内生真菌Alternaria sp.GHX-P17代谢产物防治广藿香青枯病及保护酶的变化.pdf

广藿香是著名药材青枯病是威胁广藿香生产和质量的主要病害 针对从广藿香茎叶中分离出的 株有抑菌活性的内生真菌 .研究其代谢产物对广藿香青枯病的防治作用及耐病机制 在室内通过人工接种 .菌株与喷施粗提物稀释液 种方式于不同时间调查广藿香青枯病的发病率和严重度并计算其病情指数()同时对处理后不同时间的广藿香苯丙氨酸 解 氨 酶()、过 氧 化 物 酶()和 超 氧 化 物 歧 化 酶()种保护酶活性进行测定 结果表明:().处理后青枯病 显著降低与对照比较 后 降低为.方差分析呈显著性差异(.)()随着处理时间延长青枯病严重度升高缓慢严重度等级降低到 时处理组的严重度明显低于对照防治效果达到.()处理后的广藿香 种保护酶、和 活性均增强但 种酶活性高峰出现时间不同即 随时间逐渐升高 先升高后降低然后又升高出现 个峰值 快速升高后逐渐降低这表明内生真菌菌株 .可以提高广藿香 种保护酶活性延缓了青枯菌的侵染过程降低了青枯病的发病程度 该研究结果为植物内生真菌次级代谢产物活性成分研究及生物农药开发提供了参考关键词:内生真菌 代谢产物 防治作用 青枯病 广藿香 保护酶中图分类号:.文献标识码:文章编号:().收稿日期:基金项目:国家自然科学基金()国家中医药管理局全国中药资源普查项目()国家公共卫生服务补助资金项目财社()号第一作者:程小卿()硕士研究生主要从事药用植物与中药药剂研究().通信作者:王利国博士主要从事中药材种质资源鉴定研究().(.):.().()()().:().(.).().().:广藿香()为唇形科刺蕊草属一年生草本植物干燥全草可入药是著名南药具有芳香化浊开胃止呕发表解暑之功效(李薇和徐鸿华)新的临床研究发现以广藿香为主打成分的宣肺败毒基础方剂在预防新型冠状病毒肺炎()方面也有不错的疗效(王钏等徐旭等)生产上广藿香青枯病()是威胁广藿香生产和质量的主要病害每年减产 广藿香青枯病是由茄科雷尔氏菌()引起的一种细菌性病害该菌被认为是热带与亚热带地区最重要的病原细菌之一可危害多种作物 茄科雷尔氏菌主要从根部伤口入侵穿过皮层进入维管束产生侵填体()和胼胝质()堵塞导管和筛管引起寄主青枯死亡 青枯病属于土传病害较难防治除常规的农业防治和化学防治外多人也从生防角度对青枯病防治进行了研究 例如烟草作为典型青枯病指示植物()张欣悦等()从烟草根际分离出 株拮抗细菌菌株 和 用于防治室内烟草青枯病具有一定的防效 等()用 基因插入突变获得的无致病力青枯菌突变株番茄青枯病病情显著降低内生菌因长期定殖于宿主植物组织内与宿主协同进化二者形成了一种非常复杂的共生关系并影响着宿主植物各种成分的积累和对胁迫的应激反应()几乎所有被研究过的植物中均能检测到内生菌的存在这些内生菌分布广且具有丰富的生物多样性 药用植物是挖掘活性内生菌资源的重要宝库其内生菌群落组成丰度、定殖率、分离频率、优势种群数量超过其他非药用植物 目前已从铁皮石斛()(胡 克 兴 等 周 琢 艳 等)、甘 草()(陈 静 等)、杜 仲()(梁 雪 娟 等)、拐枣()(.)、期程小卿等:内生真菌 .