基于网络药理学研究扶正化瘀降浊通络方治疗慢性肾衰竭的作用机制.pdf

实验研究基金项目：国家自然科学基金项目（）基于网络药理学研究扶正化瘀降浊通络方治疗慢性肾衰竭的作用机制何剑川，付饶，邹小康，陈明 四川省中西医结合医院，四川 成都 ；成都中医药大学附属医院，四川 成都 摘要：目的：通过网络药理学方法研究扶正化瘀降浊通络方治疗慢性肾衰竭（，）的药效成分、作用靶点及信号通路，拟阐明其作用机制。方法：通过中药系统药理学数据库与分析平台（，）等数据库和文献挖掘获取扶正化瘀降浊通络方组方中药的活性成分，利用 筛选化学成分潜在靶点；在 数据库、在线人类孟德尔遗传数据库（，）检索 相关靶点。将扶正化瘀降浊通络方活性成分相关靶点与 靶点上传 平台进行映射，交集靶点即为扶正化瘀降浊通络方治疗 的潜在靶点，并绘制靶点韦恩图。将潜在靶点导入 数据库构建蛋白互作（，）网络并分析。使用 等软件构建“药物 成分 靶点”网络并筛选核心成分。借助 数据库对靶点进行基因本体（，）功能富集分析和京都基因与基因组百科全书（，）信号通路富集分析。利用 软件构建“信号通路 靶点”网络及“药物 核心成分 核心靶点 信号通路”网络。结果：通过 数据库筛选得到 个活性成分及相关靶点 个，通过 、获得 个 靶点，将二者进行映射筛选出潜在靶点 个。网络分析筛选得到 个核心靶点。富集分析共涉及 个条目，包含分子功能 项，细胞成分 项，生物过程 项。富集分析得到 条信号通路。结论：蒽醌类、黄酮类等成分可能是关键药效成分，可通过调节磷脂酰肌醇 激酶（，）蛋白激酶 （，）、缺氧诱导因子 （，）、血管内皮生长因子（，）、转化生长因子 （，）等通路减少细胞凋亡、抑制细胞外基质合成，延缓肾脏纤维化。关键词：扶正化瘀降浊通络方；慢性肾衰竭；网络药理学；作用机制 ：中图分类号：文献标志码：文章编号：（），；，：，（），：年第 卷月第 期河南中医 （），（），（）（）（）：，：，：；（）；慢性肾衰竭（，）是慢性肾病持续发展的最终结局，主要表现为内环境失衡、代谢产物潴留及各系统症状，是各种原因导致肾功能进行性减退、代谢紊乱和临床症状组成的综合征 。发病机制复杂，西医治疗手段有限，对患者的生命与生活质量产生严重影响。祖国医学并无“慢性肾衰竭”这一病名记载，现代医家根据证候特点及临床表现，将其归属于“关格”“水肿”“肾劳”等范畴，认为“本虚标实，虚实夹杂”是其基本病机 ，“补脾益肾、通腑泄浊”是其治疗大法。叶传蕙教授基于此理论研发的具有扶正化瘀降浊功效的“肾康”广泛应用于临床，已成为治疗 的重要药物 。陈明教授在“肾康”的基础上，结合防治肝脏纤维化中使用“大黄虫丸”的经验，化裁出“通补并用、标本兼施”的“扶正化瘀降浊通络方”，该方以大黄、黄芪、熟地黄为君药，丹参、红花、酒水蛭、土鳖虫为臣药，黄芩为佐药，甘草为使药，诸药合用，达到健脾益肾、理气固本、通腑泄浊的目的。扶正化瘀降浊通络方治疗 疗效确切，但尚未阐明其药理学机制，值得深入研究。在多学科理论的基础上，网络药理学从不同角度分析药物治疗疾病的机制。该方法与中药多成分、多靶点、多途径的作用特点相契合 ，在中药领域的研究中得到广泛应用。本研究拟采取该方法探索扶正化瘀降浊通络方治疗 的药效成分、药物靶点、信号通路等信息，为今后基础研究提供大致方向。