稳定高效合成多巴胺的骨髓间充质干细胞系的创建和鉴定_刘阳.pdf

刘阳 等/稳定高效合成多巴胺的骨髓间充质干细胞系的创建和鉴定 Chinese Journal of Biotechnology http:/ Apr.25,2023,39(4):1773-1788 DOI:10.13345/j.cjb.220718 2023 Chin J Biotech,All rights reserved 资助项目：国家自然科学基金(81771381)；安徽省高校自然科学基金项目(KJ2021ZD0085，KJ2021A0774，KJ2021A0784)；安徽省重点研发计划(2022e07020030，2022e07020032)；蚌埠医学院研究生科研创新计划项目(Byycx21050)；国家级大学生创新创业训练项目资助(202110367043，202110367044，20210367058)；蚌埠医学院厅重点科研平台开放课题(AHTT2022B001)This work was supported by the National Natural Science Foundation of China(81771381),the Natural Science Foundation of Colleges and Universities of Anhui Province(KJ2021ZD0085,KJ2021A0774,KJ2021A0784),the Key Research and Development Program of Anhui Province(2022e07020030,2022e07020032),the Postgraduate Research Innovation Program of Bengbu Medical College(Byycx21050),the National Innovation and Entrepreneurship Training Program for College Students(202110367043,202110367044,20210367058),and the Key Research Platform Open Subjects of the Department of Bengbu Medical College(AHTT2022B001).*Corresponding author.Tel:[phone],E-mail: Received:2022-09-07;Accepted:2022-12-14 1773 生物工程学报 稳定高效合成多巴胺的骨髓间充质干细胞系的 创建和鉴定 刘阳1，常俊彦1，王悦1，杨盼1，马彩云1，刘高峰1，郭俣2，刘长青1，王春景1*1 蚌埠医学院生命科学学院，安徽 蚌埠 233000 2 蚌埠医学院检验医学院，安徽 蚌埠 233000 刘阳,常俊彦,王悦,杨盼,马彩云,刘高峰,郭俣,刘长青,王春景.稳定高效合成多巴胺的骨髓间充质干细胞系的创建和鉴定J.生物工程学报,2023,39(4):1773-1788.LIU Yang,CHANG Junyan,WANG Yue,YANG Pan,MA Caiyun,LIU Gaofeng,GUO Yu,LIU Changqing,WANG Chunjing.Establishment and characterization of bone marrow mesenchymal stem cell lines stably synthesizing high-level dopamineJ.Chinese Journal of Biotechnology,2023,39(4):1773-1788.摘 要：创建能稳定合成多巴胺(dopamine,DA)递质的三转基因(tyrosine hydroxylase/dopamine decarboxylase/GTP cyclohydrolase 1,TH/DDC/GCH1)的 骨 髓 间 充 质 干 细 胞 系(bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs)，移植至帕金森大鼠模型脑内，为帕金森病(Parkinsons disease,PD)的临床治疗提供实验依据。通过三转基因的重组慢病毒创建能稳定合成并分泌 DA 递质的DA-BMSCs 稳定转染细胞系，利用反转录聚合酶链式反应(reverse transcription-polymerase chain reaction,RT-PCR)、蛋白免疫印迹(Western blotting)、免疫荧光等技术检测 BMSCs 中三转基因(TH/DDC/GCH1)的表达，采用酶联免疫吸附试验(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)和高效液相色谱法(high performance liquid chromatography,HPLC)检测 DA 的合成情况。