代谢产物防治广藿香青枯病及保护酶的变化茅苍术()(吕立新等)等药材中分离出具有不同生理活性的内生菌并通过对活性代谢物组分分析筛选出一批有新颖化学结构的潜在先导物为抗氧化、抗肿瘤、抗菌药物的研发开辟了新途径内生菌与宿主互作间产生的小分子次生代谢物对宿主的生长发育、系统防御以及宿主代谢产物的合成起着关键的调控作用(.)活性内生菌能够产生与宿主植物相同或相似的活性代谢物这些活性物质通过调控宿主防御酶合成关键基因的表达而增强宿主的抗性反应(彭淑萍等)前期该文 团队对 种广藿香栽培品种牌香(.)和 湛 香(.)内生真菌群落结构组成进行了研究(王利国等)从牌香中分离出 株具有活性的内生真菌 鉴定为链格孢属真菌(.)通过室内平板对峙实验发现该菌株产生的代谢产物有较明显的抑菌活性 为进一步了解 .菌株及其代谢物对植物病害的防治作用机理探究内生菌与宿主防御酶基因表达之间的关系本文通过室内人工接种孢子悬浮液和喷施代谢产物粗提物两种方法测定处理后不同时间、和 种酶活性的变化方式及对广藿香青枯病的防治效果材料与方法.样品来源供试材料选用广藿香组培苗移栽于花盆室内培养至 以上 接种用青枯菌菌株 由广州中医药大学贺红教授提供菌株购自广东省科学院微生物研究所菌种保藏中心 供试内生真菌菌株 由广州中医药大学中药种质资源与分子鉴定 团队从牌香上分离获得.菌株活化与样品提取青枯菌 菌株活化采用平板划线培养培养基 为 营 养 琼 脂 培 养 基()(北京奥博星)内生真菌 代谢产物采用悬浮液振荡培养用内径 的打孔器切取 平板上产孢的内生真菌菌块放于 液体培养基中振荡培养其中一组培养液振荡培养 后配成孢子数达 的孢子悬浮液备用另一组连续振荡培养 将已发酵的菌液在 下冻融 次后用超声波细胞破碎仪破壁(宁波新芝)以释放胞内产物 过滤去除菌丝体 滤液冷冻干燥 甲醇浸提配成母液备用.接种青枯菌接种参考刘丹等()的伤根浸泡方法 内生真菌接种采用拇指蘸取含石英砂的孢子悬浮液轻轻涂抹在组培苗叶片的正面于饱和湿度下 暗培养 待侵染成功后将广藿香苗放回光照培养箱(上海一恒)照光培养光照强度 照光时长 同时将内生真菌提取液母液用无菌水稀释成.、.、.于接种保湿结束后喷施在组培苗叶片上隔天再喷施 次 实验设对照组对照组为同一批广藿香组培苗但未接种青枯菌()和喷施 代谢物实验重复 次每次每浓度处理 株.调查方法与数据处理接种后于、调查广藿香青枯 病 发 病 率()和 严 重 度 计 算 病 情 指 数()发病率()发病株数/调查总株数 病情指数()(各级病株数各级严重度)/(调查总株数最高严重度)广藿香青枯病严重度划分标准参考中华人民共和国国家标准/关于烟草青枯病分级调查方法及芝麻青枯病严重度分级标准(李信申等)广藿香青枯病标准如下:级为全株无病 级为茎基部病斑散射状、病斑不连续呈狭长型叶片不凋萎 级为茎基部病斑合并环绕茎围不超过/的叶片轻度凋萎下部少数叶片出现青枯 级为病斑超过茎围的/但未全部环绕茎围/叶片青枯 级为茎部病斑环绕茎围/以上叶片凋萎或青枯 级为病株青枯死亡用 .软件中的皮尔森相关系数()法对处理组和对照组发病率和病情指数相关性进行分析采用单因素方差分析()中的 检验进行差异显著性分析 当.时差异显著.、及 活性测定接种 后 定 时 取 样 测 定 超 氧 化 物 歧 化 酶()、过 氧 化 物 酶广 西 植 物 卷()和 苯 丙 氨 酸 解 氨 酶()活性 测定参照李合生等()的方法以 下 值变化.