资料与方法 筛选主要活性成分经中药系统药理学数据库与分析平台（，）收集大黄、黄芪、熟地黄、丹参、红花、黄芩、甘草的化学成分，设置口服生物利用度（，）、类药性（，）对化学成分进行筛选；通过 数据库收集水蛭化学成分，利用 数据库 “药物 靶点”相似性模型，设置分数截止点 ，调整后 值 ，筛选水蛭活性成分；通过检索中国知网、维普网、万方数据、等国内外文献数据库，查阅土鳖虫活性成分相关文献，收集土鳖虫活性成分。结合 、数据库对活性成分分子结构进行验证，将结果保存为 格式文件。预测潜在靶点登录 数据库 ，上传活性成分相关结果，下载药物靶点名称、蛋白库编码、拟合分数等信息。拟合分数用于评价活性成分与靶点的匹配度，分值越高，二者越匹配。为提高预测精度，靶点纳入标准设为拟合分数。将纳入靶点的蛋白库编码整合到 数据库中，将其矫 年第 卷月第 期河南中医 正为人类相关蛋白编码。在 数据库、在线人类孟德尔遗传数据库（，）输入关键词“”检索 相关靶点，去重后构建 靶点库。将扶正化瘀降浊通络方作用靶点与 靶点数据上传 进行映射，交集靶点即为扶正化瘀降浊通络方治疗 的潜在靶点，并绘制靶点韦恩图。关键靶点相互作用网络将潜在靶点导入 数据库，进行蛋白互作（，）分析，筛选自由度高于均值的靶点建立子网络，选取子网络中的关键靶点构建 网络。将 网络的节点 、节点 和综合评分信息导入 软件 ，进行网络分析和可视化分析。“药物 成分 靶点”网络将关键靶点、药物活 性 成 分 及 其 对 应 靶 点 的 信 息 导 入 软件，建立“药物 成分 靶点”网络，选取各药物核心靶点度值排名前 位的活性成分作为核心成分。富集分析将关键靶点导入 数据库，进行基因本体（，）功能富集分析和京都基因与基因组百科全书（，）信号通路富集分析。“信号通路 靶点”网络构建将 相关通路与相应靶点信息导入 软件构建并分析“信号通路 靶点”网络。“药物 核心成分 核心靶点 信号通路”网络整合研究所得有效信息，将药物、核心化学成分、核心靶点及信号通路导入 软件构建并分析扶正化瘀降浊通络方治疗 的“药物 核心成分 核心靶点 信号通路”网络。结果 药物活性成分通过 数据库收集到大黄 个、黄芪 个、熟地黄 个、丹参 个、红花 个、黄芩 个、甘草 个化学成分，利用 、筛选得到大黄 个、黄芪 个、熟地黄 个、丹参 个、红花 个、黄芩 个、甘草 个主要活性成分；通过 数据库检索得到水蛭活性成分 个，利用 分析工具筛选得到主要活性成分 个，其中 个活性成分未找到相对应的作用靶点，通过分子结构验证，最终筛选得到主要活性成分 个；通过对已报道的土鳖虫活性成分进行系统整理，搜集得到活性成分 个，通过分子结构验证，筛选得到主要活性成分 个。君药大黄、黄芪、熟地黄的结果见表 。潜在靶点合并重复项，剔除假阳性项后得到大黄 个、黄芪 个、熟地黄 个、丹参 个、红花 个、黄芩 个、甘草 个、水蛭 个、土鳖虫 个作用靶点，整合得到扶正化瘀降浊通络方作用靶点 个。通过 、构建 靶点库，共涉及 个靶点。将二者进行映射，筛选出潜在靶点 个，见图。图 潜在靶点 图 关键靶点 网络潜在靶点 网络包含 个节点，条边，节点自由度均值为 。子网络包含 个节点，条边，节点自由度均值为 。子网络中靶点自由度大于均值的关键靶点共 个。关键靶点 网络包括 个节点，条边，平均节点自由度为 ，靶点自由度为均值 倍以上的核心靶点共 个，见表、图。图 关键靶点 网络 年第 卷月第 期河南中医 “药物 成分 靶点”网络将关键靶点、药物活性成分及其对应靶点的信息导入 软件，建立“药物 成分 靶点”网络。各药物与关键靶点存在相互作用的活性成分分别为大黄 个，黄芪 个，熟地黄 个，丹参 个，红花 个，黄芩 个，甘草 个，水蛭 个，土鳖虫 个，结果见图 。