人参皂苷Rg1对心肌纤维化模型小鼠TLR4_MyD88通路的影响.pdf

基础研究人参皂苷 对心肌纤维化模型小鼠 通路的影响陈昕，杜，高磊，阚晨静，黄项鸣，徐兴闻，朱军，杨平印，石开虎（溧阳市中医医院 介入科，江苏 溧阳 ；南京中医药大学附属中西医结合医院 心胸外科，江苏 南京 ；南京中医药大学中医学院 中西医结合学院，江苏 南京 ）摘要目的观察人参皂苷 （）对心肌纤维化模型小鼠 样受体 髓样分化因子 （）信号通路的影响。方法 只雄性 小鼠随机分为对照组、模型组和人参皂苷 干预组，造模成功后取各组小鼠心肌组织，苏木精 伊红染色法（）、马松染色（）染色观察心肌组织学改变，免疫印迹试验（）检测各组小鼠心肌组织中 信号通路 、及 等凋亡蛋白的表达，聚合酶链式反应（）检测心肌组织中 、等基因表达。结果 染色和 染色结果均显示，对照组小鼠心肌细胞形态规则正常，细胞间排列顺序整齐；组中纤维化后的小鼠心肌细胞形态和心肌细胞不规则；结果表明，与对照组比较，组小鼠心肌组织中 、蛋白表达明显升高，表达降低，差异有统计学意义（）；与 组比较，组小鼠心肌组织中 、的表达明显降低，表达升高，差异有统计学意义（）；结果表明，与对照组比较，组小鼠心肌组织中 、的 明显升高，表达降低，差异有统计学意义（）；与 组比较，组小鼠心肌组织中 、的 明显降低，表达升高，差异有统计学意义（）。结论人参皂苷 可能通过影响心肌纤维化模型小鼠心肌细胞 信号通路活化，延缓心肌纤维化进程，发挥心脏保护作用。关键词人参皂苷 ；通路；细胞凋亡；心肌纤维化 中图分类号 文献标识码 文章编号 （）：，（，；，；，），（）（）第 卷第 期 年 月贵 州 医 科 大 学 学 报 基金项目 江苏省自然科学基金项目（）；江苏省中医药研究院青年研究项目（）通信作者 ：引用本文：陈昕，杜，高磊，等 人参皂苷 对心肌纤维化模型小鼠 通路的影响 贵州医科大学学报，（）：，（），；，（），（），（），（），（）；心肌纤维化是多种心脏疾病共同的病理过程，是心脏结构重构的重要环节之一。心肌细胞凋亡增加，心肌胶原蛋白分泌增多、胶原纤维不断沉积、心肌组织发生不同程度的纤维化，久之心脏顺应性降低、结构改变，从而引发心律不齐、心力衰竭等心脏疾病 。有研究指出，样受体 髓样分化因子 （，）信号通路在延缓纤维化进程中有重要作用，其主要是通过调控心肌细胞凋亡达到干预心肌纤维化进程的目的 。中药“人参”在临床上参与很多心脏疾病的治疗，而人参皂苷 （，）作为其主要效用成分，有强心、抗休克、对抗心律失常、减轻心肌缺血缺氧再灌注损伤、促进心肌血管再生等重要作用，临床多用于治疗心肌梗死、动脉粥样硬化、心律失常等多种疾病 。申文宇等 研究指出，人参皂苷 能够调控内源性线粒体凋亡途径，抑制细胞色素 （，）释放，降低凋亡相关蛋白半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶 （，）、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶 （，）表达水平，减少大鼠心肌细胞凋亡、调节心律、保护心肌。关于人参皂苷 是否通过 通路干预心肌纤维化的研究较少，本研究旨在探索人参皂苷 通过调控 通路干预心肌细胞凋亡、影响心肌纤维化的机制，以期对临床治疗提供新思路。材料与方法 材料 实验动物选用成年雄性 小鼠 只，由江苏省中西医结合医院动物实验中心提供。所有动物实验符合实验动物学习指南，无菌喂养，饮用水和饲料均经过高温消毒，环境温度约在，湿度 。本实验研究获得江苏省中西医结合医院伦理委员会批准 许可证号 （苏）。主要试剂人参皂苷 药物采购于南京草本源生物科技有限公司，（货号 ）、（货号 ）、（货号 ）、胶原蛋白（，货号 ）、平滑肌肌动 蛋 白（，货 号 ）、（货号 ）抗体购买于 公司，（货号 ）、（货号 ）、辣根过氧化物酶（）标记的山羊抗兔二抗（货号 ）购买于 公司。