RNA干扰ITGA5的表达对宫颈癌细胞生长和侵袭的影响.pdf

复旦学报（医学版）Fudan Univ J Med Sci2023 May，50（3）RNA干扰 ITGA5的表达对宫颈癌细胞生长和侵袭的影响董晶 商双 谢锋（复旦大学附属妇产科医院宫颈及阴道早期疾病诊治中心 上海 200011）【摘要】目的研究 ITGA5 经 RNA 干扰后对宫颈癌细胞生长和侵袭的影响。方法应用 TNMplot、Kaplan-Meier Plotter、Human Protein Atlas 数据库分析 ITGA5 在宫颈癌中的表达和对患者生存率的影响，采用两条靶向ITGA5 的特异 siRNA 序列，进行 RNA 干扰实验。实验分为 siITGA5#1 干扰组、siITGA5#2 干扰组和阴性对照组（非特异性 siRNA）。实时定量 PCR和 Western blot法分别检测宫颈癌细胞中 ITGA5的 mRNA与蛋白水平，筛选内源性ITGA5 呈高表达的HeLa及C-33A细胞做后续实验。Western blot法评估siRNA干扰后宫颈癌HeLa/C-33A细胞中 ITGA5水平，并先后检测 c-Myc、BCL-2、Bax及 Vimentin、E-cadherin的表达变化，CCK-8法检测 HeLa/C-33A细胞增殖，流式细胞术检测细胞凋亡，Transwell小室侵袭实验评估细胞侵袭能力。结果与阴性对照组相比，特异性 siRNA 显著下调宫颈癌 HeLa/C-33A 细胞中 ITGA5蛋白的表达；宫颈癌细胞增殖明显受抑，细胞凋亡显著增加（P0.05）；c-Myc和 BCL-2 表达下降、Bax 表达升高。干扰 ITGA5 后，HeLa/C-33A 细胞侵袭能力显著降低，间质性标记物 Vimentin 的表达明显受抑，上皮细胞标记物 E-cadherin 表达水平明显增加。结论ITGA5 经 RNA 干扰后，能明显抑制宫颈癌细胞生长和侵袭，ITGA5对宫颈癌细胞侵袭能力的影响可能是通过调控上皮细胞间质化来实现的。【关键词】宫颈癌；ITGA5；细胞增殖；凋亡；侵袭【中图分类号】R737.33 【文献标志码】A doi：10.3969/j.issn.1672-8467.2023.03.003Effect of RNA interference with ITGA5 expression on cervical cancer cell growth and invasionDONG Jing，SHANG Shuang，XIE Feng（The Center for Diagnosis and Treatment of Early Cervical and Vaginal Diseases，Obstetrics and Gynecology Hospital，Fudan University，Shanghai 200011，China）【Abstract】ObjectiveTo investigate the effect of ITGA5 on cervical cancer cell growth and invasion after RNA interference.MethodsThe expression of ITGA5 in cervical cancer and the effect on patient survival rates were analyzed by database TNMplot，Kaplan-Meier Plotter and Human Protein Atlas.RNA interference experiments were performed by using two specific siRNA sequences targeting ITGA5.The experiment was divided into three groups：siITGA5#1 interference group，siITGA5#2 interference group，and negative control group（non-specific siRNA）.The mRNA and protein levels of ITGA5 in cervical cancer cells were measured by real-time quantitative PCR and Western blot，respectively，and HeLa and C-33A cells with high expression of endogenous ITGA5 were screened for subsequent