各君药度值排名前 位的活性成分见表 。表 大黄、黄芪、熟地黄主要活性成分序号来源编号活性成分 大黄 泽兰黄醇素 大黄 柠黄质 大黄 大黄素甲醚二葡糖苷 大黄 原花青素 ，没食子酸盐 大黄 大黄酸 大黄 番泻叶苷 大黄 芦荟大黄素 （氧代）葡萄糖苷 大黄 决明内酯 大黄 大黄素 葡萄糖苷 大黄 番泻叶苷 大黄 胡萝卜醇 大黄 棕榈碱 大黄 谷甾醇 大黄 芦荟大黄素 大黄 没食子酸 （没食子酸基）葡萄糖苷 大黄 （）儿茶素 黄芪 白桦脂酸 黄芪 华良姜素 黄芪 常春藤皂苷元 黄芪 谷甾醇 黄芪 异鼠李素 黄芪 ，二氧基 美迪紫檀素 黄芪 羟基异月桂醇 ，二 葡萄糖 黄芪 甲基异木糖醇 黄芪 ，二甲氧基枫杨果聚糖 葡萄糖苷 黄芪 美迪紫檀素 黄芪 联苯双酯 黄芪 芒柄花素 黄芪 异黄酮 黄芪 毛蕊异黄酮 黄芪 山柰酚 黄芪 黄芪 异微凸剑叶莎醇 黄芪 黄芪异黄烷苷 ，二氧基 葡萄糖苷 黄芪 ，二羟基 ，二甲氧基紫檀烯 黄芪 槲皮素 熟地黄 谷甾醇 熟地黄 豆甾醇 年第 卷月第 期河南中医 表 核心靶点汇总表序号靶点名称自由度肿瘤抑制蛋白 （，）蛋白激酶 （，）结合蛋白 （，）丝裂原活化蛋白激酶 （，）白细胞介素 （，）信号传导及转录激活因子 （，）细胞周期蛋白 （，）血管内皮生长因子受体 （，）表皮生长因子受体（，）表皮生长因子（，）磷脂酰肌醇 激酶催化亚单位 （，）雌激素受体 （，）热休克蛋白 （，）连环蛋白 （，）胰岛素样生长因子 （，）微球蛋白（，）基质金属蛋白酶 （，）图 “药物 成分 靶点”网络 富集分析 富集分析共涉及 项生物功能，其中 项与关键靶点显著相关（），显著相关项中包含分子功能 项，细胞成分 项，生物过程 项。按 值从低到高排序，取 年第 卷月第 期河南中医 各类别中排名前 位的生物功能进行分析，见图。通路分析共涉及 条信号通路，与关键靶点显著相关（）的通路共 条。筛选出与 相关的 条关键信号通路进行分析，见图 。表 君药治疗慢性肾衰竭的核心成分汇总表药物中文名称自由度大黄芦荟大黄素 （氧代）葡萄糖苷大黄大黄素 葡萄糖苷大黄大黄素甲醚二葡糖苷黄芪常春藤皂苷元黄芪白桦脂酸黄芪联苯双酯熟地黄豆甾醇熟地黄谷甾醇图 富集分析图 通路分析 “信号通路 靶点”网络将相关通路与相应靶点信息导入 软件，构建“信号通路 靶点”网络，选取度值排名前 位的靶点进行分析，见表、图。表“信号通路 靶点”网络排名前 位的靶点序号靶点名称自由度 图“信号通路 靶点”网络 “药物 核心成分 核心靶点 信号通路”网络将研究结果导入 软件，建立“药物 核心成分 核心靶点 信号通路”网络，见图。图 “药物 核心成分 核心靶点 信号通路”网络 年第 卷月第 期河南中医 讨论君药是方中不可或缺且药力居首，针对主病或主证起主要治疗作用的药物，扶正化瘀降浊通络方以大黄、黄芪、熟地黄为君，大黄性寒、味苦，有凉血解毒、泻下攻积、逐瘀通经等功效。大黄素甲醚二葡糖苷等蒽醌类成分可能是大黄的核心药效成分。发病机制复杂，正虚是发病的基础，血瘀是主要病理改变，浊毒是疾病进展的首因 。针对血瘀这一病理改变，大黄可通过改变机体血流动力学特征、改善局部微循环、预防血栓形成等药理作用发挥逐瘀通经的功效。现代药理学研究表明，大黄可通过调节机体血管内渗透压的变化，使细胞外液重新分布，从而改善肾脏微循环、改变机体血流动力学特征 。西医代谢产物潴留的概念与中医的浊毒极其相似，浊毒既是机体内积聚的病理产物，也是疾病发生发展的致病因素。