研究方法 建模与给药方案 取 只成年雄性 小鼠，随机分为对照组、模型组和人参皂苷 组，对照组皮下注射 氯化钠溶液，模型组皮下注射异丙肾上腺素（，），治疗组皮下注射 、同时予以期陈昕等人参皂苷 对心肌纤维化模型小鼠 通路的影响人参皂苷 灌胃，次 ，连续干预 。给药期间所有小鼠均正常饲养，自由饮水。观察心肌组织病理学改变建模结束后，用 的戊巴比妥钠 腹腔注射，取血；后打开胸腔，游离心脏、离断主动脉，取出小鼠心脏用 的福尔马林溶液浸泡，脱水、石蜡包埋、切 薄片、烤片、脱蜡、烘干，分别马松染色（）、苏木精 伊红染色法（）染液染色，电子显微镜下观察。免疫印迹试验（）检测凋亡相关通路蛋白的表达取出冻存的心肌组织研磨，裂解液提取总蛋白，检测蛋白总量，用分离胶和浓缩胶进行分离蛋白后，将蛋白转移到 膜上，加入抗体 （）、（）、（）、（）、（）、（）、（），山羊抗兔二抗（）室温孵育 ，经 显影后，使用软件对 膜蛋白条带进行扫描分析，计算灰度值，为内参。聚 合 酶 链 式 反 应（）检 测 、兔抗人单克隆抗体（，）、淋巴细胞瘤 基因（，）表达引物由生工生物在线引物设计（表），采用 （）提取心肌组织总 于 鉴定 纯度。取 总 为模板，参照 公司的试剂盒说明书进行逆转录聚合酶链反应（）。反应体系，实时定量 扩增，以 为内参照。反应结束后确认 的扩增曲线和融解曲线，进行 定量时制作标准曲线等。表 检测引物序列 基因方向序列（）正向 反向 正向 反向 正向 反向 正向 反向 正向 反向 统计学分析实验结果采用 软件分析，数据结果采用均数 标准差（）表示，多组间比较采用 分析，进一步两两比较采用 检验。表示差异有统计学意义。结果 心肌组织学改变 染色结果显示，对照组小鼠心肌细胞形态规则正常，细胞间排列顺序整齐；组中纤维化后的小鼠心肌细胞形态不规则，体积明显增大，组织间水肿明显，细胞排列紊乱；人参皂苷 组小鼠心肌细胞排列稍规则，细胞体积稍有增大，细胞排列恢复正常。见图 。染色结果显示，对照组中，心肌细胞形态正常、排列整齐，而 组中心肌细胞排列杂乱、大量胶原纤维聚集；人参皂苷 组小鼠心肌细胞形态接近正常、排列尚齐，偶可见少量蓝紫色聚集的胶原纤维聚集。见图 。凋亡相关通路蛋白的表达结果表明，与对照组比较，组小鼠心肌组织中 、纤维化蛋白表达明显升高，差异有统计学意义（），提示造模成功；与 组比较，组小鼠心肌组织中 、的表达明显降低，差异有统计学意义（），提示 对心肌纤维化有干预作用。见图 。与对照 组 比 较，组 小 鼠 心 肌 组 织 中 、蛋白表达明显升高，表达降低，差异有统计学意义（）。与 组比较，组小鼠心肌组织中 、的表达明显降低，表达升高，差异有统计学意义（）。见图 。、的基因表达 结果表明，与对照组比较，组小鼠心肌组织中 、的 明显升高，表达降低，差异有统计学意义（）；与 组比较，组小鼠心肌组织中 、的 明 显 降 低，表达升高，差异有统计学意义（）。见图 。贵 州 医 科 大 学 学 报 卷对照组 组人参皂苷 组图 各组小鼠心肌组织学改变（染色，）（，）对照组 组人参皂苷 组图 小鼠心肌组织病理改变（染色，）（，）图 各组 及 小鼠心肌纤维化相关蛋白表达 图 各组小鼠心肌组织中 、及 蛋白表达 ，期陈昕等人参皂苷 对心肌纤维化模型小鼠 通路的影响图 各组小鼠心肌组织中 、及 的基因表达 ，讨论心肌纤维化是多种心脏疾病发生心脏结构重构的关键病理基础，其发病机制复杂，目前认为心肌细胞外基质不断沉积在心肌纤维化中起重要作用 。而心肌组织中胶原纤维不断沉积，胶原比率失调、细胞排列紊乱是心肌纤维化的标志，其中含量最多的是 ，在心脏瘢痕组织中高表达。当胶原沉积增多，各型胶原比率失调和排列紊乱使心肌发生纤维化，并且纤维化发生会诱导更多的炎症因子释放，会进一步加重纤维化的 过程 。大量基础研究发现，通路作为经典的信号通路能够通过细胞凋亡、程序性坏死、焦亡等多种途径，减轻心肌细胞的氧化应激反应、控制心肌细胞炎症、减少细胞凋亡等途径调控心肌纤维化发展 。