experiments.ITGA5 levels in HeLa/C-33A cells after siRNA interference and the expression changes of c-Myc，BCL-2，Bax and Vimentin and E-cadherin were detected by Western blot.HeLa/C-33A cell 国家自然科学基金（82072872）Corresponding author E-mail： 网络首发时间：2022-08-09 16 42 00 网络首发地址：https：/ ITGA5的表达对宫颈癌细胞生长和侵袭的影响proliferation was determined by CCK-8，apoptosis was measured by flow cytometry，cell invasion ability was assessed by the Transwell compartment invasion assay.Results Specific siRNA significantly downregulated ITGA5 protein expression in cervical cancer HeLa/C-33A cells when compared with negative controls；cervical cancer cell proliferation was significantly inhibited，while apoptosis increased（P0.05），the expression of c-Myc and BCL-2 was decreased，while Bax was elevated.After interference with ITGA5，HeLa/C-33A cells showed a significantly reduced invasion capacity.Expression of the interstitial marker Vimentin was significantly suppressed，while E-cadherin（an epithelial cell marker）was significantly increased.Conclusion ITGA5 can significantly inhibit cervical cancer cell growth and invasion after RNA interference，and the effect of ITGA5 on the invasive ability of cervical cancer cells may be achieved by regulating interstilization of epithelial cells.【Key words】cervical cancer；ITGA5；cell proliferation；apoptosis；invasion*This work was supported by the National Natural Science Foundation of China(82072872).宫颈癌目前是全球女性第四大恶性肿瘤，在我国女性生殖系统肿瘤中高居第二1-2，且国内其发病率和死亡率都呈逐年增长趋势3-4，严重增加社会经济负担。宫颈癌的治疗往往存在术后转移，对化疗耐药，对放疗不敏感等问题，免疫治疗和靶向治疗成为近年的研究热点5-8。整合素家族是一类由 和 两个亚基通过非共价形成的异二聚体跨膜蛋白，在不同细胞或细胞中充当细胞表面黏附受体介导细胞之间或者细胞与细胞外基质（extracellular matrix，ECM）之间的双向信号转导9-10。ITGA5是整合素 链家族的成员，位于人染色体 12q13.13上，主要通过与整合素 1形成51 异二聚体跨膜蛋白发挥功能11-12。研究表明ITGA5在多种肿瘤中显著上调，通过调节肿瘤细胞的生长、迁移、侵袭和上皮间质转化参与肿瘤进展13-14。进一步研究表明，ITGA5 还与肿瘤细胞的干细胞特性相关，并能维持化疗抵抗15-16。这些研究结果提示 ITGA5 可作为肿瘤转移和化疗抵抗的潜在治疗靶点。然而，ITGA5在宫颈癌中的表达和生物学功能仍然未知。本研究通过数据库分析ITGA5 在 宫 颈 癌 中 的 表 达，并 从 细 胞 水 平 探 讨ITGA5对宫颈癌细胞生长和侵袭的影响。