染色体 G-带法检测 DA-BMSCs 的遗传稳定性。将 DA-BMSCs 移植于 6-羟基多巴胺(6-hydroxydopamine,6-OHDA)偏侧损毁帕金森大鼠模型右脑的前脑内侧束(medial forebrain bundle,MFB)区，检测其在 PD 大鼠脑内微环境中的存活、分化情况。阿扑吗啡(apomorphine,APO)诱导旋转实验检测 DA-BMSCs 移组织工程与细胞培养 ISSN 1000-3061 CN 11-1998/Q 生物工程学报 Chin J Biotech http:/ 1774 植后 PD 大鼠的运动障碍改善情况。DA-BMSCs 细胞系中 TH/DDC/GCH1 三转基因均能够稳定高效表达，而正常 BMSCs 对照组中均不表达。三转基因感染组(DA-BMSCs)和 LV-TH 感染组细胞培养上清液中 DA 浓度极其显著高于 BMSCs 空白对照组(P0.000 1)。传代后的 DA-BMSCs仍能稳定合成 DA，并保持正常二倍体核型(94.5%)。DA-BMSCs 移植 PD 大鼠脑内 4 周后，显著改善 PD 大鼠模型的运动障碍，在脑内微环境中大量存活，分化为 TH+和 GFAP+细胞，并显著上调脑移植区域的 DA 水平。本研究成功创建了能稳定分泌 DA，在大鼠脑中大量存活并分化的三转基因DA-BMSCs 细胞系，为 DA-BMSCs 工程化培养与移植治疗 PD 奠定基础。关键词：帕金森病；大鼠间充质干细胞；酪氨酸羟化酶；多巴胺脱羧酶；GTP 环化水解酶 1；多巴胺 Establishment and characterization of bone marrow mesenchymal stem cell lines stably synthesizing high-level dopamine LIU Yang1,CHANG Junyan1,WANG Yue1,YANG Pan1,MA Caiyun1,LIU Gaofeng1,GUO Yu2,LIU Changqing1,WANG Chunjing1*1 School of Life Sciences,Bengbu Medical College,Bengbu 233000,Anhui,China 2 School of Laboratory Medicine,Bengbu Medical College,Bengbu 233000,Anhui,China Abstract:A triple-transgenic(tyrosine hydroxylase/dopamine decarboxylase/GTP cyclohydrolase 1,TH/DDC/GCH1)bone marrow mesenchymal stem cell line(BMSCs)capable of stably synthesizing dopamine(DA)transmitters were established to provide experimental evidence for the clinical treatment of Parkinsons disease(PD)by using this cell line.The DA-BMSCs cell line that could stably synthesize and secrete DA transmitters was established by using the triple transgenic recombinant lentivirus.The triple transgenes(TH/DDC/GCH1)expression in DA-BMSCs was detected using reverse transcription-polymerase chain reaction(RT-PCR),Western blotting,and immunofluorescence.Moreover,the secretion of DA was tested by enzyme-linked immunosorbent assay(ELISA)and high-performance liquid chromatography(HPLC).Chromosome G-banding analysis was used to detect the genetic stability of DA-BMSCs.Subsequently,the DA-BMSCs were stereotactically transplanted into the right medial forebrain bundle(MFB)of Parkinsons rat models to detect their survival and differentiation in the intracerebral microenvironment of PD rats.Apomorphine(APO)-induced