为 个酶活性单位()活性大小以每克蛋白的酶单位()表示 活性采用愈创木酚法进行测定以每分钟每克蛋白的 值()表示 活性以抑制 光还原 为 个酶活性单位以每克蛋白的单位数()表示 使用日本岛津公司的 型紫外可见分光光度计测定 值以标准牛血清蛋白为对照计算总可溶性蛋白含量以未接种和未喷施 的广藿香为空白对照 实验重复 次结果与分析.青枯病严重度变化接种青枯菌 后对照广藿香靠近茎基部开始出现少量褪色斑病斑呈散点状达到严重度 级(图:)到 时严重度为 级的广藿香达到症状显示为茎基部病斑向上延伸扩大环绕茎围超过/下部叶片出现少量青枯死亡(图:)到 时病斑连片绕茎呈黑褐色大部分广藿香青枯死亡严重度为 级(图:).代谢产物对青枯病的防治作用由表 可知不同浓度处理的广藿香与对照比较青枯病发病率变化不大 检验表明处理组与对照组无显著性差异(.)后平均发病率为.到 时处理组发病率为.对照组发病率为 随着处理时间的延长 提取液可以有效减缓广藿香青枯病发病程度表现为青枯病严重度降低 减少 由表 可知随着喷施浓度增加和时间的延长防治效果开始显现 处理后 喷施了浓度为.和.的广藿香青枯病 显著低于对照组和.处理组 检验呈显著性差异(.)到 时.和.处理组的广藿香平均 为.而对照组为.防效达.保护酶活性变化.广藿香接种青枯菌后处理组和对照组 活性普遍升高但升高幅度相差不大 后处理组 活性开始缓慢升高到 时和 处理的 活性明显高于对照组和.处理到 时活性升高 值 达 到 最 大 此 时 升 高 幅 度 比 对 照 高 出.之后活性略有下降但仍维持在一个较高的水平.处理的 活性始终和对照相差不大表明低浓度的菌株提取液未能激发提高广藿香的防卫反应(图).提取液对 活性变化的影响与 不同 由图 可知接种后 对照组和处理组 活性迅速升高但是处理组 活性升高速率明显快于对照 时处理组 活性到达第 个高峰比对照高.之后开始下降在 至 期间处理组 活性一直维持在较低水平到 时处理组 活性再次升高到达第 个高峰升高幅度与第 峰持平之后逐渐下滑 第 次升高应该与清除广藿香体内过度积累的活性氧有关因为青枯菌侵染会 引 起 寄 主 释 放 大 量 活 性 氧 即 氧 爆 发()第 峰出现的时间和 活性峰值达到时间相近表明 参与了细胞壁木质素的合成以加强细胞壁木质化程度.接种青枯菌 后处理组和对照组广藿 香 的 活 性 开 始 升 高 、处理的广藿香 升高幅度明显高于对照组到 时处理组和对照 活性同时升到最高之后开始下降 后 活性下降了.到 时 几乎回到了 的活性值但仍维持在一个较高水平(图)作为植物抗氧化剂主要用于清除过度积累的氧自由基 活性变化趋势表明接种后 氧自由基的大量产生激发了 活性有利于消除氧自由基过度积累对细胞造成的伤害从而保证细胞内正常代谢功能的运转讨论与结论植物内生菌具有物种多样性和多重生理活性其对宿主生长的影响多样且复杂 目前已从多种植物中分离出有活性的内生菌这些内生菌除自身分泌的代谢小分子物质具有抗氧化(杨明俊等)、抗菌(王沫等)、抗肿瘤(缪莉等)等作用外 其与宿主长期共生过程中还 期程小卿等:内生真菌 .代谢产物防治广藿香青枯病及保护酶的变化.接种后 .接种后 .接种后 .图 接种青枯菌后不同时间广藿香青枯病严重度变化.表 内生真菌 提取液对广藿香青枯病发病率的影响()()接种后时间 ()浓度()发病率().发病率().发病率().