材 料 和 方 法主 要 实 验 试 剂 永 生 化 的 宫 颈 上 皮 细 胞NC104 以及人宫颈癌细胞系 CaSki、ME-180、SiHa、HeLa 和 C-33A 购自上海生科院细胞所并保存于液氮中；胎牛血清（FBS）与 DMEM 高糖培养基购自美国 HyClone公司；青霉素-链霉素购自北京天根生物科技有限公司；Cell Counting Kit-8试剂盒购自日本Dojindo Molecular Technologies 公司；Transwell 基质胶以及 AnnexinV-FITC/PI 凋亡检测试剂盒购自美国 BD Biosciences 公司；兔抗鼠 c-Myc 多克隆抗体（1 1 000）、E-cadherin 多 克 隆 抗 体（1 1 000）、Vimentin 多克隆抗体（1：1000）、BCL-2 多克隆抗体（1 1 000）购自美国 Cell Signaling Technology公司；Bax 多克隆抗体（ab32503，1 1 000）、兔抗鼠 ITGA5多 克 隆 抗 体（1 1 000）购 自 美 国 Thermo Fisher Scientific 公司；GAPDH 内参抗体以及二抗购自北京康为世纪生物科技有限公司。数 据 分 析 分 别 使 用 TNMplot 数 据 库（https：/ 的表达；Human Protein Atlas 数据库（HPA，https：/www.proteinatlas.org/）评估 ITGA5 在宫颈癌组织中的蛋白表达及预后；Kaplan-Meier Plotter数据库（https：/ ITGA5的 mRNA水平与预后的相关性。细胞培养 人宫颈癌细胞系HeLa与C-33A用含有 10%FBS的 DMEM 高糖培养基置于 37、5%CO2细胞培养箱中培养。每隔一天更换新鲜培养基。干扰序列 两条靶向ITGA5的特异性siRNA和非特异性siRNA均购自上海吉玛基因股份有限公司。实验分组 实验分为 3组：siITGA5#1干扰组、siITGA5#2干扰组和阴性对照组（非特异性siRNA）。siRNAs 转染 HeLa/C-33A 细胞 对数期生长的细胞约 1106个接种于直径 10 cm 的细胞培养皿中，待细胞融合度达到 40%60%时瞬时转染阴性331复旦学报（医学版）2023年 5月，50（3）对 照（Control）或 ITGA5 siRNAs，转 染 过 程 参 照lipofectamine RNAiMAX（美 国 Thermo Fisher Scientific 公司）说明书。转染 48 h 后收集蛋白验证干扰效率以及后续实验。RNA 的提取以及实时定量 PCR 根据 Trizol说 明 书 提 取 细 胞 总 RNA，引 物 序 列 如 下：内 参GAPDH 引 物 序 列，上 游 5-ACAACTTTGGT ATCGTGGAAGG-3，下 游 5-GCCATCACGCC ACAGTTTC-3，片段长度 101 bp；ITGA5 引物序列，上游 5-GGCTTCAACTTAGACGCGGAG-3，下 游 5-TGGCTGGTATTAGCCTTGGGT-3，片段长度 140 bp。反应程序：95 预变性 10 min，95 变性 30 s，60退火以及延伸 1 min，40 个循环。以GAPDH作为参照分析目的基因的表达差异。细胞活力测定 收集对数期生长的细胞，将大约 800 个细胞接种到 96 孔板每孔，分别于 24、48、72 h 时将 10 L 的 CCK 8 试剂添加到每个孔中，在 37 下孵育 2 h。用酶标仪（Bia-Rad）在 450 nm 处检测各孔的吸光度值，描述细胞生长曲线。流式细胞仪检测细胞凋亡 转染 48 h 后的细胞使用不含 EDTA 的胰酶消化细胞并收集，并根据AnnexinV-FITC/PI 凋 亡 检 测 试 剂 盒（美 国 BD Biosciences公司）说明书染色，标记早期和晚期凋亡细胞并通过流式细胞仪检测样品的凋亡水平。Transwell 检测 将融化的 Matrigel 基质胶（美国 BD Biosciences公司）用预冷无血清培养基按 1 5稀释，加入 Transwell小室，放入细胞培养箱中孵育2 h。收集细胞，约 2104个（100 L 无血清培养基）细 胞 接 种 到 上 层 Transwell 上 层，并 将 600 L 含20%FBS 的培养基添加到下室中。细胞培养箱中继续培养 2436 h，然后将细胞在 4%多聚甲醛中固定 20 min，用 0.1%结晶紫染色 15 min。使用棉棒去除未穿透的上部细胞后，对侵袭的细胞进行拍照和计数。Western blot 检 测 将 含 有 蛋 白 酶 抑 制 剂PMSF的 RIPA 细胞裂解液（美国 CST 公司）溶解细胞提取蛋白，冰上裂解 30 min 后，4 11 000g 离心后取上清测定蛋白浓度。