rotation test was used to detect the improvement of motor dysfunction in PD rat models with cell transplantation.The TH,DDC and GCH1 were expressed stably and efficiently in the DA-BMSCs cell line,but not expressed in the normal rat BMSCs.The concentration of DA in the cell culture supernatant of the triple transgenic group(DA-BMSCs)and the LV-TH group was extremely significantly higher than that of the standard BMSCs control group(P210 圈，即视为建模成功。细胞移植 4 周后，对各组大鼠进行 APO 诱导旋转检测，评估运动障碍改善情况。1.10 大鼠分组和细胞移植 大鼠分组：建模成功的 15 只大鼠随机分为3 组：模型组、BMSCs 组、DA-BMSCs 组，并以 5 只同等条件喂养未做任何处理的 SD 大鼠为正常对照组。细胞移植：收集细胞，PBS 溶液制成浓度约(1.25104)(1.5104)/L 细胞悬液，模型组以 PBS 溶液代替，细胞移植操作同 PD 大鼠模型制备，每只大鼠注入 8 L 细胞悬液。1.11 脑组织切片制备 取术后 4 周的 PD 大鼠，3%戊巴比妥腹腔注射麻醉后固定于手术解剖台进行心脏灌注。提前引流瓶中准备 200 mL 生理盐水，灌注针从左心室插入主动脉弓，打开流量调节器，并迅速剪开右心耳，引流血液，观察大鼠状态保证灌注通路流畅。待流出的液体澄清，肝部苍白，换用200 mL 4%多聚甲醛灌注固定。在冰上迅速剥离脑组织，4%多聚甲醛 4 继续固定 4 h，25%蔗糖 4 充分脱水，80 环境冻存。使用 OCT 刘阳 等/稳定高效合成多巴胺的骨髓间充质干细胞系的创建和鉴定 ：010-64807509： 1779 包埋剂(Sakura 公司)包埋脑组织，冰冻切片机在1220 m 切片厚度连续冠状切片，切片进行DAPI 染色观察移植细胞存活情况。1.12 数据统计 使用 Graph Pad Prism 7.0 统计学软件对各组 DA 浓度变化进行处理。组间比较采用单因素方差分析，进一步的组间两两比较采用 LSD 检验，多重比较采用 Sidak 检验。所得的实验数据用xs表示。P0.05 表示差异有统计学意义。2 结果与分析 2.1 BMSCs 的分离培养和鉴定 从大鼠骨髓中冲出 BMSCs 经过一夜贴壁培养，粘附于培养瓶底部，呈成纤维细胞样的短梭形或者双极状，部分呈旋涡状，并混有部分其他骨髓细胞(图 1A1)。继续培养 710 d 后，可见成纤维样的细胞汇聚成紧密的单细胞层。经连续传代至 P4，可获得典型的纺锤形成纤维样单细胞层，形态均一，增殖能力强(图 1A2)。传至 P6 仍具有较好的稳定性，细胞的形态和增殖能力均未见明显的形态差异(图 1A3)。P10 以后细胞逐渐呈现扁平化，胞体的轮廓不清晰，细碎颗粒感增强，增殖能力和折光性均下降。将纯化后 P4的 BMSCs 以 100/皿的细胞密度接种于细胞培养皿中培养 1014 d 左右，可明显观察到间充质干细胞的克隆样成团生长现象，用结晶紫染色后呈现紧密的细胞团结构(图1A4)。免疫荧光和 RT-PCR 检测表明，培养的BMSCs(P3)能够显著表达间充质干细胞表面抗原标志物 CD29、CD44、CD73、CD90，而不表达造血谱系细胞标志物 CD34 和 CD45(图1BC)，符合间充质来源的干细胞特征性标志物特征，表明已成功分离培养出纯化的 BMSCs。图 1 BMSCs 的细胞形态、克隆团形成以及特异性标记物的检测 Figure 1 Cell morphology,clonal cluster formation and detection of specific markers of BMSCs.A1:Cells of P0;A2:Cells of P3;A3:Cells of P6;A4:Clonal cluster of the P4 cells stained with crystal violet.B:mRNA expression levels of specific marker genes were detected by RT-PCR.C:Immunofluorescent staining of specific markers in BMSCs.ISSN 1000-3061 CN 11-1998/Q 生物工程学报 Chin J Biotech http:/ 1780、2.2 过表达 TH、DDC、GCH1 基因慢病毒载体的构建和感染 BMSCs 后荧光蛋白表达 选用第 2 代三载体慢病毒系统，以确保慢病毒载体能够安全和有效地应用于 BMSCs 细胞系。