因此通过有效手段干预心肌纤维化进程有望能够用于临床心脏疾病的治疗。本实验用 以及 作为心肌纤维化的检测指标，本次实验研究发现，皮下注射异丙肾上腺素组的小鼠心肌组织中 、蛋白表达增加，说明心肌纤维化模型建立的成功，而通过人参皂苷 干预后 、蛋白表达恢复到正常组水平，说明人参皂苷 能够减轻 诱导的心肌纤维化损伤。本实验造模方法选用皮下注射 （）建立小鼠心肌纤维化模型 ，染色结果显示心肌细胞体积增大，排列紊乱，形态不规则，细胞间质不均匀增多，染色模型组心肌纤维排列紊乱，结构破坏，组织增生严重，并伴有细胞坏死，瘢痕出现，均提示皮下注射异丙肾上腺素能够建立心肌纤维化模型，人参皂苷 干预后细胞体积变小，排列恢复一定次序均说明人参皂苷 对 诱导的小鼠心肌纤维化有明显的改善作用，能够干预心肌纤维化进程。样受体中的经典受体 是一种膜蛋白受体，其主要是通过识别细菌脂多糖，结合可溶性穿梭蛋白 和 ，继而激活下游 及 信号通路，激活机体免疫应答，炎症因子 、大量释放，引起心肌损伤 。细胞凋亡存在于多种有心肌纤维化的心脏疾病中，有人认为多种病毒可以触发细胞凋亡从而加快了心肌纤维化进程，细胞凋亡可能是引起病毒性心肌炎向心肌病转变的第 种机制 。我国古典医籍 本草经 中谈到人参具有“主五脏、安精神、定魂魄、止惊悸”的作用 。人参皂苷 作为中药人参的主要成分，有增强心肌收缩力，稳定心率，改善心肌代谢等功能。彭程飞等 通过动物实验发现，人参皂苷 能够有效抑制大鼠急性心肌梗塞后的心肌纤维化发生。细胞凋亡途径有两种途径，分为线粒体途径和死亡受体途径，细胞外途径主要是死亡受体分子活化后，酶原募集，凋亡酶体激活，水解活化后，活化，激活下游 ，引起目标细胞发生凋亡；线粒体途径是激活 、等促凋亡细胞，引起细胞凋亡的发生 。等 通过实验研究发现，人参皂苷 能够干预 通路，缓解 诱导的心肌损伤，恢复心肌部分功能。此外，研究发现，平滑肌肌动蛋白 在大部分平滑肌肌型细胞的肌成纤维细胞中表达较高，而心肌纤维化的主要标志之一 。本实验在 组以及人参皂苷 组中检测了 、的表达，与对照组比较 组中 、的表达无论在 水平还是蛋白水平都明显升高，而人参皂苷 组较 组呈现出明显下降，说明 灌胃在 诱 导 的 心 肌 纤 维 化 模 型 中 能 降 低 、的表达。同时检测凋亡相关指标，发现 组较对照组小鼠心肌组织中 的表达明显升高，的表达则明显降低；而人参皂苷 组与 组比较，表达明显降低，的表达则升高明显，也证实了人参皂苷 能明显改善心肌纤维化组织中的细胞凋亡水平。综上所述，人参皂苷 可能通过抑制 信号通路活化，改善小鼠心肌组织中细胞凋亡水平，从而延缓心肌纤维化进程，发挥心脏保护作用。贵 州 医 科 大 学 学 报 卷 参考文献 ，（）：，（）：张洁 人参皂苷在心血管系统药理作用的研究进展 中医临床研究，（）：申文宇，李玉东，杨守忠 人参皂苷 对大鼠缺血性 再灌注心律失常的作用 临床心血管病杂志，（）：，（）：，（）：，（）：李永梅，任立群心肌间质细胞在心肌纤维化中的作用 心血管病学进展，（）：，（）：，（）：，（）：，（）：贺尚文，王月明，张慧，等 白头翁汤通过抑制 信号通路缓解 诱导的微血管内皮细胞炎性反应 畜牧兽医学报，（）：张玉蓉，汪静，朱晓宁，等 祛痰活血方调控 介导 信号通路抗 大鼠肝损伤的机制研究 四川中医，（）：于宁，宋囡，王莹，陈丝，等 四妙勇安汤抑制焦亡通路 防治动脉粥样硬化机制研究 中华中医药学刊，（）：，（）：吴少祯主编，王德群点评 神农本草经 中医古籍名家点评丛书 北京：中国医药科技出版社，：彭程飞，李佳，田孝祥，等 人参皂苷 抑制大鼠急性心肌梗死后心肌纤维化 现代生物医学进展，（）：，（）：，（）：，：，（）：，（）：，（）：，（）：，：，（）：（收稿，修回）中文编辑刘平英文编辑陈琳期陈昕等人参皂苷 对心肌纤维化模型小鼠 通路的影响