计算 Hb 含量。公式中 CHb为 Hb 含量(mmol/L)，A 为吸光度值，为吸光系数，415=125 L/mmol、541=13 5 L/mmol、576=14 6 L/mmol5。采用愈创木酚法测定Hb 拟 POD 活性6，配制64 mg/L 的 Hb，测定470 nm处 吸 光 度 值，按 公 式 U/mgprotein=A(t 0 01)(CHb V MHb)计算酶的比活力。公式中 U/mg protein 为酶的比活力(molmin1mg1)，A 为反应时间内吸光度变化，t 为反应时间(min)，CHb为 Hb 含量(mmol/L)，V 为样品体积(L)，MHb为Hb 分子量(按 64 500 计算)。在 pH 分别为 3、4、5、6、7、8、9 条件下测定 POD 活性确定最适 pH。在温度分别为 20、30、40、50、60、70、80 条件下测定 POD活性确定最适温度。1 3盐酸小檗碱与血红蛋白作用的酶促动力学测定用 0、7 5、15、30、60 mol/L 的 BH 分 别 与0 0625、0 125、0 25、0 5、1 mol/L 的 Hb 相互作用，测定 470 nm 处吸光度值。用 A 表示反应速度 v，以1/v 为纵坐标，以 Hb 含量的倒数 1/CHb为横坐标，进行 Lineweaver-Burk 双倒数作图，分析米氏常数 Km、最大反应速度 Vmax和 Km/Vmax比值变化。1 4盐酸小檗碱与血红蛋白作用的荧光光谱测定用 0、10、20、30、40、50、60 mol/的 BH 与1 mol/L的 Hb 相互作用，荧光光谱法测定 25、30、37 条件下荧光强度，激发波长(Ex)为 453 nm，发射波长(Em)为327 nm7。根据 Stern-Volmer 方程式F0/F=1+KSV Q 计算猝灭常数，通过不同温度下KSV的变化以及 KSV与最大动态猝灭常数 KSV(max)比较确定淬灭类型，再用 Double-Logarithm 方程式 lg(F0/F 1)=nlg Q+lgKA计算结合位点数和结合常数。以上方程式中 F0和 F 分别为未加和加入 BH 时的荧光强度，KSV为猝灭常数(L/mol)，n 为结合位点数，KA为结合常数(L/mol)，Q为 BH 浓度(mg/L)。KSV(max)=Kq(max)0=200 L/mol，最大扩散碰撞猝灭速率常数 Kq(max)=2 0 1010L/(mols)，无 BH 时荧光寿命 0=1 108s8。1 5数据处理实验数据采用 SPSS 21 0 软件进行统计分析，数据以“平均值 标准误”表示。图形曲线采用 Origin9 1 软件拟合处理。2结果2 1血红蛋白拟过氧化物酶的最适 pH 和最适温度在不同 pH 和不同温度条件下测定 Hb 拟 POD活性分别见图 1 和图 2，经高斯曲线拟合计算最适pH 为 6 37，最适温度为 38 4。图 1不同 pH 条件下血红蛋白拟过氧化物酶的比活力图 2不同温度条件下血红蛋白拟过氧化物酶活性052吉林医药学院学报2023 年 08 月第 44 卷2 2盐酸小檗碱与血红蛋白作用的酶促动力学机制BH 与 Hb 相互作用的 Lineweaver-Burk 双倒数作图见图3。由图可见，随着 BH 由低到高浓度的加入，Hb 拟 POD 的 Km值和 Vmax值均逐渐减小，而 Km/Vmax比值不变，故 BH 与 Hb 相互作用的机制为反竞争性抑制。图 3盐酸小檗碱与血红蛋白作用的 Lineweaver-Burk 双倒数作图2 3盐酸小檗碱与血红蛋白作用的荧光光谱分析不同浓度的 BH 在 25、30、37 条件下与 Hb 相互作用的荧光强度见图 4，Stern-Volmer 做图见图 5，Double-Logarithm 做图见图 6，计算所得猝灭常数KSV、结合位点数 n 和结合常数 KA见表 1。发现在相同温度下，BH 与 Hb 相互作用的荧光强度随着 BH浓度的增加而降低(P 0 01)，说明 BH 对 Hb 的内源荧光有荧光猝灭效应，可判断 BH 和 Hb 之间发生了相互作用。当 BH 浓度高于 30 mol/L 时，BH 与Hb 相互作用的荧光强度随着温度升高而增强(P 0 01)，淬灭常数 KSV(max)随温度的升高而降低，且均远大于最大动态猝灭常数 KSV(max)，故判断 BH 与 Hb相互作用时荧光淬灭的类型为静态猝灭。