稳定高效合成多巴胺的骨髓间充质干细胞系的创建和鉴定_刘阳.pdf
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1、 刘阳 等/稳定高效合成多巴胺的骨髓间充质干细胞系的创建和鉴定 Chinese Journal of Biotechnology http:/ Apr.25,2023,39(4):1773-1788 DOI:10.13345/j.cjb.220718 2023 Chin J Biotech,All rights reserved 资助项目:国家自然科学基金(81771381);安徽省高校自然科学基金项目(KJ2021ZD0085,KJ2021A0774,KJ2021A0784);安徽省重点研发计划(2022e07020030,2022e07020032);蚌埠医学院研究生科研创新计划项目(By
2、ycx21050);国家级大学生创新创业训练项目资助(202110367043,202110367044,20210367058);蚌埠医学院厅重点科研平台开放课题(AHTT2022B001)This work was supported by the National Natural Science Foundation of China(81771381),the Natural Science Foundation of Colleges and Universities of Anhui Province(KJ2021ZD0085,KJ2021A0774,KJ2021A0784),th
3、e Key Research and Development Program of Anhui Province(2022e07020030,2022e07020032),the Postgraduate Research Innovation Program of Bengbu Medical College(Byycx21050),the National Innovation and Entrepreneurship Training Program for College Students(202110367043,202110367044,20210367058),and the K
4、ey Research Platform Open Subjects of the Department of Bengbu Medical College(AHTT2022B001).*Corresponding author.Tel:+86-552-3175291,E-mail: Received:2022-09-07;Accepted:2022-12-14 1773 生物工程学报 稳定高效合成多巴胺的骨髓间充质干细胞系的 创建和鉴定 刘阳1,常俊彦1,王悦1,杨盼1,马彩云1,刘高峰1,郭俣2,刘长青1,王春景1*1 蚌埠医学院生命科学学院,安徽 蚌埠 233000 2 蚌埠医学院检验医
5、学院,安徽 蚌埠 233000 刘阳,常俊彦,王悦,杨盼,马彩云,刘高峰,郭俣,刘长青,王春景.稳定高效合成多巴胺的骨髓间充质干细胞系的创建和鉴定J.生物工程学报,2023,39(4):1773-1788.LIU Yang,CHANG Junyan,WANG Yue,YANG Pan,MA Caiyun,LIU Gaofeng,GUO Yu,LIU Changqing,WANG Chunjing.Establishment and characterization of bone marrow mesenchymal stem cell lines stably synthesizing hi
6、gh-level dopamineJ.Chinese Journal of Biotechnology,2023,39(4):1773-1788.摘 要:创建能稳定合成多巴胺(dopamine,DA)递质的三转基因(tyrosine hydroxylase/dopamine decarboxylase/GTP cyclohydrolase 1,TH/DDC/GCH1)的 骨 髓 间 充 质 干 细 胞 系(bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs),移植至帕金森大鼠模型脑内,为帕金森病(Parkinsons disease,PD)的临床治疗提供实验依据。
7、通过三转基因的重组慢病毒创建能稳定合成并分泌 DA 递质的DA-BMSCs 稳定转染细胞系,利用反转录聚合酶链式反应(reverse transcription-polymerase chain reaction,RT-PCR)、蛋白免疫印迹(Western blotting)、免疫荧光等技术检测 BMSCs 中三转基因(TH/DDC/GCH1)的表达,采用酶联免疫吸附试验(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)和高效液相色谱法(high performance liquid chromatography,HPLC)检测 DA 的合成情况。染色体 G-
8、带法检测 DA-BMSCs 的遗传稳定性。将 DA-BMSCs 移植于 6-羟基多巴胺(6-hydroxydopamine,6-OHDA)偏侧损毁帕金森大鼠模型右脑的前脑内侧束(medial forebrain bundle,MFB)区,检测其在 PD 大鼠脑内微环境中的存活、分化情况。阿扑吗啡(apomorphine,APO)诱导旋转实验检测 DA-BMSCs 移组织工程与细胞培养 ISSN 1000-3061 CN 11-1998/Q 生物工程学报 Chin J Biotech http:/ 1774 植后 PD 大鼠的运动障碍改善情况。DA-BMSCs 细胞系中 TH/DDC/GCH1
