氢吗啡酮对大鼠的脑保护作用.pdf

目的 探讨氢吗啡酮对大鼠脑缺血再灌注损伤的影响。方法 45只SD雄性大鼠随机分成3组：假手术组（Sham组）、脑缺血再灌注组（I/R组）和氢吗啡酮组（HM组）。采用Zea-Longa改良线拴法构建动物模型，再灌注24h后，Zea-Longa评分法评价神经功能；TTC染色检测脑梗死体积；苏木精-伊红（HE）和Nissl染色观察海马神经元病理变化，Tunel染色观察细胞凋亡情况，Westernblot、qPCR检测凋亡相关因子B淋巴细胞瘤（Bcl）-2、Bcl-2相关X蛋白（Bax）和半胱氨酸蛋白酶（Caspase）-3蛋白和mRNA表达量。结果 与I/R组相比，HM组神经功能评分下降和脑梗死面积减小（P0.05），Tunel阳性细胞数量减少（P0.05），Bax和Caspase-3蛋白mRNA表达量减少，而Bcl-2表达量显著增加（P0.05）。结论 氢吗啡酮具有神经保护作用，可减轻大鼠脑缺血再灌注损伤。【关键词】氢吗啡酮；脑缺血-再灌注；大鼠；海马神经元DOI：10.3969/j.issn.1000-8535.2023.07.002CerebralprotectiveeffectofhydromorphoneinratsLIYueyang1，FANGGang1，GAOManhai2，LIRong2，WANGJing21 Baotou Medical College，Baotou 014040，China2 Department of Anesthesiology，the First Affiliated Hospital of Baotou Medical College，Inner Mongolia University of Science and Technology Baotou Medical College，Baotou 014010，China【Abstract】Objective Toinvestigatetheeffectofhydromorphoneoncerebralischemia-reperfusioninjuryinratsMethods Forty-fiveSDmaleratswererandomlydividedintothreegroups：sham-operatedgroup（Shamgroup），cerebralischemia-reperfusiongroup（I/Rgroup）andhydromorphonegroup（HMgroup）TheanimalmodelswereconstructedusingtheZea-Longamodifiedlinetetheringmethod，andneurologicalfunctionwasevaluatedbytheZea-Longascoreafter24hofreperfusionTTCstainingwasusedtodetectthevolumeofcerebralinfarction，hematoxylin-eosin（HE）andNisslstainingwereusedtoobservethepathologicalchangesofhippocampalneurons，andTunelstainingwasusedtoobserveapoptosis，Westernblot，qPCRwereusedtodetectapoptosisBcl-2，Bcl-2-associatedXprotein（Bax）andcysteineprotease（Caspase）-3proteinandmRNAexpressionResults ComparedwiththeI/Rgroup，theHMgroupshowedlowerneurologicalfunctionscoresandcerebralinfarctarea（P0.05），smallernumberofTunel-positivecells（P0.05），lessmRNAexpressionofBaxandCaspase-3proteinsandsignificantlyhigherexpressionofBcl-2（P0.05）Conclusions Hydromorphonehasneuroprotectiveeffectsandcanreducecerebralischemia-reperfusioninjuryinrats【Keywords】hydromorphone；cerebralischemia-reperfusion；rats；hippocampalneurons基金项目：包头市卫生健康委科技计划项目（wsjkwkj001）通信作者：王静，E-mail：脑卒中是我国成年人致死致残的首位原因，患者可出现失语、认知功能障碍、偏瘫等不同程度的神经后遗症，患者生活质量严重下降1-2。