构建的携带 3 种关键酶基因的 2 种慢病毒载体示意图结构如图 2A 所示，其中 DDC 和GCH1 基因插入同一个慢病毒载体 LV-ZsGreen中，用自剪切多肽 T2A 相连，而 TH 插入另一 个慢病毒载体 LV-mCherry 中，LV-TH 过表达慢病 毒 和 对 应 对 照 病 毒 携 带 荧 光 蛋 白 基 因mCherry 和抗性基因 puro，表达红色荧光蛋白；LV-DDC-GCH1 过表达慢病毒和对应对照病毒携带荧光蛋白基因 ZsGreen 和抗性基因 BSD，表达绿色荧光蛋白。慢病毒载体上的荧光蛋白基因和抗性基因的表达均通过 EF1 启动子驱动表达。图 2 构建的慢病毒载体结构和感染 BMSCs 后荧光表达情况 Figure 2 Structure of the constructed lentiviral vectors and fluorescent protein expression of infected BMSCs.A:Structure of the constructed lentiviral vectors.B:Fluorescent protein expression of control lentivirus and single overexpressing lentivirus three days after infection of BMSCs.C:Infection efficiency of the constructed lentivirus.D:Fluorescence expression of BMSCs that could stably express two overexpressing lentiviruses or control lentiviruses simultaneously after purification.Scale bar=100 m,data was presented as xs.刘阳 等/稳定高效合成多巴胺的骨髓间充质干细胞系的创建和鉴定 ：010-64807509： 1781 慢病毒在助转剂聚凝胺的作用下感染BMSCs 细胞系 2 d 后出现荧光，3 d 后达到丰度。采用免疫荧光显微镜分析荧光蛋白的表达确定慢病毒的感染效率。如图 2B 所示，感染 BMSCs细胞系 3 d 后，可见对照病毒和目的基因慢病毒均得到良好的表达，对照慢病毒的荧光强度比目的基因慢病毒相对较强。慢病毒 LV-TH 的感染效率为 75.04%0.68%，LV-DDC-GCH1 的感染效率为 58.05%0.92%，双病毒同时感染的感染效率为 47.89%1.89%(图 2C)。BMSCs 在病毒感染3 d后经胰蛋白酶消化、传代以及冻存复苏，仍具有良好的细胞活性和较强的荧光蛋白表达，可用于建立稳定的感染细胞系。将两种慢病毒同时感染 BMSCs，感染 3 d 后根据慢病毒载体上携带的抗性基因进行抗生素筛选，得到三转基因(TH/DDC/GCH1)感染的 BMSCs 细胞系，细胞的2 种荧光蛋白表达强度明显增强(图 2D)。2.3 过表达 LV-DDC-GCH1、LV-TH 慢病毒感染 BMSCs 后目的基因表达 通 过 Western blotting(图 3A、3C)和 RT-PCR(图 3B)分析病毒感染后各实验组 TH、DDC、GCH1 的表达，结果显示 DDC 和 GCH1 图 3 慢病毒感染 BMSCs 后 TH、DDC 和 GCH1 表达 Figure 3 Expressions of TH,DDC and GCH1 genes in transduced rat BMSCs.A:Relative intensity of TH,DDC and GCH1 protein was analyzed by Western blotting in each group.B:Relative mRNA levels of TH,DDC and GCH1 were analyzed by RT-PCR.C:Relative protein expression of TH,DDC,and GCH1.D:Relative mRNA expression of TH,DDC,and GCH1.Data was presented as xs.ISSN 1000-3061 CN 11-1998/Q 生物工程学报 Chin J Biotech http:/ 1782 基因在 LV-DDC-GCH1 感染组和三转基因感染组(LV-TH+DDC-GCH1)表达，LV-TH 感染组、各对照慢病毒感染组(LV-CTR-mCherry、LV-CTR-ZsGreen)和无病毒感染的空白对照组(control)均未表达；TH 基因在 LV-TH 感染组和三转基因感染组表达，LV-DDC-GCH1 感染组、对照慢病毒感染组和 Control 组都未显出有基因的表达，符合预期结果。