9、三转基因均能够稳定高效表达,而正常 BMSCs 对照组中均不表达。三转基因感染组(DA-BMSCs)和 LV-TH 感染组细胞培养上清液中 DA 浓度极其显著高于 BMSCs 空白对照组(P0.000 1)。传代后的 DA-BMSCs仍能稳定合成 DA,并保持正常二倍体核型(94.5%)。DA-BMSCs 移植 PD 大鼠脑内 4 周后,显著改善 PD 大鼠模型的运动障碍,在脑内微环境中大量存活,分化为 TH+和 GFAP+细胞,并显著上调脑移植区域的 DA 水平。本研究成功创建了能稳定分泌 DA,在大鼠脑中大量存活并分化的三转基因DA-BMSCs 细胞系,为 DA-BMSCs 工程化培养与移
10、植治疗 PD 奠定基础。关键词:帕金森病;大鼠间充质干细胞;酪氨酸羟化酶;多巴胺脱羧酶;GTP 环化水解酶 1;多巴胺 Establishment and characterization of bone marrow mesenchymal stem cell lines stably synthesizing high-level dopamine LIU Yang1,CHANG Junyan1,WANG Yue1,YANG Pan1,MA Caiyun1,LIU Gaofeng1,GUO Yu2,LIU Changqing1,WANG Chunjing1*1 School of Life
11、 Sciences,Bengbu Medical College,Bengbu 233000,Anhui,China 2 School of Laboratory Medicine,Bengbu Medical College,Bengbu 233000,Anhui,China Abstract:A triple-transgenic(tyrosine hydroxylase/dopamine decarboxylase/GTP cyclohydrolase 1,TH/DDC/GCH1)bone marrow mesenchymal stem cell line(BMSCs)capable o
12、f stably synthesizing dopamine(DA)transmitters were established to provide experimental evidence for the clinical treatment of Parkinsons disease(PD)by using this cell line.The DA-BMSCs cell line that could stably synthesize and secrete DA transmitters was established by using the triple transgenic
13、recombinant lentivirus.The triple transgenes(TH/DDC/GCH1)expression in DA-BMSCs was detected using reverse transcription-polymerase chain reaction(RT-PCR),Western blotting,and immunofluorescence.Moreover,the secretion of DA was tested by enzyme-linked immunosorbent assay(ELISA)and high-performance l
14、iquid chromatography(HPLC).Chromosome G-banding analysis was used to detect the genetic stability of DA-BMSCs.Subsequently,the DA-BMSCs were stereotactically transplanted into the right medial forebrain bundle(MFB)of Parkinsons rat models to detect their survival and differentiation in the intracere
15、bral microenvironment of PD rats.Apomorphine(APO)-induced rotation test was used to detect the improvement of motor dysfunction in PD rat models with cell transplantation.The TH,DDC and GCH1 were expressed stably and efficiently in the DA-BMSCs cell line,but not expressed in the normal rat BMSCs.The
16、 concentration of DA in the cell culture supernatant of the triple transgenic group(DA-BMSCs)and the LV-TH group was extremely significantly higher than that of the standard BMSCs control group(P210 圈,即视为建模成功。细胞移植 4 周后,对各组大鼠进行 APO 诱导旋转检测,评估运动障碍改善情况。1.10 大鼠分组和细胞移植 大鼠分组:建模成功的 15 只大鼠随机分为3 组:模型组、BMSCs 组
17、、DA-BMSCs 组,并以 5 只同等条件喂养未做任何处理的 SD 大鼠为正常对照组。细胞移植:收集细胞,PBS 溶液制成浓度约(1.25104)(1.5104)/L 细胞悬液,模型组以 PBS 溶液代替,细胞移植操作同 PD 大鼠模型制备,每只大鼠注入 8 L 细胞悬液。1.11 脑组织切片制备 取术后 4 周的 PD 大鼠,3%戊巴比妥腹腔注射麻醉后固定于手术解剖台进行心脏灌注。提前引流瓶中准备 200 mL 生理盐水,灌注针从左心室插入主动脉弓,打开流量调节器,并迅速剪开右心耳,引流血液,观察大鼠状态保证灌注通路流畅。待流出的液体澄清,肝部苍白,换用200 mL 4%多聚甲醛灌注固定。