加入上样缓冲液（北京索莱宝科技有限公司）100 加热 10 min，在 10%的SDS-PAGE 凝胶中分离、转膜、5%脱脂奶粉封闭30 min，根据目的蛋白的相对分子质量裁剪条带并与相应的抗体在 4 孵育过夜，洗膜后使用山羊抗兔 IgG-HRP二抗 60 min，随后显色、曝光。GAPDH作为管家基因标准化蛋白质表达。统计学分析 采用 GraphPad Prism 5.0 软件进行统计学分析并制图，数据以 xs表示。组间数据差异使用 t检验，P0.05为差异有统计学意义。结 果ITGA5 在宫颈癌患者中的表达水平以及生存分析 为了阐明 ITGA5在宫颈癌中的作用，我们先应用依赖于肿瘤基因组图谱（TCGA）的 GEPIA2和UALCAN 数据库分析平台，发现缺少足够的对照病例，分析结果不可靠。因此我们换用 TNMplot数据库分析了 ITGA5 mRNA 在正常组织以及肿瘤中的表达，发现 ITGA5 的 mRNA 水平在宫颈癌组织中 显 著 升 高（图 1A）。Kaplan-Meier 分 析 表 明，ITGA5呈高表达的宫颈癌患者 5年以及 5年以上总体生存率较低（图 1B）。Human Protein Atlas 数据库显示：宫颈癌组织中的 ITGA5蛋白表达水平与宫颈癌患者总体生存率呈负相关（图 1CD）。上述分析表明 ITGA5 在宫颈癌中呈高表达并可能作为原癌基因促进宫颈癌进展。敲低 ITGA5 的表达抑制宫颈癌细胞增殖和诱导细胞凋亡 鉴于 ITGA5 在宫颈癌组织中呈高表达，我们进一步在细胞水平做功能研究。首先检测了 ITGA5的 mRNA 及蛋白水平在正常宫颈上皮细胞 NC104 和 宫 颈 癌 细 胞 CaSki、ME-180、SiHa、HeLa、C33A 中的表达。与 NC104 细胞比较，内源性 ITGA5的 mRNA 及蛋白水平在多类宫颈癌细胞中呈高表达，尤其在 HeLa 及 C-33A 细胞中高表达最为显著（图 2A），故选择这两种细胞用于敲低ITGA5 做后续实验。采用 ITGA5 特异性 siRNAs转 染 HeLa/C-33A 细 胞，Western blot 检 测 显 示siRNAs 可有效下调 HeLa/C-33A 细胞内 ITGA5 的表达；干扰 ITGA5 后，细胞裂解液中增殖基因蛋白c-Myc、抗凋亡因子 BCL-2 显著下调，促凋亡因子Bax明显增加（图 2B）。CCK-8实验结果显示，与对照组相比，ITGA5 干扰组的细胞生长明显受抑（图2C，P0.01，t=7.932）。流式细胞术分析结果显示，干扰 ITGA5 后，HeLa/C-33A 细胞凋亡水平显著升高（图 2D，P0.01，t=8.908）。上 述 结 果 表 明ITGA5是影响宫颈癌细胞生长的重要基因，ITGA5332董晶，等.RNA干扰 ITGA5的表达对宫颈癌细胞生长和侵袭的影响对宫颈癌细胞生长的抑制作用可能是通过调控增殖和凋亡相关蛋白来实现的。体外敲低 ITGA5 的表达抑制宫颈癌细胞的侵袭以及相关基因 肿瘤细胞的迁移是肿瘤转移的直接原因，而细胞迁移的前提取决于细胞的侵袭能力。因此我们应用 Transwell 小室侵袭实验评估ITGA5 对宫颈癌细胞的侵袭能力影响。结果显示干扰内源性 ITGA5 的表达大大降低了宫颈癌细胞的 侵 袭 能 力（图 3A，P0.01，t=8.248）。Western blot 进 一 步 检 测 上 皮 细 胞 间 质 化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）标记物，发现下调内源性 ITGA5 能显著抑制间质性标记物波形蛋白（Vimentin），并上调上皮细胞标记物 E-钙黏蛋白（E-cadherin）的表达（图 3B）。讨 论ITGA5 是整合素 链家族的成员，与整合素 形成异二聚体跨膜受体参与细胞与细胞外基质的附 着 和 细 胞 与 细 胞 外 基 质 的 双 向 信 号 传 导9。ITGA5 在 多 种 肿 瘤 中 呈 高 表 达，Zhou 等17使 用GEO 数据库以及 TCGA 数据库分析了 ITGA5在喉鳞状细胞癌中的表达，发现 ITGA5在喉鳞状细胞癌组织中的表达上调，高表达 ITGA5的喉鳞状细胞癌患 者 总 生 存 率 以 及 无 复 发 生 存 率 显 著 降 低。Pantano等18通过分析大数据标本，发现早期乳腺癌患者原发性肿瘤中 ITGA5 的高表达与乳腺癌骨转移正相关，可作为乳腺癌溶骨性病变的治疗靶点。Zhu 等19通 过 分 析 Oncomine 与 Tumor Immune Estimation Resource（TIMER）数据库，发现 ITGA5是胃肠道肿瘤免疫细胞浸润的重要调节因子，是有价值的预后生物标志物。