大黄具有通利水谷、涤荡胃肠的功效，可给邪出路，使浊毒从二便解，避免闭门留寇。大黄蒽醌类活性成分能有效抑制结肠水通道蛋白的表达，降低 酶活性，从而增加肠道内水含量，避免大便过于干燥；还对肠壁黏膜和肌内神经丛有刺激作用，增加结肠的蠕动次数，发挥泻下作用 。此外，大黄素亦能增加输尿管平滑肌的活性，降低肾髓质基底膜侧 酶活性，起到通利小便的作用。因而可知，大黄蒽醌类活性成分可通过泻下攻积、逐瘀通经等功效，对血瘀、浊毒等致病因素发挥治疗作用。黄芪味甘、性温，有补气固表、利尿托毒等功效。本研究筛选得到 个黄芪主要成分，以黄酮类、多糖类、皂苷类成分为主。黄芪总黄酮在体内和体外均有免疫调节功能，能调控丝裂原活化蛋白激酶（，）、核转录因子（，）在巨噬细胞中的表达，抑制 、肿瘤坏死因子等炎症因子的分泌，起到抗炎作用 ，还能抑制转化生长因子（，）表达、减轻炎症反应、抑制大量 生成，从而减少肾脏系膜细胞增殖、防止 过度生成、减轻肾脏结构损伤，延缓肾功能进展 。本研究筛选得到豆甾醇、谷甾醇 个熟地黄主要成分，二者均与多个关键靶点存在对应关系。此外，丹参、红花、酒水蛭、土鳖虫等药物中也有多个活性成分与多个关键靶点之间存在对应关系，表明扶正化瘀降浊通络方治疗 具有“多成分”“多靶点”的特点。扶正化瘀降浊通络方治疗 可能与凋亡过程的负调控、基因表达的正调控、细胞增殖的正调控等生物学过程有关，涉及胞外体、细胞外间隙、溶酶体等细胞成分，蛋白质结合、酶结合、受体结合等分子功能也参与其中。岳艳利等 使用不同浓度的黄芪总苷治疗糖尿病小鼠发现，黄芪总苷能通过下调糖尿病小鼠肾脏 的表达，进而抑制 等 主要组成部分的积聚，有效阻止肾功能损害的进程。王杰 通过动物实验研究发现，扶正化瘀降浊通络方可抑制 肾切除大鼠肾组织 的表达、促进 的表达，使 堆积减少、降解增加，发挥肾脏保护作用。提示扶正化瘀降浊通络方可能通过减少细胞凋亡、抑制 合成等机制延缓 的进展。整合 网络与“相关通路 相应靶点”网络中重 要 靶 点 的 信 息 发 现，靶 点 、存在重叠，可能是该方治疗 的首要靶点。通路分析结果表明：首要靶点主要涉及 、白细胞跨内膜迁移、细胞受体、细胞受体等通路。其中，、等信号通路与调节肾脏纤维化进程紧密相关。在梗阻型肾病大鼠的肾小管间质中 、磷酸化 表达水平显著上升 ，大黄可下调 的表达，减少大鼠肾间质中成纤维细胞的增生、炎症细胞的侵蚀，减慢纤维化速度 。在 发展过程中，、等通路扮演着重要角色，组织缺氧可激活 、等信号通路，从而平衡纤维化调节因子的表达，起到调控组织纤维化进程的作用 。陈艳琼 通过扶正化瘀降浊通络方治疗 肾切除大鼠研究发现：与假手术组相比，模型组大鼠肾脏组织 的表达显著降低，且与时间成反比，治疗组大鼠 显著增高。提示该方能上调 大鼠 的表达，减少肾脏纤维化，延缓病程进展。可促进肾小管上皮细胞转分化、炎症细胞募集与激活、合成与沉积，导致肾脏纤维化 。何凯杰 通过 肾切除大鼠研究发现，扶正化瘀降浊通络方可调节 年第 卷月第 期河南中医 信号通路关键因子 降低 表达水平、促进 表达水平改善 肾切除大鼠肾纤维化程度。近年来，大量研究揭示了 中肠道与肾脏之间的双向作用关系，即“肠 肾轴”理论 ，为 的治疗提供了新方向。肠道屏障受损是 “肠 肾轴”的核心环节。肠道免疫屏障中的 样受体 核因子 （）信号通路既是肠道免疫屏障的组成部分，也是连接机械屏障及生物屏障的桥梁，该通路的激活可使肠道炎症级联放大 。