RNA干扰ITGA5的表达对宫颈癌细胞生长和侵袭的影响.pdf
《RNA干扰ITGA5的表达对宫颈癌细胞生长和侵袭的影响.pdf》由会员分享,可在线阅读,更多相关《RNA干扰ITGA5的表达对宫颈癌细胞生长和侵袭的影响.pdf(7页珍藏版)》请在咨信网上搜索。
1、复旦学报(医学版)Fudan Univ J Med Sci2023 May,50(3)RNA干扰 ITGA5的表达对宫颈癌细胞生长和侵袭的影响董晶 商双 谢锋(复旦大学附属妇产科医院宫颈及阴道早期疾病诊治中心 上海 200011)【摘要】目的研究 ITGA5 经 RNA 干扰后对宫颈癌细胞生长和侵袭的影响。方法应用 TNMplot、Kaplan-Meier Plotter、Human Protein Atlas 数据库分析 ITGA5 在宫颈癌中的表达和对患者生存率的影响,采用两条靶向ITGA5 的特异 siRNA 序列,进行 RNA 干扰实验。实验分为 siITGA5#1 干扰组、siITG
2、A5#2 干扰组和阴性对照组(非特异性 siRNA)。实时定量 PCR和 Western blot法分别检测宫颈癌细胞中 ITGA5的 mRNA与蛋白水平,筛选内源性ITGA5 呈高表达的HeLa及C-33A细胞做后续实验。Western blot法评估siRNA干扰后宫颈癌HeLa/C-33A细胞中 ITGA5水平,并先后检测 c-Myc、BCL-2、Bax及 Vimentin、E-cadherin的表达变化,CCK-8法检测 HeLa/C-33A细胞增殖,流式细胞术检测细胞凋亡,Transwell小室侵袭实验评估细胞侵袭能力。结果与阴性对照组相比,特异性 siRNA 显著下调宫颈癌 HeL
3、a/C-33A 细胞中 ITGA5蛋白的表达;宫颈癌细胞增殖明显受抑,细胞凋亡显著增加(P0.05);c-Myc和 BCL-2 表达下降、Bax 表达升高。干扰 ITGA5 后,HeLa/C-33A 细胞侵袭能力显著降低,间质性标记物 Vimentin 的表达明显受抑,上皮细胞标记物 E-cadherin 表达水平明显增加。结论ITGA5 经 RNA 干扰后,能明显抑制宫颈癌细胞生长和侵袭,ITGA5对宫颈癌细胞侵袭能力的影响可能是通过调控上皮细胞间质化来实现的。【关键词】宫颈癌;ITGA5;细胞增殖;凋亡;侵袭【中图分类号】R737.33 【文献标志码】A doi:10.3969/j.iss
4、n.1672-8467.2023.03.003Effect of RNA interference with ITGA5 expression on cervical cancer cell growth and invasionDONG Jing,SHANG Shuang,XIE Feng(The Center for Diagnosis and Treatment of Early Cervical and Vaginal Diseases,Obstetrics and Gynecology Hospital,Fudan University,Shanghai 200011,China)【
5、Abstract】ObjectiveTo investigate the effect of ITGA5 on cervical cancer cell growth and invasion after RNA interference.MethodsThe expression of ITGA5 in cervical cancer and the effect on patient survival rates were analyzed by database TNMplot,Kaplan-Meier Plotter and Human Protein Atlas.RNA interf
6、erence experiments were performed by using two specific siRNA sequences targeting ITGA5.The experiment was divided into three groups:siITGA5#1 interference group,siITGA5#2 interference group,and negative control group(non-specific siRNA).The mRNA and protein levels of ITGA5 in cervical cancer cells
7、were measured by real-time quantitative PCR and Western blot,respectively,and HeLa and C-33A cells with high expression of endogenous ITGA5 were screened for subsequent experiments.ITGA5 levels in HeLa/C-33A cells after siRNA interference and the expression changes of c-Myc,BCL-2,Bax and Vimentin an