qRT-PCR 结果显示(图 3D)，相对于对照组，三转基因感染组的 DDC、GCH1 和 TH 基因表达量分别上升(746.90129.61)倍、(309.57 87.70)倍和(306.8882.44)倍，结果具有极显著的差异。以上结果表明创建的三转基因慢病毒感染BMSCs 细胞系，能够稳定过表达 TH、DDC 和GCH1 3 种 DA 合成途径的限速酶。2.4 各组细胞培养上清液中分泌 DA 的浓度检测 收集感染后第1代和第2代各组细胞的培养3 d 的细胞培养上清液，使用 ELISA 试剂盒检测各组的上清液中的 DA 浓度(图 4A)。结果表明，第 1 代的对照组、LV-TH 感染组、LV-DDC-GCH1感染组、三转基因感染组的 DA 浓度分别为(187.2038.52)pg/mL、(1 191.0090.31)pg/mL、(322.5052.23)pg/mL、(2 451.00240.30)pg/mL。第 2 代的对照组、LV-TH 感染组、LV-DDC-GCH1感染组、三转基因感染组的 DA 浓度分别为(139.8039.03)pg/mL、(935.80161.20)pg/mL、(366.90124.80)pg/mL、(2 100.00240.90)pg/mL。两代的细胞，与各自的对照组相比，三转基因感染组和 LV-TH 感染组均极其显著高于对照组(P0.000 1)。其中第 1 代的三转基因感染组 图 4 各组细胞培养上清液中 DA 浓度 Figure 4 Concentration of DA in culture supernatant of cells of each group.A:DA level in culture supernatant by ELISA.Compared with the respective control group,LV-TH+DDC-GCH1 group and LV-TH infection group were significantly higher than that of the control group.Compared with the first passage after infection,the expression of DA in LV-TH+DDC-GCH1 group had no significant change in the second passage after infection.B:Relative DA level by HPLC.Date was presented as xs.n.s.=No significance;*:P0.05;*:P0.05)。两代各组之间比较无显著性差异(P0.05)。此外，HPLC 的 DA 检测结果也印证 ELISA结果(图 4B)。与各自的对照组相比，三转基因感染组的 DA 水平均极其显著的上升(P0.000 1)。其中第一代的三转基因感染组的 DA 水平上升了(12.450.50)倍，第 2 代的三转基因感染组上升了(11.440.92)倍。综上所述，表明 TH 相对于 DDC-GCH1 这两个关键酶组合，更有利于促进 DA 的合成。慢病毒感染的细胞传代以后，能稳定合成 DA。本研究成功创建了稳定高效表达 DA 的 BMSCs(DA-BMSCs)细胞系。2.5 DA-BMSCs 染色体核型分析 为了确定慢病毒感染后，是否对 BMSCs 的染色体稳定性有所影响，我们对 DA-BMSCs 进行染色体 G-显带核型分析。发现感染后的BMSCs 的染色体数目 2n=42 的频率为 94.5%，染色体结构未见异常，表明 DA-BMSCs 细胞系能够保持其正常二倍体核型，未受慢病毒感染的影响，具有良好的遗传稳定性(图 5)。2.6 细胞移植 PD 大鼠 PD 大鼠建模、分组和行为学检测的时间流程图如图 6A 所示。图 6B 是 6-OHDA 损伤和细胞 移 植 的 脑 内 MFB 位 点 的 示 意 图。将DA-BMSCs借助脑立体定位仪(图6C)移植PD大鼠模型 MFB 区，在移植后 4 周时，APO 诱导对侧旋转实验(图 6D)检测各组大鼠运动障碍情况。结 果 显 示(图 6E)，模 型 组、BMSCs 组 和DA-BMSCs 组的 4 周 APO 诱导旋转圈数分别为30615、25416、15415。相较于模型组，DA-BMSCs组和BMSCs组的旋转行为均显著下降(P0.05)。其中 DA-BMSCs 组下降得更为明显(P0.000 1)，对照组因未受到损伤，未出现 APO诱导旋转行为。综上所述，DA-BMSCs 移植 PD大鼠模型 4 周时运动障碍行为极其显著改善。2.7 脑切片免疫荧光 DA-BMSCs 移植 4 周后，大鼠全脑冠状面冰冻切片免疫荧光检测显示，DA-BMSCs 在大鼠脑内移植位点能够存活，可见存在大量的细胞表达荧光(图 7A1)，形成明显的移植区域，并有部分细胞发生远距离迁移。