等 研究证实 患者肠道菌群多样性降低，硫酸吲哚酚、脂多糖、硫酸对甲酚等毒素增加，高水平的硫酸吲哚酚可激活肠上皮细胞 通路，促进炎性细胞因子的生成并进入循环导致全身炎症和 的进展，提示肠道黏膜免疫活化是诱导全身性微炎症反应和 进展的重要病理机制，调控 信号通路的表达是纠正肠道黏膜免疫偏移、促进肠道屏障功能修复、延缓 进展的关键。本研究发现，扶正化瘀降浊通络方除了与 、等肾脏纤维化经典通路密切相关外，还涉及 、细胞受体、细胞受体等炎症和免疫相关的通路。这既是对扶正化瘀降浊通络方治疗 相关研究结果的一个佐证，也为该方更明确的机制研究提供了参考依据。结合“肠 肾轴”理论及相关领域的研究进展，扶正化瘀降浊通络方能否通过重塑肠道菌群稳态，平衡肠肾免疫微环境而调控“肠 肾轴”以延缓 进展呢？结合本研究结果推测，扶正化瘀降浊通络方可能通过平衡肠道菌群失调，调节 信号通路的表达，从而减轻肠道及全身炎症反应，调控机体免疫功能，发挥肾脏保护作用，但该假说有待进一步多学科研究的验证。参考文献：王海燕，赵明辉 肾脏病学 版 北京：人民卫生出版社，：李付文，徐军建，袁慧，等 中医治疗慢性肾衰竭的研究现状及进展 河北中医，（）：楚秀丽，余海龙，詹华奎 叶传蕙教授多途径治疗慢性肾衰终末期患者经验拾珍 亚太传统医药，（）：，：，（）：赵苗青，李丰，石彬彬，等 系统药理学（）：数据库及其应用 中医药信息，（）：李梢，张鹏，古槿，等 基于生物网络的关系推断原理、方法与应用 中国科学（信息科学），（）：，：，：，：，（）：，：，（）：霍静，张建斌 数据库检索在医学遗传学混合式教学中的应用与评价 中国高等医学教育，（）：，（）：何凯杰，陈艳琼，陈明 从“浊毒”论治慢性肾功能衰竭 世界最新医学信息文摘，（）：，张开弦，姚秋阳，吴发明，等 大黄属药用植物化学成分及药理作用研究进展 中国新药杂志，（）：纪晓萍，张炯丰，方东生，等 大黄中游离蒽醌影响溃疡性结肠炎模型小鼠泻下、肠推进能力的机制 黑龙江中医药，（）：，（）：苏晓文，农小欣，王振常，等 黄芪有效活性成分对肝 年第 卷月第 期河南中医 纤维化作用机制的研究 河南中医，（）：于晓霞，吴华，边艳，等 黄芪甲苷对局灶节段性肾小球硬化小鼠尿蛋白的影响 重庆医学，（）：，吴雍真，李倩，管连城，等 黄芪多糖对庆大霉素致肾损伤豚鼠维生素 及 、信号通路的影响 湖北民族大学学报（医学版），（）：，岳艳利，米秀华，沈丽萍 黄芪总苷（）对糖尿病小鼠肾脏的保护作用机制 药物生物技术，（）：王杰 扶正化瘀降浊通络方对 肾切除大鼠肾组织 、表达的影响 成都：成都中医药大学，彭红霞，陈明，张超，等 单侧输尿管结扎对大鼠肾间质 表达的影响 基础医学与临床，（）：陈新 基于 信号通路研究大黄附子汤加减治疗慢性肾衰竭大鼠的机制 福州：福建中医药大学，陈永祥，王明娟，周舟 基于 通路研究理中汤治疗胃溃疡大鼠的作用机制 河南中医，（）：林永强，陈恬恬，王超超，等 慢性肾脏病患者血清 、与肾小管间质纤维化及疾病进展的关系 中华全科医学，（）：，陈艳琼 扶正化瘀降浊通络方对 肾切除大鼠肾组织 、表达的影响 成都：成都中医药大学，?，?：，（）：何凯杰 扶正化瘀降浊通络方对 肾切除大鼠肾脏组织 、表达的影响 成都：成都中医药大学，徐蕾，马晓燕 基于“肠 肾轴”理论治疗慢性肾脏病研究进展 陕西中医药大学学报，（）：，（）：，（）：收稿日期：作者简介：何剑川（），男，四川南充人，医学硕士，住院医师。通信作者：陈明，：（编辑：孙亚萍）年第 卷月第 期河南中医