18、在冰上迅速剥离脑组织,4%多聚甲醛 4 继续固定 4 h,25%蔗糖 4 充分脱水,80 环境冻存。使用 OCT 刘阳 等/稳定高效合成多巴胺的骨髓间充质干细胞系的创建和鉴定 :010-64807509: 1779 包埋剂(Sakura 公司)包埋脑组织,冰冻切片机在1220 m 切片厚度连续冠状切片,切片进行DAPI 染色观察移植细胞存活情况。1.12 数据统计 使用 Graph Pad Prism 7.0 统计学软件对各组 DA 浓度变化进行处理。组间比较采用单因素方差分析,进一步的组间两两比较采用 LSD 检验,多重比较采用 Sidak 检验。所得的实验数据用xs表示。P0.05 表示差
19、异有统计学意义。2 结果与分析 2.1 BMSCs 的分离培养和鉴定 从大鼠骨髓中冲出 BMSCs 经过一夜贴壁培养,粘附于培养瓶底部,呈成纤维细胞样的短梭形或者双极状,部分呈旋涡状,并混有部分其他骨髓细胞(图 1A1)。继续培养 710 d 后,可见成纤维样的细胞汇聚成紧密的单细胞层。经连续传代至 P4,可获得典型的纺锤形成纤维样单细胞层,形态均一,增殖能力强(图 1A2)。传至 P6 仍具有较好的稳定性,细胞的形态和增殖能力均未见明显的形态差异(图 1A3)。P10 以后细胞逐渐呈现扁平化,胞体的轮廓不清晰,细碎颗粒感增强,增殖能力和折光性均下降。将纯化后 P4的 BMSCs 以 100/
20、皿的细胞密度接种于细胞培养皿中培养 1014 d 左右,可明显观察到间充质干细胞的克隆样成团生长现象,用结晶紫染色后呈现紧密的细胞团结构(图1A4)。免疫荧光和 RT-PCR 检测表明,培养的BMSCs(P3)能够显著表达间充质干细胞表面抗原标志物 CD29、CD44、CD73、CD90,而不表达造血谱系细胞标志物 CD34 和 CD45(图1BC),符合间充质来源的干细胞特征性标志物特征,表明已成功分离培养出纯化的 BMSCs。图 1 BMSCs 的细胞形态、克隆团形成以及特异性标记物的检测 Figure 1 Cell morphology,clonal cluster formation
21、and detection of specific markers of BMSCs.A1:Cells of P0;A2:Cells of P3;A3:Cells of P6;A4:Clonal cluster of the P4 cells stained with crystal violet.B:mRNA expression levels of specific marker genes were detected by RT-PCR.C:Immunofluorescent staining of specific markers in BMSCs.ISSN 1000-3061 CN
22、11-1998/Q 生物工程学报 Chin J Biotech http:/ 1780、2.2 过表达 TH、DDC、GCH1 基因慢病毒载体的构建和感染 BMSCs 后荧光蛋白表达 选用第 2 代三载体慢病毒系统,以确保慢病毒载体能够安全和有效地应用于 BMSCs 细胞系。构建的携带 3 种关键酶基因的 2 种慢病毒载体示意图结构如图 2A 所示,其中 DDC 和GCH1 基因插入同一个慢病毒载体 LV-ZsGreen中,用自剪切多肽 T2A 相连,而 TH 插入另一 个慢病毒载体 LV-mCherry 中,LV-TH 过表达慢病 毒 和 对 应 对 照 病 毒 携 带 荧 光 蛋 白 基
23、因mCherry 和抗性基因 puro,表达红色荧光蛋白;LV-DDC-GCH1 过表达慢病毒和对应对照病毒携带荧光蛋白基因 ZsGreen 和抗性基因 BSD,表达绿色荧光蛋白。慢病毒载体上的荧光蛋白基因和抗性基因的表达均通过 EF1 启动子驱动表达。图 2 构建的慢病毒载体结构和感染 BMSCs 后荧光表达情况 Figure 2 Structure of the constructed lentiviral vectors and fluorescent protein expression of infected BMSCs.A:Structure of the constructed
24、lentiviral vectors.B:Fluorescent protein expression of control lentivirus and single overexpressing lentivirus three days after infection of BMSCs.C:Infection efficiency of the constructed lentivirus.D:Fluorescence expression of BMSCs that could stably express two overexpressing lentiviruses or cont
25、rol lentiviruses simultaneously after purification.Scale bar=100 m,data was presented as xs.刘阳 等/稳定高效合成多巴胺的骨髓间充质干细胞系的创建和鉴定 :010-64807509: 1781 慢病毒在助转剂聚凝胺的作用下感染BMSCs 细胞系 2 d 后出现荧光,3 d 后达到丰度。采用免疫荧光显微镜分析荧光蛋白的表达确定慢病毒的感染效率。如图 2B 所示,感染 BMSCs细胞系 3 d 后,可见对照病毒和目的基因慢病毒均得到良好的表达,对照慢病毒的荧光强度比目的基因慢病毒相对较强。慢病毒 LV-TH
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