而且移植细胞形态大多呈球形或多边形，同时表达红色 mCherry 和绿色荧光ZsGreen的细胞系为移植脑内DA-BMSCs，图 5 大鼠 DA-BMSCs 核型(42,XX)Figure 5 Karyotype of rat DA-BMSCs(42,XX).ISSN 1000-3061 CN 11-1998/Q 生物工程学报 Chin J Biotech http:/ 1784 图 6 6-OHDA 诱导的 PD 大鼠模型和 DA-BMSCs 移植后行为学评估 Figure 6 6-OHDA-induced PD model of rats and behavioral evaluation after DA-BMSCs transplantation.A:A flow chart for experimental design and animal groups.B:The sites of cells transplantation and 6-OHDA injury.C:The experimental rats were fixed on the stereotaxic apparatus,and the rat model of Parkinsons disease was induced.D:Apomorphine-induced rotations.E:Rotation behavior evaluation of each group for 30 min after injected 4 weeks.Data was presented as xs.*:P0.05;*:P0.000 1.部分聚集于 PD 大鼠模型 6-OHDA 损伤部位，表明移植到 PD 大鼠脑组织中的 DA-BMSCs 散布于移植区域各处，能大量存活(图 7A2)。移植的 DA-BMSCs 在脑内能表达星形胶质细胞标志物 GFAP 和多巴胺能神经元标志物 TH(图7B)，具有分化为多种神经元的能力。这些结果表明移植到 PD 大鼠脑组织中的 DA-BMSCs不仅能大量存活，而且还能分化为多巴胺能 神经元和星形胶质细胞，参与 PD 大鼠的损伤修复。2.8 脑移植区的 DA 浓度 DA-BMSCs 移植 4 周后，ELISA 检测大鼠脑内移植区域的 DA 浓度。结果表明(图 8)，对照组、模型组、BMSCs 组和 DA-BMSCs 组的 DA浓度分别为(419.510.4)pg/g、(61.867.09)pg/g、(120.306.32)pg/g 和(273.69.97)pg/g。相较于模型组，BMSCs 组和 DA-BMSCs 组的 DA 浓度均显著上调，具有统计学意义(P0.05)。其中BMSCs 组 DA 浓度上调了 1.94 倍，DA-BMSCs组上调了 4.42 倍。刘阳 等/稳定高效合成多巴胺的骨髓间充质干细胞系的创建和鉴定 ：010-64807509： 1785 图 7 移植 DA-BMSCs 4 周后注射部位的荧光表达 Figure 7 Fluorescence expression at the injection site 4 weeks after transplantation of DA-BMSCs.A:There were a large amount of DA-BMSCs at the injection site.A2 was the enlarged view of A1.DA-BMSCs were spherical and polygonal.Immunofluorescence showed mCherry(red),ZsGreen(green),and nucleus(blue)in DA-BMSCs.B:DA-BMSCs transplanted for 4 weeks differentiated into GFAP+and TH+neurons in vivo.图 8 脑移植区域的 DA 浓度 Figure 8 DA concentration in the brain transplanted area.Compared with the model group,the DA concentration in the BMSCs group and the DA-BMSCs group was significantly upregulated.Data was presented as xs.*:P0.000 1.3 讨论与结论 MSCs 具有低免疫排斥反应、无畸胎瘤和伦理问题、易于获取等优点，并且 MSCs 还具有旁分泌作用和抗凋亡作用，能够释放细胞因子，改善周围微环境，迁移到损伤区域并参与修复能力14-15，因此，MSCs 已成为干细胞治疗帕金森病的热点细胞之一。然而，MSCs 虽然具有分化为神经细胞的能力，却无法大量定向分化为能够合成和分泌 DA 的多巴胺神经元，并在体内发挥功能。通过基因治疗联合 MSCs，获得大量稳定合成和分泌 DA 的 MSCs 细胞，从根本上治疗 PD，因此如何改造 MSCs 也成为治疗 PD的焦点和热点。