治疗急性脑梗死的方法主要有溶栓治疗，降压治疗等，目的是使缺血的脑组织恢复血供，即再灌注，但这个过程对脑组织可产生有害影响，即缺血再灌注（ischemia/reperfusion，I/R）损伤3-5。因此最理想的治疗方案是既能恢复血供又能减少论著广州医药23年07期.indd 102023/8/10 17:05:55http:/11脑组织损伤。氢吗啡酮是吗啡的衍生物，作用于阿片受体，具有效能高、不良反应少、镇痛效力是吗啡的56倍等特点，可作为吗啡的公认替代品6-7。但是氢吗啡酮的脑保护作用鲜有研究，本次研究建立I/R损伤模型，探讨氢吗啡酮的脑保护作用，为新药的研发提供实验基础。1 材料与方法1.1 实验材料1.1.1实验动物清洁级SD雄性大鼠，体重250280g，由内蒙古格亿商贸有限公司提供，动物生产许可证号为SCXK（京）2019-0010，本研究所有动物实验方案均经本院医学伦理委员会批准，并且均按照国家实验动物喂养和运作指南的指导方针进行。所有大鼠在包头医学院动物房中饲养，饲养条件：充足的饮水和饮食，12h明暗交换，保持环境和鼠笼干净清洁。1.1.2 主要试剂和仪器 氢吗啡酮注射液（2mL:2mg），湖北宜昌人福药业有限公司生产；2，3，5-氯化三苯基四氮唑（2，3，5-triphenyltetrazoliumchloride，TTC）、尼氏染色液、Caspase-3抗体、Bcl-2抗体及Bax抗体（货号分别为T8170、G1436、K107625P、K003505P、K008076P），中国Solarbio生产，苏木精-伊红染色液（货号为BA-4041），珠海贝索生物技术有限公司；荧光定量PCR仪（ABI7500），光学显微镜（OLYMPUSBX43）等。1.2 方法1.2.1 建立大鼠I/R模型及分组给药 45只大鼠随机分成3组：假手术组（Sham组）、模型组（I/R组）和氢吗啡酮组（HM组）。依照文献8构建脑I/R损伤模型，具体方法为：2%戊巴比妥钠（50mg/kg）腹腔注射麻醉，充分暴露左侧颈总动脉，颈内动脉及颈外动脉，颈总动脉近心端剪一小口插入线拴（中国北京西浓科技有限公司，直径为0.25mm），线拴经颈总及颈内动脉置入大脑中动脉，缺血2h后拔出线拴至颈内与颈外动脉分叉处。缺血前20min，HM组经颈内静脉注射氢吗啡酮0.2mg/kg，其余两组注射等量生理盐水。造模成功后，进行神经功能评分，随后麻醉处死，断头取脑并进行后续实验项目。1.2.2Zea-Longa神经功能评分造模成功24h后，参照文献9进行神经功能测定，评04分，分值越高表示神经缺损越严重，13分者都可认为造模成功，0分无症状者及4分症状过重者认为造模失败，予以剔除。1.2.3 脑梗死体积的测定 在完成上述步骤后，每组随机取出3只大鼠。断头取脑，将取出的脑组织迅速放入20冰箱中冰冻30min，冠状位切成5片，放入提前备好的2%TTC染液中进行染色，拍照，ImageJ软件分析脑梗死体积，采用梗死体积比率表示梗死体积（梗死体积比率各切面梗死面积之和/各切面面积之和100%）。1.2.4 HE染色 组织样本脱水、石蜡包埋，切成5m厚石蜡切片，苏木精染液染色，酒精再次脱水后，伊红染液染色，光学显微镜观察，选取目标区域进行拍照、分析。1.2.5 Nissl染色 脑组织脱水、包埋切片，用1%甲苯胺蓝染色液染色30min，并用光学显微镜观察各个切片中的尼氏小体，选取目标区域进行拍照、分析。1.2.6 Tunel染色检测细胞凋亡 脑组织石蜡包埋后切成6m的厚石蜡切片，脱蜡复水后滴入蛋白酶K，室温下孵育20min后加入Tunel染色液。荧光显微镜观察，拍照并分析。1.2.7 qPCR检测 大鼠断头取脑，取50mg组织用TRIzol提取组织样本中总RNA，并检测其质量和浓度，进行反转录操作，上机进行qPCR检，用美国Bio-Rad公司荧光定量PCR仪检RNA含量，并测采用2-Ct法进行数据的相对定量分析。