8、d E-cadherin were detected by Western blot.HeLa/C-33A cell 国家自然科学基金(82072872)Corresponding author E-mail: 网络首发时间:2022-08-09 16 42 00 网络首发地址:https:/ ITGA5的表达对宫颈癌细胞生长和侵袭的影响proliferation was determined by CCK-8,apoptosis was measured by flow cytometry,cell invasion ability was assessed by the Transwell
9、 compartment invasion assay.Results Specific siRNA significantly downregulated ITGA5 protein expression in cervical cancer HeLa/C-33A cells when compared with negative controls;cervical cancer cell proliferation was significantly inhibited,while apoptosis increased(P0.05),the expression of c-Myc and
10、 BCL-2 was decreased,while Bax was elevated.After interference with ITGA5,HeLa/C-33A cells showed a significantly reduced invasion capacity.Expression of the interstitial marker Vimentin was significantly suppressed,while E-cadherin(an epithelial cell marker)was significantly increased.Conclusion IT
11、GA5 can significantly inhibit cervical cancer cell growth and invasion after RNA interference,and the effect of ITGA5 on the invasive ability of cervical cancer cells may be achieved by regulating interstilization of epithelial cells.【Key words】cervical cancer;ITGA5;cell proliferation;apoptosis;inva
12、sion*This work was supported by the National Natural Science Foundation of China(82072872).宫颈癌目前是全球女性第四大恶性肿瘤,在我国女性生殖系统肿瘤中高居第二1-2,且国内其发病率和死亡率都呈逐年增长趋势3-4,严重增加社会经济负担。宫颈癌的治疗往往存在术后转移,对化疗耐药,对放疗不敏感等问题,免疫治疗和靶向治疗成为近年的研究热点5-8。整合素家族是一类由 和 两个亚基通过非共价形成的异二聚体跨膜蛋白,在不同细胞或细胞中充当细胞表面黏附受体介导细胞之间或者细胞与细胞外基质(extracellular m
13、atrix,ECM)之间的双向信号转导9-10。ITGA5是整合素 链家族的成员,位于人染色体 12q13.13上,主要通过与整合素 1形成51 异二聚体跨膜蛋白发挥功能11-12。研究表明ITGA5在多种肿瘤中显著上调,通过调节肿瘤细胞的生长、迁移、侵袭和上皮间质转化参与肿瘤进展13-14。进一步研究表明,ITGA5 还与肿瘤细胞的干细胞特性相关,并能维持化疗抵抗15-16。这些研究结果提示 ITGA5 可作为肿瘤转移和化疗抵抗的潜在治疗靶点。然而,ITGA5在宫颈癌中的表达和生物学功能仍然未知。本研究通过数据库分析ITGA5 在 宫 颈 癌 中 的 表 达,并 从 细 胞 水 平 探 讨I
14、TGA5对宫颈癌细胞生长和侵袭的影响。材 料 和 方 法主 要 实 验 试 剂 永 生 化 的 宫 颈 上 皮 细 胞NC104 以及人宫颈癌细胞系 CaSki、ME-180、SiHa、HeLa 和 C-33A 购自上海生科院细胞所并保存于液氮中;胎牛血清(FBS)与 DMEM 高糖培养基购自美国 HyClone公司;青霉素-链霉素购自北京天根生物科技有限公司;Cell Counting Kit-8试剂盒购自日本Dojindo Molecular Technologies 公司;Transwell 基质胶以及 AnnexinV-FITC/PI 凋亡检测试剂盒购自美国 BD Bioscience