目前基因编辑治疗 PD 主要集中在 3 个方向：恢复神经递质失衡的相关基因16-18；提高神 ISSN 1000-3061 CN 11-1998/Q 生物工程学报 Chin J Biotech http:/ 1786 经元存活率的相关基因19-20；控制发病机制的相关基因的表达21。PD 神经通路上的神经递质主要为多巴胺和-氨基丁酸(-aminobutyric acid,GABA)，通过控制神经递质合成路径上关键酶基因的表达就可以调节神经元信号，恢复神经递质失衡来治疗 PD22。TH、DDC 和 GCH1 作为多巴胺合成路径上的关键酶，有研究表明注射腺病毒 AAV-TH、AAV-DDC 和 AAV-GCH1 到 PD 动物模型大脑纹状体中，能显著提高其脑内 DA 的合成，改善其行为学缺陷，并且单独注射 AAV-TH 相对于AAV-DDC和 AAV-GCH1导致更多的 DA产生和行为学改善23。另外有研究显示 AAV-DDC 移植到PD患者脑内，能够显著改善患者的行为障碍，提高患者生活质量24。但向脑内直接注射病毒，感染细胞类型和定位具有不确定性，是否会影响脑内重要细胞的活性和功能，有待进一步研究。此外，相对于慢病毒，腺病毒不能保证基因长期稳定表达。本研究通过构建过表达 TH、DDC 和 GCH1三转基因的重组慢病毒，感染 BMSCs，使原本不产生 DA 的 BMSCs 高效合成 DA，从而替代PD 脑中脑黑质中缺失的多巴胺能神经元，发挥合成 DA 递质的功能。但由于构建同时能表达TH、DDC 和 GCH1 3 个基因的慢病毒载体分子量过大，不利于慢病毒的感染。因此，本研究构建了2个慢病毒载体，分别携带TH和DDC-GCH1基因。通过感染 BMSCs 后慢病毒载体上携带的荧光蛋白表达表明慢病毒转染成功，并分别运用Western blotting 法和 RT-PCR 法检测各组的 TH、DDC 和 GCH1 的表达差异，表明三转基因感染组同时过表达 DDC、GCH1 和 TH 基因。因此，本研究成功使原本不表达 DDC、GCH1 和 TH 基因的 BMSCs 高表达这些关键酶基因。HPLC 和 ELISA 的检测培养上清液结果表明，三转基因感染组和 LV-TH 感染组都比空白对照组 DA 合成量有极其显著的提高，而LV-DDC-GCH1 感染组的 DA 合成量相较于空白对照组提高并不明显，传代后的细胞依旧能稳定合成多巴胺。令人意外的是，我们的结果表明，同样作为 DA 合成路径的关键酶，TH 比 DDC、GCH1 具有更高的促进 DA 合成的能力。有研究表明，PD 主要是 突触核蛋白抑制 TH 色氨酸(Ser40)磷酸化，使得 TH 活性失调，从而导致DA 合成减少引起的25。因此，TH 活性对于 PD至关重要。而创建的 DA-BMSCs 细胞系能否在体内存活，对移植治疗 PD 大鼠模型亦至关重要。作为多巴胺神经毒素的 6-OHDA，能够诱导多巴胺神经元死亡，已被广泛应用于 PD 动物实验模型的构建26-27。APO 诱导的不对称旋转实验是由于脑内双侧多巴胺受体 D2 被 APO 激活不一致引起对侧旋转运动，因而被认为是检测单侧注射6-OHDA 引起的运动障碍病变强度的国际通用标准28-29。PD 动物模型的 APO 诱导旋转实验的旋 转 圈 数 的 下 降 视 为 行 为 学 的 改 善。将DA-BMSCs 移植到大鼠右侧前脑内侧束区 4 周后，PD 大鼠模型的 APO 诱导旋转实验圈数显著下降，运动障碍行为得到极其显著改善。全脑切片的免疫荧光检测显示，移植的 DA-BMSCs 可在宿主脑内大量存活并形成明显的移植区域，而且 携 带 的 荧 光 蛋 白 也 强 烈 表 达。移 植 的DA-BMSCs 在体内分化为多巴胺能神经元和星形胶质细胞，并显著上调脑中的 DA 浓度，从而显著改善 PD 大鼠行为障碍。因此相较于未改造的 BMSCs，基因改造的 DA-BMSCs 不仅具有BMSCs 原本的功能，还兼具了合成 DA 的功能，可替代中脑黑质中多巴胺神经元合成 DA 的功能，对黑质-纹状体多巴胺环路发挥修复效应。综上所述，本研究通过利用慢病毒感染法创 刘阳 等/稳定高效合成多巴胺的骨髓间充质干细胞系的创建和鉴定 ：010-64807509： 1787 建了能稳定合成 DA 三转基因 BMSCs 细胞系，并具备体内与体外分泌DA的潜能，为DA-BMSCs工程化培养与移植治疗 PD 奠定基础。REFERENCES 1 GIL-MARTINEZ AL,CUENCA-BERMEJO L,GONZALEZ-CUELLO AM,SANCHEZ-RODRIGO C,PARRADO A,VYAS S,FERNANDEZ-VILLALBA E,HERRERO MT.Identification of differentially expressed genes profiles in a combined mouse model of Parkinsonism and colitisJ.Scientific Reports,2020,10:13147.2 BJRKLUND A,DUNNETT SB.Do