1.2.8 Westernblot 取损伤侧海马组织，加入RIPA裂解液，在4下，12000r/min离心15min，收集上清液并加入缓冲液后煮沸。最后用BCA法定量蛋白。将等量的蛋白质置于SDS聚丙烯酰胺凝胶上分离，经湿法转膜方法将其印迹到PVDF膜上。转膜结束后用5%脱脂奶粉室温孵育封闭1h，TBST缓冲液清洗3次，4下孵育一抗过夜，随后用TBST缓冲液清洗室温孵育二抗2h，最后加入ECL发光液显色，并使用ImageJ软件分析各组蛋白相对表达量。1.3 统计学分析采用SPSS22.0软件对实验数据进行统计分广州医药23年07期.indd 112023/8/10 17:05:5512广州医药 2023 年 7 月第 54 卷第 7 期析，计量资料以均数标准差（s）表示，多组间比较进行单因素方差分析，以P0.05为差异有统计学意义。2 结 果2.1 各组大鼠Zea-Longa神经功能评分结果Sham组大鼠无脑I/R损伤表现，评分为0分。与I/R组相比，HM组评分降低（P0.05），提示氢吗啡酮可以减轻I/R损伤时的躯体表现。见表1。表1 各组大鼠Zea-Longa神经功能评分比较（s，n=10）组别Zea-Longa 神经功能评分/分Sham 组0I/R 组2.960.48*HM 组1.690.48#P 0.01注：与Sham组比较，*P0.01；与I/R组比较，#P0.012.2 各组大鼠脑梗死体积检测结果TTC染色显示，Sham组大鼠的脑组织被染成均匀的红色，无脑梗死病灶，I/R组及HM组的脑梗死处被染成白色，与I/R组相比，HM组白色梗死灶面积显著减小（P0.05）。见图1、图2。2.3 各组大鼠HE染色结果HE染色显示，Sham组海马CA1区神经元细胞排列整齐，结构完整，细胞核轮廓正常。I/R组的细胞水肿严重，排列混乱，胞浆浓缩，核固缩，细胞死亡数量多。而HM组的病理表现较I/R组轻，细胞坏死也显著减少。说明氢吗啡酮可以缓解脑缺血再灌注所诱发的海马神经元细胞的损伤情况。见图3。2.4 各组大鼠Nissl染色情况通过Nissl染色观察各组切片尼氏小体情况。Sham组可以观察到海马CA1区神经元神经元形态正常，可见I/R组细胞形态不一，轮廓模糊，尼氏图 3 各组大鼠 HE 染色图（上图 200，下图 400）图 2 各组大鼠脑梗死体积柱状图注：与Sham组比较，*P0.01；与I/R组比较，#P0.01图 1 各组大鼠 TTC 染色脑梗死图广州医药23年07期.indd 122023/8/10 17:05:56http:/13小体减少，HM组的病理表现较I/R组有所减轻，尼氏小体数量增多。见图4。2.5 各组大鼠Tunel染色情况根据Tunel染色结果来看，Sham组大鼠海马组织的神经元分布正常，镜下阳性细胞少，但I/R组的增多，细胞凋亡数量多（P0.05）。与I/R组相比，HM组细胞凋亡数量减少（P0.05）。见表2，图5。表2 各组大鼠海马神经元TUNEL阳性细胞数比较（s，n=3）组别TUNELSham 组1.230.56I/R 组4928.23*HM 组3038.23#P 0.01注：与Sham组比较，*P0.01；与I/R组比较，#P0.01ShamI/RHM图 4 各组大鼠 Nissl 染色图（400）图 5 各组大鼠 Tunel 染色图（400）TunelDAPIMergeShamI/RHM广州医药23年07期.indd 132023/8/10 17:05:5614广州医药 2023 年 7 月第 54 卷第 7 期2.6 各组大鼠海马组织凋亡相关蛋白和mRNA表达情况通过对qPCR的测定和检测相关蛋白表达量，与Sham组相比，I/R组和HM组Bax、Bcl-2和Caspase-3蛋白mRNA表达量增高（P0.05），与I/R组相比，HM组的则表达量则有所下降（P0.05）。见表3、表4，图6。