15、s 公司;兔抗鼠 c-Myc 多克隆抗体(1 1 000)、E-cadherin 多 克 隆 抗 体(1 1 000)、Vimentin 多克隆抗体(1:1000)、BCL-2 多克隆抗体(1 1 000)购自美国 Cell Signaling Technology公司;Bax 多克隆抗体(ab32503,1 1 000)、兔抗鼠 ITGA5多 克 隆 抗 体(1 1 000)购 自 美 国 Thermo Fisher Scientific 公司;GAPDH 内参抗体以及二抗购自北京康为世纪生物科技有限公司。数 据 分 析 分 别 使 用 TNMplot 数 据 库(https:/ 的表达;H
16、uman Protein Atlas 数据库(HPA,https:/www.proteinatlas.org/)评估 ITGA5 在宫颈癌组织中的蛋白表达及预后;Kaplan-Meier Plotter数据库(https:/ ITGA5的 mRNA水平与预后的相关性。细胞培养 人宫颈癌细胞系HeLa与C-33A用含有 10%FBS的 DMEM 高糖培养基置于 37、5%CO2细胞培养箱中培养。每隔一天更换新鲜培养基。干扰序列 两条靶向ITGA5的特异性siRNA和非特异性siRNA均购自上海吉玛基因股份有限公司。实验分组 实验分为 3组:siITGA5#1干扰组、siITGA5#2干扰组和阴性
17、对照组(非特异性siRNA)。siRNAs 转染 HeLa/C-33A 细胞 对数期生长的细胞约 1106个接种于直径 10 cm 的细胞培养皿中,待细胞融合度达到 40%60%时瞬时转染阴性331复旦学报(医学版)2023年 5月,50(3)对 照(Control)或 ITGA5 siRNAs,转 染 过 程 参 照lipofectamine RNAiMAX(美 国 Thermo Fisher Scientific 公司)说明书。转染 48 h 后收集蛋白验证干扰效率以及后续实验。RNA 的提取以及实时定量 PCR 根据 Trizol说 明 书 提 取 细 胞 总 RNA,引 物 序 列 如
18、 下:内 参GAPDH 引 物 序 列,上 游 5-ACAACTTTGGT ATCGTGGAAGG-3,下 游 5-GCCATCACGCC ACAGTTTC-3,片段长度 101 bp;ITGA5 引物序列,上游 5-GGCTTCAACTTAGACGCGGAG-3,下 游 5-TGGCTGGTATTAGCCTTGGGT-3,片段长度 140 bp。反应程序:95 预变性 10 min,95 变性 30 s,60退火以及延伸 1 min,40 个循环。以GAPDH作为参照分析目的基因的表达差异。细胞活力测定 收集对数期生长的细胞,将大约 800 个细胞接种到 96 孔板每孔,分别于 24、48、
19、72 h 时将 10 L 的 CCK 8 试剂添加到每个孔中,在 37 下孵育 2 h。用酶标仪(Bia-Rad)在 450 nm 处检测各孔的吸光度值,描述细胞生长曲线。流式细胞仪检测细胞凋亡 转染 48 h 后的细胞使用不含 EDTA 的胰酶消化细胞并收集,并根据AnnexinV-FITC/PI 凋 亡 检 测 试 剂 盒(美 国 BD Biosciences公司)说明书染色,标记早期和晚期凋亡细胞并通过流式细胞仪检测样品的凋亡水平。Transwell 检测 将融化的 Matrigel 基质胶(美国 BD Biosciences公司)用预冷无血清培养基按 1 5稀释,加入 Transwel
20、l小室,放入细胞培养箱中孵育2 h。收集细胞,约 2104个(100 L 无血清培养基)细 胞 接 种 到 上 层 Transwell 上 层,并 将 600 L 含20%FBS 的培养基添加到下室中。细胞培养箱中继续培养 2436 h,然后将细胞在 4%多聚甲醛中固定 20 min,用 0.1%结晶紫染色 15 min。使用棉棒去除未穿透的上部细胞后,对侵袭的细胞进行拍照和计数。Western blot 检 测 将 含 有 蛋 白 酶 抑 制 剂PMSF的 RIPA 细胞裂解液(美国 CST 公司)溶解细胞提取蛋白,冰上裂解 30 min 后,4 11 000g 离心后取上清测定蛋白浓度。加
21、入上样缓冲液(北京索莱宝科技有限公司)100 加热 10 min,在 10%的SDS-PAGE 凝胶中分离、转膜、5%脱脂奶粉封闭30 min,根据目的蛋白的相对分子质量裁剪条带并与相应的抗体在 4 孵育过夜,洗膜后使用山羊抗兔 IgG-HRP二抗 60 min,随后显色、曝光。GAPDH作为管家基因标准化蛋白质表达。统计学分析 采用 GraphPad Prism 5.0 软件进行统计学分析并制图,数据以 xs表示。组间数据差异使用 t检验,P0.05为差异有统计学意义。结 果ITGA5 在宫颈癌患者中的表达水平以及生存分析 为了阐明 ITGA5在宫颈癌中的作用,我们先应用依赖于肿瘤基因组图谱