发病率().注:同一行中平均值后不同的小写字母表示相互之间差异显著(检验.)下同:(.).表 内生真菌 提取液对广藿香青枯病 的影响()()接种后时间 ()浓度()病情指数().病情指数().病情指数().病情指数().广 西 植 物 卷 表示显著差异(.)表示极显著差异(.)下同 (.)(.).图 内生真菌 提取液对广藿香 活性的影响.图 内生真菌 提取液对广藿香 活性的影响.能协助宿主增强抵抗各种生物和非生物因子的胁迫提高宿主的抗病和耐病能力 研究最持久也最 为 深 入 的 是 麦 角 菌 科()的 属内生菌()(.)长期定殖于干旱和盐碱地逆境环境下的图 内生真菌 提取液对广藿香 活性的影响.禾本科牧草和杂草中其通过合成生物碱等次生代谢物来帮助禾草抵御害虫、病原菌等生物的侵害同时 也能改善禾草对干旱、盐碱、重金属等非生物胁迫的抵抗能力(.李春杰等)宋梅玲等()研究发现 不仅对活体禾草抗逆性有重要影响随着气温降低禾草和 共生体组成的凋落物其 还能通过调节保护酶的活性提高凋落物的全氮、木质素和纤维素的降解实现禾草生命活动的良性有机循环 目前室内通过各种平板对峙实验许多研究者从各类植物中筛选出一批具有抑菌或拮抗活性的内生菌这些活性菌与病原菌共培养过程中释放的次生代谢物多种多样均表现出较强的抑制病原真菌菌丝生长和抑制病原细菌和病原线虫繁殖的能力(.)就内生真菌而言早期分离出来的活性内生真菌大多属于腐生菌(.)按照现代菌物分类系统我们从广藿香获得的链格孢菌 菌株为子囊菌门下的座囊菌纲()、格孢腔菌目()、格孢腔菌科()的链格孢属真菌属兼性寄生菌(贺新生)目前真菌索引数据库()记录的 种及种下链格孢菌中除了病原链格孢菌外有一部分属于宿主内生链格孢菌其活性作用值 期程小卿等:内生真菌 .代谢产物防治广藿香青枯病及保护酶的变化得深入研究 前期 团队在研究两种栽培型广藿香不同生长期内生真菌群落组成变化中分离出 株内生真菌并从中初筛出几十株具有活性的菌株这些菌株在抗氧化和抗菌方面均有较好的表现 .室内平板对峙实验表 现 出 较 强 的 广 谱 抗 菌 活 性 对 大 肠 杆 菌()、金黄色葡萄球菌()和茄科雷尔氏菌均有较好的抑菌效果 本研究通过喷洒 代谢提取物进一步表明该菌具有延缓青枯病发病时间降低青枯病严重度的能力防效达.内生菌及其代谢物不仅能够影响宿主本身逆境下的各种应激防御反应还能增强非宿主植物抵御外部胁迫的耐受能力 一方面内生菌通过拮抗作用阻止病菌侵染或通过竞争植物组织位点的方式减缓病菌的蔓延另一方面内生菌通过激活植物免疫修复通道和提高防御酶活性以释放更多抗胁迫因子减轻植物受到的各种生理性伤害(伊帕热帕尔哈提等)引起植物病害的胁迫因子多样包括由病原菌侵染引起的侵染性病害以及由干旱、水涝、土壤盐碱、大气污染、重金属超标和营养缺乏等导致的非侵染性病害 宿主与这些胁迫因子互作过程中测定保护酶活性变化和丙二醛()含量是常用的手段之一(朱 艳 蕾)防 御 性 保 护 酶()是宿主受到外部胁迫后主动产生的活性酶也是研究宿主抗逆性的常用指标指标包括、和 早期我们对保护酶在胶孢炭疽菌()侵染墨兰组织后活性表现进行了研究(王利国等)这些保护酶在清除氧自由基催化寄主细胞壁木质素和病程相关蛋白()合成中发挥着重要的作用 本实验通过测定 种保护酶活性的变化进一步证实 能够激发宿主、和 