表3 各组大鼠海马组织凋亡相关蛋白mRNA表达量比较 （s，n=3）组别Bcl-2BaxCaspase-3Sham 组0.820.140.960.250.950.16I/R 组0.290.21*2.520.19*2.840.21*HM 组0.530.17#1.660.23#1.810.13#P 0.01 0.01 0.01注：与Sham组比较，*P0.01；与I/R组比较，#P0.01，#P0.05表4 各组大鼠海马组织凋亡相关蛋白表达量比较 （s，n=3）组别Bcl-2BaxCaspase-3Sham 组0.980.040.320.020.470.04I/R 组0.260.04*0.840.02*1.050.04*HM 组0.370.03#0.520.01#0.780.04#P 0.01 0.01 0.01注：与Sham组比较，*P0.01；与I/R组比较，#P0.01，#P0.053 讨 论脑I/R损伤是恢复血流带来的必然伤害，可出现认知功能障碍、偏瘫等不同的神经功能异常表现，我们应该高度重视其带来的伤害，然而目前还没有找到能够避免的好办法，因此应该如何有效防范其带来的伤害是当前研究的重点10。目前采用Zea-longa改良线栓法建立大鼠大脑中动脉闭塞是构建脑I/R损伤的经典方法，本研究按照此种方式进行造模11。通过神经功能评分可以间接反映大鼠脑损伤的严重程度，通过对脑组织行TTC染色可直观评判脑梗死体积，本研究发现，I/R组和HM组的大鼠出现脑梗死的神经病学征象，并且可以观察到白色梗死灶，以上结果都提示大鼠缺血再灌注模型制备成功。氢吗啡酮为半合成阿片类药物，其作用于阿片受体，近年来发现它对缺血的神经胶质有保护作用12。本研究发现，与I/R组相比，HM组的神经功能学评分和脑梗死体积都明显降低，说明氢吗啡酮可以减轻再灌注对大鼠脑组织的损伤。HE染色结果表明，Sham组海马CA1区神经元细胞排列规整，轮廓清楚，但在再灌注24h后，可以看到细胞大量死亡，细胞结构破坏，核固缩，而经过氢吗啡酮处理的则能够明显预防海马神经元的损伤，并且显著缓解了I/R损伤相对应的病理学改变。Nissl染色结果所示，Sham组尼氏小体数量多且结构正常，I/R组因细胞损伤严重导致尼氏小体大量减少，HM组虽有一定程度的细胞损伤，但其镜下仍然能看到一定数量的尼氏小体，损伤程度Bcl-2BaxCaspase-3-actin图 6 各组大鼠海马组织 Bcl-2、Bax、Caspase-3 蛋白表达ShamI/RHM广州医药23年07期.indd 142023/8/10 17:05:56http:/15较I/R组显著减轻。在I/R损伤过程中，缺血区发生的主要死亡类型有细胞凋亡与坏死，而凋亡是主要形式，可用来客观评价损伤的严重程度。因此通过抑制凋亡，可有效缓解脑I/R损伤13。促凋亡因子Bax、抗凋亡因子Bcl-2和Caspase-3在凋亡过程中起着重要作用14。因此我们对大鼠海马组织进行Tunel染色、Westernblot、qPCR检测凋亡相关因子，观察神经细胞凋亡情况。本研究显示，Sham组阳性细胞较少，海马神经元分布正常，I/R组大量细胞凋亡，而HM组的细胞凋亡数量较I/R组显著减少（P0.05）。与Sham组相比，I/R组和HM组Bax和Caspase-3蛋白mRNA表达量增高，Bcl-2的降低（P0.05），与I/R组相比，HM组的其他表达量则有所下降，但Bcl-2的表达升高（P0.05）进一步验证氢吗啡酮在脑I/R损伤中的作用。综上所述，氢吗啡酮能够减轻脑I/R损伤，发挥了它的神经保护作用，但其确切机制和潜在靶点仍需进一步深入研究。【参考文献】1 LEEHK，KOHS，LODC，etalNeuronalIL-4RmodulatesneuronalapoptosisandcellviabilityduringtheacutephasesofcerebralischemiaJFEBSJ，2018，285（15）：2785-27982 孙海欣，王文志中国60万人群脑血管病流行病学抽样调查报告J中国现代神经疾病杂志，2018，18（2）：83-883 张莲，王珅，龚媛媛，等计算机断层扫描血管造影侧支循环评分对大脑中动脉闭塞致急性脑梗死患者早期神经功能恶化的预测价值J血管与腔内血管外科杂志，2022，8（10）：1259-12644 魏思灿，林天来，黄玲，等槲皮素通过PINK1/parkin通路激活线粒体自噬减轻大鼠脑缺血再灌注损伤J中国病理生理杂志，2020，36（12）：2251-22575 尹倩，周德生，陈瑶，等基于NLRP3炎症小体探讨活血荣络方对大鼠脑缺血再灌注损伤的影响及机制J中国中医药信息杂志，2022：1-76 王菲菲，郑丽宏盐酸氢吗啡酮在麻醉中的应用研究进展J医学综述，2017，23（3）：528-5317 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