在 25、30、37 条件下计算的结合位点数均约等于 1，初步判断BH 与 Hb 之间只存在 1 个相互作用的结合位点。图 4盐酸小檗碱与血红蛋白作用的荧光强度图 5盐酸小檗碱与血红蛋白作用的 Stern-Volmer 图图 6盐酸小檗碱与血红蛋白作用的 Double-Logarithm 图表 1盐酸小檗碱与血红蛋白作用的荧光光谱分析温度/猝灭常数 KSV103/(L/mol)结合位点数/n结合常数 KA103/(L/mol)257 891 038 63306 911 058 25375 211 097 393讨论小檗碱是中药黄连中提取的生物碱，国内外对BH 的药理作用及临床应用进行了很多相关研究，发现 BH 具有多种生物学效应，如抗氧化、抗炎、抗肿瘤、抗纤维化、降血糖和降血脂作用9。其中 BH 能有效地降低血浆中游离血红蛋白，参与和调节胆红素代谢，发挥退黄作用3-4。本研究利用 Hb 具有拟POD 活性这一特征，通过检测 Hb 拟 POD 活性和荧光淬灭现象，初步分析 BH 与 Hb 相互作用的机制。发现 BH 可有效抑制 Hb 拟 POD 活性，其作用机制为反竞争性抑制，BH 可通过与 Hb 结合并促进 Hb 内源荧光淬灭，主要为静态猝灭效应。上述结论从酶学角(下转第 254 页)152第 4 期罗义佳，等 盐酸小檗碱对人血红蛋白拟过氧化物酶活性的影响用，保护细胞免受氧化应激损伤10。本研究中 HCF组大鼠与 AD 模型组大鼠比较，MDA 含量显著下降，肝组织 SOD 和 CAT 活力均显著上升，脑组织 SOD 活力显著上升，表明 HCF 可显著提高机体抗氧化酶活力，特别是提高 CAT 活力发挥抗菌素氧化作用。参考文献:1 SE THOE E，FAUZI A，TANG Y Q，et al A review on ad-vances of treatment 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cas-cade reaction between SOD and CAT and its tissue regen-eration effect J J Control elease，2022，344:160-172(收稿日期:2023-03-22)(上接第 251 页)度揭示对 BH 与 Hb 相互作用的机制提供基础数据，为 BH 在临床治疗新生儿黄疸提供了理论依据，为BH 在医药领域中的研究和应用提供了重要参考。参考文献:1 IU S L，CHAN L W，KWONG A N Clinical and biochemi-cal characteristics of infants with prolonged neonatal jaun-dice J Hong Kong Med J，2018，24(3):270-276 2 MINAI-TEHANI D，TOOFANI S，YAZDI F，et al Inhibi-tion of pseudoperoxiadse activity of human red blood cellhemoglobin by methocarbamolJ Int J Biol Macromol，2017，94(Pt B):788-792 3 张永，黎红平，李慈梅 盐酸小檗碱对血浆游离血红蛋白的影响 J 现代医院，2012，12(8):77-78 4 刘春芳，乔利，王艳伟，等 黄连和小檗碱对大鼠红细胞氧化性溶血及其抗氧化系统的影响 J 中国实验方剂学杂志，2010，16(6):156-159 5 OLIVEIA J B S，AMOS L，SOUZA C O，et al Initial bio-physical characterization of Amynthas gracilis giant extra-cellular hemoglobin(HbAg)J Eur Biophys J，2020，49(6):473-484 6LEE J H，KASOTE D M，JAYAPAKASHA G K，et alEffect of production system and inhibitory potential of aro-ma volatiles on polyphenol oxidase and peroxidase 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