的活性 种保护酶通过激活宿主不同的防御因子提高宿主的抗逆能力在广东地区广藿香生长期不开花不结种子种植主要通过无性繁殖材料或组培苗进行栽培无法通过常规育种手段繁育抗病品种加之连年栽培青枯病越发严重 除了常规的农业防治和化学防治外许多人也从多角度对青枯病生物防治进行了研究部分成果已应用于生产中 目前青枯病生物防治主要研究领域有拮抗菌的筛选包括芽孢杆菌()、假单胞杆菌()及放线菌()的利用和无致病力突变株的筛选等 内生真菌代谢物在防治病原菌侵染和激发寄主抗病能力方面的作用无疑为我们提供了一条可以利用的生物防治途径参考文献:.():.陈静 许贞 张雪 等.不同产地甘草内生真菌多样性及分离条件研究.药学学报():.():.:.():.():.():.:.():.:.():.:.贺 新 生.现 代 菌 物 分 类 系 统.北京:科学出版社.():.胡克兴 侯晓强 郭顺星.铁皮石斛内生真菌分布.微生物学通报():.():.():.李 春 杰 王 正 凤 陈 泰 祥 等.利用禾草内生真菌创制大麦新种质.科学通报():.:.李合生 孙群 赵世杰.植物生理生化实验原理和技术.北京:高等教育出版社.广 西 植 物 卷 .():.李信申 肖运萍 黄瑞荣 等.芝麻青枯病严重度对芝麻生长与产量的影响.植物保护学报():.:.李薇 徐鸿华.广藿香规范化栽培技术.广州:广东科技出版社:.():.梁雪娟 张水寒 张平 等.不同产地杜仲皮内生真菌种群结构的比较分析.中国中药杂志():.():.刘丹 贺红 黄海波 等.广藿香青枯病菌的分离培养及致病性测定.中草药():.():.吕立新 王宏伟 梁雪飞等.不同化学型和季节变化对茅苍术内生真菌群落多样性的影响.生态学报():.:.():.缪莉 杨佳凡 姜薇等.银杏内生真菌 抗肿瘤活性物质的分离与鉴定.微生物学通报():.():.彭淑萍 董诚明 朱畇昊.响应内生菌侵染的两个地黄茉莉酸合成关键基因的克隆与表达分析.植物研究():.().:.:.():.宋梅玲 王玉琴 王宏生 等.内生真菌对高寒草地紫花针茅凋落物分解的影响.草业学报():.():.王钏 明浩 贾文 等.中药治疗 例重型 用药规律及药效特征分析.中国中药杂志():.():.王利国 肖晶晶 邓月婷 等.两种栽培型广藿香内生真菌群落组成变化.广西植物():.():.王利国 李玲 郭穗绵.炭疽菌对墨兰叶片 种保护酶活性的影响.园艺学报():.():.王沫 陈玉婵 孙章华 等.广藿香内生真菌 细胞毒活性次级代谢产物研究.中国中药杂志():.().():.徐 旭 张 莹 李 新 等.各地区中医药预防新型冠状病毒肺炎()方案分析.中草药():.():.杨明俊 张琛 晏祖花.乌拉尔甘草内生真菌分离及活性初探.中草药():.():.伊帕热帕尔哈提 祖力胡玛尔肉孜 田永芝 等.荒漠植物内生菌多样性及其增强农作物抗旱和耐盐性的研究进展.生物技术通报():.():.张欣悦 罗翠琴 陈小洁 等.两株防治烟草青枯病的烟草根际拮抗菌.中国烟草学报():.():.周琢艳 刘玉寒 刘文洪 等.铁皮石斛内生真菌的分离及其体外抑菌和抗肿瘤活性初步研究.中草药():.:.朱艳蕾.银砂槐内生细菌分离、生理特性及促生抗逆作用研究.西安:陕西师范大学.(责任编辑 李 莉 王登惠)期程小卿等:内生真菌 .代谢产物防治广藿香青枯病及保护酶的变化