22、(TCGA)的 GEPIA2和UALCAN 数据库分析平台,发现缺少足够的对照病例,分析结果不可靠。因此我们换用 TNMplot数据库分析了 ITGA5 mRNA 在正常组织以及肿瘤中的表达,发现 ITGA5 的 mRNA 水平在宫颈癌组织中 显 著 升 高(图 1A)。Kaplan-Meier 分 析 表 明,ITGA5呈高表达的宫颈癌患者 5年以及 5年以上总体生存率较低(图 1B)。Human Protein Atlas 数据库显示:宫颈癌组织中的 ITGA5蛋白表达水平与宫颈癌患者总体生存率呈负相关(图 1CD)。上述分析表明 ITGA5 在宫颈癌中呈高表达并可能作为原癌基因促进宫颈癌
23、进展。敲低 ITGA5 的表达抑制宫颈癌细胞增殖和诱导细胞凋亡 鉴于 ITGA5 在宫颈癌组织中呈高表达,我们进一步在细胞水平做功能研究。首先检测了 ITGA5的 mRNA 及蛋白水平在正常宫颈上皮细胞 NC104 和 宫 颈 癌 细 胞 CaSki、ME-180、SiHa、HeLa、C33A 中的表达。与 NC104 细胞比较,内源性 ITGA5的 mRNA 及蛋白水平在多类宫颈癌细胞中呈高表达,尤其在 HeLa 及 C-33A 细胞中高表达最为显著(图 2A),故选择这两种细胞用于敲低ITGA5 做后续实验。采用 ITGA5 特异性 siRNAs转 染 HeLa/C-33A 细 胞,Wes
24、tern blot 检 测 显 示siRNAs 可有效下调 HeLa/C-33A 细胞内 ITGA5 的表达;干扰 ITGA5 后,细胞裂解液中增殖基因蛋白c-Myc、抗凋亡因子 BCL-2 显著下调,促凋亡因子Bax明显增加(图 2B)。CCK-8实验结果显示,与对照组相比,ITGA5 干扰组的细胞生长明显受抑(图2C,P0.01,t=7.932)。流式细胞术分析结果显示,干扰 ITGA5 后,HeLa/C-33A 细胞凋亡水平显著升高(图 2D,P0.01,t=8.908)。上 述 结 果 表 明ITGA5是影响宫颈癌细胞生长的重要基因,ITGA5332董晶,等.RNA干扰 ITGA5的表
- 配套讲稿:
如PPT文件的首页显示word图标,表示该PPT已包含配套word讲稿。双击word图标可打开word文档。
- 特殊限制:
部分文档作品中含有的国旗、国徽等图片,仅作为作品整体效果示例展示,禁止商用。设计者仅对作品中独创性部分享有著作权。
- 关 键 词:
- RNA 干扰 ITGA5 表达 宫颈癌 细胞 生长 侵袭 影响
1、咨信平台为文档C2C交易模式,即用户上传的文档直接被用户下载,收益归上传人(含作者)所有;本站仅是提供信息存储空间和展示预览,仅对用户上传内容的表现方式做保护处理,对上载内容不做任何修改或编辑。所展示的作品文档包括内容和图片全部来源于网络用户和作者上传投稿,我们不确定上传用户享有完全著作权,根据《信息网络传播权保护条例》,如果侵犯了您的版权、权益或隐私,请联系我们,核实后会尽快下架及时删除,并可随时和客服了解处理情况,尊重保护知识产权我们共同努力。
2、文档的总页数、文档格式和文档大小以系统显示为准(内容中显示的页数不一定正确),网站客服只以系统显示的页数、文件格式、文档大小作为仲裁依据,平台无法对文档的真实性、完整性、权威性、准确性、专业性及其观点立场做任何保证或承诺,下载前须认真查看,确认无误后再购买,务必慎重购买;若有违法违纪将进行移交司法处理,若涉侵权平台将进行基本处罚并下架。
3、本站所有内容均由用户上传,付费前请自行鉴别,如您付费,意味着您已接受本站规则且自行承担风险,本站不进行额外附加服务,虚拟产品一经售出概不退款(未进行购买下载可退充值款),文档一经付费(服务费)、不意味着购买了该文档的版权,仅供个人/单位学习、研究之用,不得用于商业用途,未经授权,严禁复制、发行、汇编、翻译或者网络传播等,侵权必究。
4、如你看到网页展示的文档有www.zixin.com.cn水印,是因预览和防盗链等技术需要对页面进行转换压缩成图而已,我们并不对上传的文档进行任何编辑或修改,文档下载后都不会有水印标识(原文档上传前个别存留的除外),下载后原文更清晰;试题试卷类文档,如果标题没有明确说明有答案则都视为没有答案,请知晓;PPT和DOC文档可被视为“模板”,允许上传人保留章节、目录结构的情况下删减部份的内容;PDF文档不管是原文档转换或图片扫描而得,本站不作要求视为允许,下载前自行私信或留言给上传者【自信****多点】。
5、本文档所展示的图片、画像、字体、音乐的版权可能需版权方额外授权,请谨慎使用;网站提供的党政主题相关内容(国旗、国徽、党徽--等)目的在于配合国家政策宣传,仅限个人学习分享使用,禁止用于任何广告和商用目的。
6、文档遇到问题,请及时私信或留言给本站上传会员【自信****多点】,需本站解决可联系【 微信客服】、【 QQ客服】,若有其他问题请点击或扫码反馈【 服务填表】;文档侵犯商业秘密、侵犯著作权、侵犯人身权等,请点击“【 版权申诉】”(推荐),意见反馈和侵权处理邮箱:1219186828@qq.com;也可以拔打客服电话:4008-655-100;投诉/维权电话:4009-655-100。