越来越多的研究表明ITGA5 的上调与肿瘤侵袭和进展密切相关。Fan等20报道了 ITGA5在口腔鳞状细胞癌上调，干扰口腔鳞状细胞癌细胞系的内源性 ITGA5表达，可以通过调节 PI3K/AKT 信号通路抑制肿瘤细胞的生长A：Differential expressions of ITGA5 between cervical cancer tissues and normal tissues were analyzed by TNMplot.B：Overall survival and 5 years overall survival were analyzed by Kaplan-Meier Plotter.C：IHC analysis of the tissue microarray by staining the ITGA5 antibody（100）.The typical image of ITGA5 in the cervical cancer tissue was shown.D：The ITGA5 related overall survival in cervical cancer was analyzed by Human protein atlas.图 1ITGA5在宫颈癌组织中的表达以及患者的生存分析Fig 1ITGA5 expression in cervical cancer tissues and the survival analysis of the patients333复旦学报（医学版）2023年 5月，50（3）与侵袭。另有研究表明，ITGA5通过诱导肿瘤细胞发生 EMT 来促进口腔鳞状细胞癌的侵袭11。靶向下调 ITGA5可通过降低-catenin入核，调节下游原癌 基 因 的 转 录，从 而 实 现 体 内 抑 制 乳 腺 癌 的 生长21。Yu 等13发现 O-（连接）-N-乙酰葡糖胺（O-GlcNAc）糖基化修饰（O-GlcNAcylation）的 ITGA5A：The mRNA and protein of ITGA5 incervical cancer cells determined by qRT-PCR and Western blot，respectively.（1）vs.NC104，P0.05.B：HeLa/C-33A cells were transfected with Control，siITGA5#1，or siITGA5#2 for 48 h.Cells were collected for Western blot analysis.C：Cell proliferation was analyzed by CCK-8 assay.（1）vs.Control，P0.05.D：Cell apoptosis was detected by flow cytometry.Data presents as meanSD with 3 replicates.（1）vs.Control，P0.01.图 2干扰 ITGA5的表达抑制宫颈癌细胞增殖并促进凋亡Fig 2Interference with the expression of ITGA5 inhibits cervical cancer cell proliferation and promotes apoptosis334董晶，等.RNA干扰 ITGA5的表达对宫颈癌细胞生长和侵袭的影响在促进肿瘤的生长以及转移等恶性生物学功能中具有很好的临床学意义。最近的研究表明 ITGA5的上调还与肿瘤的耐药性有关，Kuninty等16发现仅仅干扰胰腺星状细胞中内源性的 ITGA5表达，就能有效抑制胰腺细胞结缔组织增生，增强胰腺化疗效果。同 样，ITGA5 的 高 表 达 是 胶 质 瘤 患 者 抵 抗Temozolomide 与 Bevacizumab 治 疗 效 果 的 关 键因素22。然而，ITGA5 在宫颈癌的研究报道较为罕见。为了探索 ITGA5在宫颈癌中可能的生物学功能，我们首先使用数据库查询发现 ITGA5 在宫颈癌组织中亦显著上调，且 ITGA5高表达的宫颈癌患者总生存率显著下降。蛋白水平数据亦支持 ITGA5 作为一个原癌基因参与宫颈癌的进程。这个分析与ITGA5在其他肿瘤中的报道一致。在后续细胞实验中，我们发现靶向 ITGA5 的siRNAs 敲低内源性 ITGA5 的表达后，宫颈癌细胞系 的 增 殖 能 力 显 著 降 低，凋 亡 水 平 增 加，表 明ITGA5 对宫颈癌细胞的生长有促进作用。ITGA5作为整合素家族的重要成员，可为细胞的机械黏附提供桥梁，并增加肿瘤细胞转移和侵袭的能力19。