DNS法测定总糖和还原糖.docx

实验九 总糖和还原糖的测定（二）
──3,5－二硝基水杨酸法
一、目的要求：
掌握还原糖和总糖的测定原理，学习用比色法测定还原糖的方法。
二、实验原理: 
在NaOH和丙三醇存在下，3,5－二硝基水杨酸（DNS）与还原糖共热后被还原生成氨基化合物。在过量的NaOH碱性溶液中此化合物呈桔红色，在540nm波长处有最大吸收，在一定的浓度范围内，还原糖的量与光吸收值呈线性关系，利用比色法可测定样品中的含糖量。

黄色    桔红色
三、试剂和器材
1、试剂
（1）1 mg/ml葡萄糖标准溶液：准确称取干燥恒重的葡萄糖100mg，加少量蒸馏水溶解后，以蒸馏水定容至100ml，即含葡萄糖为1.0mg/ml。
（2）3,5—二硝基水杨酸试剂：称取6.3 g 3,5—二硝基水杨酸并量取262 ml 2mol/L NaOH加到酒石酸钾纳的热溶液中（182 g酒石酸钾纳溶于500 ml水中），再加5 g结晶酚和5 g亚硫酸氢钠溶于其中，搅拌溶解，冷却后定容到1000 ml贮于棕色瓶中。
（3）碘－碘化钾溶液：称取5g碘，10g碘化钾溶于100ml蒸馏水中。
（4）6N NaOH：称取120g NaOH溶于500ml蒸馏水中。
（5）0.1% 酚酞指示剂。　
（6）6 mol/L HCl溶液
2、材料
小麦淀粉或玉米淀粉。
3、器材
分光光度计，天平，水浴锅，电炉，试管若干等。
四、操作方法 
1、葡萄糖标准曲线制作
取8支15mm×180mm试管，按下表加入1.0mg/ml葡萄糖标准液和蒸馏水。
试剂
管号
0
1
2
3
4
5
6
7
8
葡萄糖标准液(ml)
0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
1.2
1.4
1.6
蒸馏水(ml)
2.0
1.8
1.6
1.4
1.2
1.0
0.8
0.6
0.4
水杨酸溶液(ml)
1.5
1.5
1.5
1.5
1.5
1.5
1.5
1.5
1.5
葡萄糖含量(mg)
0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
1.2
1.4
1.6
将各管溶液混合均匀，在沸水中加热5 min，取出后立即用冷水冷却到室温，再向每管加入21.5 ml蒸馏水，摇匀。
λ=540nm处测定吸光度

以葡萄糖含量（mg）为横坐标，光吸收值为纵坐标，绘制标准曲线。
2、样品中还原糖的提取
准确称取 0.5g小麦（淀）粉，放在100ml烧杯中，先以少量蒸馏水(约2 ml)调成糊状，然后加入40ml蒸馏水，混匀，于50℃ 恒温水浴中保温20min，不时搅拌，使还原糖浸出混。过滤，将滤液全部收集在50ml的容量瓶中，用蒸馏水定容至刻度，即为还原糖提取液。
3、样品总糖的水解及提取
准确称取0.5g小麦(淀)粉，放在锥形瓶中，加入6mol/L HCl 10ml，蒸馏水15ml，在沸水浴中加热0.5h，取出1～2滴置于白瓷板上，加1滴I-KI溶液检查水解是否完全。如已水解完全，则不呈现蓝色。水解毕，冷却至室温后加入1滴酚酞指示剂，以6N NaOH溶液中和至溶液呈微红色，并定容到100ml，过滤取滤液10ml于100ml容量瓶中，定容至刻度，混匀，即为稀释1000倍的总糖水解液，用于总糖测定。
4、样品中含糖量的测定
试剂
空白
还原糖
总糖
样品溶液(ml)
0
1.0
1.0
蒸馏水(ml)
2.0
1.0
1.0
水杨酸(ml)
1.50
1.50
1.50
将各管溶液混合均匀，在沸水中加热5 min，取出后立即用冷水冷却到室温，再向每管加入21.5 ml蒸馏水，摇匀。
λ=540nm处测定吸光度

样品溶液中还原糖和总糖

测定后，取样品的光吸收值在标准曲线上查出相应的糖量。
五、结果处理
按下式计算出样品中还原糖和总糖的百分含量：

式中：C──还原糖或总糖提取液的浓度，mg/ml；
V──还原糖或总糖提取液的总体积，ml；
m──样品重量，g；
1000──mg换算成g的系数。
思考题
1. 比色时为什么要设计空白管？
2. 比较费林试剂比色法与3,5-二硝基水杨酸比色法测定可溶性淀粉中还原糖和总糖的结果，这两种方法各有何优点？