Vero细胞生长过程中葡萄糖消耗量与细胞数量关系的研究.pdf

Vol.9 No.4Aug.2023生物化工Biological Chemical Engineering第 9 卷 第 4 期2023 年 8 月文章编号：2096-0387（2023）04-04Vero 细胞生长过程中葡萄糖消耗量与细胞数量 关系的研究简伟，刘永连，张瑞，郭林，肖海峰，李国顺*（北京民海生物科技有限公司/北京市新型联合疫苗工程技术研究中心，北京 102600）摘 要：目的：建立一种应用于片状载体培养的 Vero 细胞计数方法。方法：Vero 细胞于细胞瓶内培养，分别于 24 h、48 h、72 h、96 h和120 h 取样检测上清液中葡萄糖含量，同时消化细胞并计数。以葡萄糖累计消耗量为X轴，以细胞收获数量为Y轴，获得葡萄糖累计消耗量和细胞数量的关系方程，从而建立一种细胞计数的方法。通过计算反应器中细胞生长消耗的葡萄糖量来计算细胞数量，从而优化控制细胞生长。结果：得到葡萄糖消耗量与细胞数量线性方程为 Y=4.107108X；Vero 细胞在反应器内培养 6 d，累计消耗葡萄糖 71.28 g，所获得细胞数量为 2.931010个。结论：建立了葡萄糖消耗量与细胞数量的线性关系，即每消耗 1 g 葡萄糖对应的细胞数量为 4.107108个，可作为片状载体细胞培养过程中细胞计数的参考。关键词：Vero 细胞；片状载体；细胞计数方法；葡萄糖中图分类号：Q939.9;Q343.6 文献标识码：AStudyontheRelationshipBetweenGlucoseConsumptionandCellNumberDuringtheGrowthofVeroCellsJIAN wei,LIU Yonglian,ZHANG Rui，GUO Lin,XIAO Haifeng,LI Guoshun*(Beijing Minhai Biotechnology Co.,Ltd./Beijing Engineering Technology Research Center for New Combined Vaccine,Beijing 102600,China)Abstract:Objective:To establish a Vero cell counting method applied to the culture of flake carriers.Methods:Vero cells are cultured in cell flasks,and samples are taken at 24 h,48 h,72 h,96 h,and 120 h to detect the glucose content in the supernatant,and the cells are digested and counted.Taking the cumulative glucose consumption as the X axis and the number of cells harvested as the Y axis,the relationship equation between the cumulative glucose consumption and the number of cells is obtained,so as to establish a method for cell counting.Optimizing cell growth is controlled by calculating the cell number by calculating the amount of glucose consumed for cell growth in the reactor.Results:The linear equation of glucose consumption and cell number is Y=4.107108X;Vero cells are cultured in the reactor for 6 days,the cumulative glucose consumption is 71.28 g,and the number of cells obtained was 2.931010.Conclusion:A linear relationship between glucose consumption and cell number is established.That is,the number of cells corresponding to each consumption of 1 g of glucose is 4.107108,which can be used as a reference for cell count in the flake carrier cell culture process.Keywords:Vero cells;flake carrier;cell counting method;glucose贴壁细胞培养的放大方式包括从方瓶或平皿放大至转瓶、多层方瓶或细胞工厂，这些培养方式均为低密度细胞培养，放大能力只能依靠增加培养单元的数量来提高1-2。因此，无论是贴壁培养工艺还是悬基金项目：北京市科技计划课题（Z201100005420004）。作者简介：简伟（1985），男，湖北安陆人，本科，副研究员，研究方向为微生物发酵、细胞病毒培养、疫苗开发。通信作者：李国顺（1980），男，河北邯郸人，硕士，研究员，研究方向为蛋白纯化、细胞病毒培养、疫苗开发。E-mail：。110生物化工2023 年浮培养工艺，生物反应器工艺是大规模培养细胞和病毒最适合的选择3。固定床生物反应器片状载体工艺在病毒性疫苗领域已得到广泛应用，具有剪切力低、换液快、可大规模连续灌流培养等优势4。