因此，我们进一步检测了 ITGA5对宫颈癌细胞侵袭能力的影响，结果显示干扰 ITGA5 后，宫颈癌细胞的侵袭能力明显降低。上皮细胞通过特定程序转化为具有间质表型的细胞即 EMT，这个生物学过程赋予了细胞入侵和转移的能力。通过 EMT，上皮细胞失去了细胞极性，缺失了与基底连接等上皮表型，从而获得了较高的侵袭、抗凋亡和降解细胞外基质的能力等间质表型。因此，EMT 是上皮细胞来源的恶性肿瘤细 胞 获 得 侵 袭 和 迁 移 能 力 的 重 要 生 物 学 过 程。Vimentin 和 E-cadherin 是 EMT 过程中两个主要的分子标记物。Vimentin 是存在于间充质细胞中的一种中间丝蛋白，能使上皮细胞失去极性、破坏细胞间紧密连接结构，改变细胞骨架，减弱黏附力、促进肿瘤细胞侵袭和远处转移。相反，E-cadherin 可维持细胞间紧密连接，阻止细胞活动侵袭及转移扩散。本研究敲低 ITGA5表达后，宫颈癌细胞侵袭能力显著下降，同时 Vimentin 表达下降、E-cadherin 表达上调，提示 ITGA5对宫颈癌细胞侵袭能力的影响A：Cell invasion assessed by Transwell assay.The number of migrated or invaded cells were presented as the meanSD of three independent experiments.B：Western blot reveals the change of main proliferation markers and apoptosis markers after ITGA5 knockdown.图 3干扰 ITGA5的表达抑制宫颈癌细胞的侵袭以及影响相关基因Fig 3Interference with ITGA5 expression suppressed the invasion of cervical cancer cells and affected related genes335复旦学报（医学版）2023年 5月，50（3）可能是通过调控 EMT实现的。综上所述，我们使用数据库分析了 ITGA5作为宫颈癌原癌基因的可能性，并通过细胞实验证实了ITGA5 对宫颈癌细胞的生长和侵袭能力发挥重要的作用。但是阐明其分子机制还需要更深入的研究，其作为治疗靶点的可能性有待于进一步探索。作者贡献声明董晶数据采集，论文构思、撰写和修订。商双辅助数据采集和论文修订。谢锋数据统计和分析，模型运算，论文修订。利益冲突声明所有作者均声明不存在利益冲突。参 考 文 献1 SIEGEL RL，MILLER KD，FUCHS HE，et al.Cancer statistics，2022 J.CA Cancer J Clin，2022，72（1）：7-33.2 XIA C，XU X，ZHAO X，et al.Effectiveness and cost-effectiveness of eliminating cervical cancer through a tailored optimal pathway：a modeling study J.BMC Med，2021，19（1）：62.3 张仲华，刘晨瑛，任会叶，等.20032018 年间中国女性宫颈癌发病与死亡趋势研究 J.中华疾病控制杂志，2022，26（1）：14-20.4 魏长慧，朱继存，牛媛娜，等.20042016 年中国女性生殖系统恶性肿瘤死亡趋势分析J.中华疾病控制杂志，2019，23（5）：506-511.5 ALLOUCH S，MALKI A，ALLOUCH A，et al.High-risk HPV oncoproteins and PD-1/PD-L1 interplay in human cervical cancer：recent evidence and future directionsJ.Front Oncol，2020，10（9）：914.6 LI X，WANG R，FAN P，et al.A comprehensive analysis of key immune checkpoint receptors on tumor-infiltrating T cells from multiple types of cancer J.Front Oncol，2019，9（10）：1066.7 MANDAL P，SAHA SS，SEN S，et al.Cervical cancer 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