但由于不能实时取样难以对细胞进行消化计数，从而难以准确检测细胞密度、判断细胞生长速度，对于需严格按病毒感染复数（MOI）接毒的病毒培养工艺也造成一定的困扰5。本实验建立了一种简单快捷应用于固定床生物反应器（片状载体）的细胞计数方法，为片状载体细胞培养工艺的细胞计数提供参考。1 材料与方法1.1 细胞Vero 细胞 142 代，由北京民海生物科技有限公司研发中心保存。1.2 试剂及耗材Gibco OptiPRO SFM 培养基、基因重组胰酶，美国Thermo Fisher Scientific 公司；Cedex Bio 配套葡萄糖检测试剂盒，瑞士 Hoffmann-La Roche 公司；片状载体，上海楚鲲生物科技有限公司。75 cm2细胞培养瓶（T75）、225 cm2细胞培养瓶（T225）、2层细胞工厂（CF2）、10层细胞工厂（CF10），丹麦 Corning 公司。1.3 设备MCO-20AIC 型二氧化碳培养箱，日本 Panasonic公司；CKX53 型倒置显微镜，日本 OLYMPUS 公司；IC1000 型细胞计数仪，上海睿钰生物科技有限公司；Cedex Bio 型生化分析仪，瑞士 Hoffmann-La Roche 公司；Cellipower 09-5L 型生物反应器，上海戈洛思生物科技有限公司。1.4 方法1.4.1 细胞复苏和传代（1）复苏。取 1 支 Vero 细胞（代次 142），在（391）水浴快速化冻后接入 T75 细胞培养瓶中，缓慢补加细胞培养液至 30 mL，置于 37.0、5%CO2的培养箱内培养 3 d。（2）传代。将 1 个 T75 按照 1 6 的传代比例，传 2 个 T225，置于 37.0、5%CO2的培养箱内培养3 d，此时的细胞代次为 144。取 1 个 144 代的 T225按照16的传代比例，传6个T225，置于37.0、5%CO2的培养箱内培养 3 d，此时的细胞代次为 145。取1 个 145 代的 T225 按照 1 6 的传代比例，传 1 个CF2，置于 37.0、5%CO2的培养箱内培养 3 d，此时的细胞代次为 146。（3）传代比例控制。取 146 代细胞消化后的细胞悬液，按照 1 4（7.5104个/cm2）、1 6（5 104个/cm2）、1 8（3.75104个/cm2）的接种密度接种至T75细胞培养瓶，每个密度接种16瓶，置于5%CO2培养箱内（371）进行培养。1.4.2 葡萄糖含量检测及细胞计数分别于 24 h、48 h、72 h、96 h 和 120 h 取 3 瓶不同传代比例细胞的上清液检测葡萄糖含量，并消化细胞，取 20 L 细胞悬液用细胞计数仪计数，记录培养上清液葡萄糖含量和细胞密度。1.4.3 统计方法以培养时间为 X 轴，细胞数量为 Y 轴，绘制不同传代比例的细胞生长曲线。使用 Excel 2010 软件，以葡萄糖累计消耗量为 X 轴，以细胞数量为 Y 轴作散点图，添加线性趋势线，得到葡萄糖消耗与细胞数量关系方程。1.4.4 葡萄糖消耗和细胞数量关系在生物反应器上的应用从反应器中每天取培养上清液，用生化分析仪检测其葡萄糖含量，再结合灌流量、上一次测得的培养上清液的葡萄糖含量，按照公式（1）计算出葡萄糖消耗量，将累计消耗的葡萄糖量代入葡萄糖消耗量与细胞数量关系方程，即可得到反应器内细胞总量。以培养时间为X轴，反应器内细胞总数为Y轴作生长曲线，分析 Vero 细胞的生长规律。M=M1V1+M2V2-M3V1-(M1+M3)/2V2（1）其中，M 为葡萄糖消耗量，M1为上次取样测得的葡萄糖浓度，M2为灌流培养液葡萄糖浓度，M3为本次取样测得的葡萄糖浓度，V1为生物反应器培养体积，V2为灌流体积。2 结果与分析2.1 葡萄糖消耗与细胞数量关系的确定不同传代比例的细胞生长曲线见图 1。从生长曲第 4 期111简伟等：Vero细胞生长过程中葡萄糖消耗量与细胞数量关系的研究线上看，3 种传代比例细胞均呈现 S 型的生长趋势，延迟期、对数生长期和平台期初期时间基本一致，所选传代比例对细胞生长影响不大。0510152025303540024487296120细胞收获量/106个生长时间/h14传代16传代18传代图 1 Vero 细胞生长曲线设置截距为 0，1 4、1 6 和 1 8 传代比例的葡萄糖消耗量与细胞数量的线性方程分别如图 2 所示，R2分别为 0.966 1、0.983 3、0.969 1。葡萄糖消耗量与细胞数量基本呈线性关系，且呈现传代比例越小斜率越大的规律；取 3 个斜率的平均值4.107108作为葡萄糖消耗量与细胞数量线性方程的系数，即每消耗 1 g 葡萄糖对应的细胞收获量为4.107108个，与文献6报道的每消耗 1 g 葡萄糖对应 5.345108个细胞非常接近。2.2 葡萄糖消耗量与细胞数量关系在反应器上的应用Vero 细胞进行反应器培养，从图 3 所示的生长曲线可以发现，0 2 d 细胞生长缓慢，为停滞期；2 6 d 细胞进入对数生长期，葡萄糖消耗量不断增加；5 6 d 达到最高峰，而后处于平台期。y=454.57xR2=0.966 1051015202530350.000.050.100.050.100.050.10细胞收获量/106个葡萄糖消耗量/gy=412.48xR2=0.983 3051015202530350.00细胞收获量/106个葡萄糖消耗量/gy=365.33xR2=0.969 1051015202530350.00细胞收获量/106个葡萄糖消耗量/g （a）1 4 （b）1 6 （c）1 8图 2 葡萄糖消耗量与细胞数量关系0.00.51.01.52.02.53.03.501234567细胞总数/1010个培养时间/d图 3 生物反应器内 Vero 细胞生长曲线3 结论与讨论片状载体和微载体细胞培养是最主流的贴壁细胞培养工艺，而片状载体相对于微载体培养，具有可以得到更高的细胞收获量、灌流速度和换液操作可在很短的时间内完成、不会对细胞造成影响等优点，被广泛应用于病毒疫苗生产领域7。如杨屹等8应用片状载体生产的 Vero 细胞密度高达 1.0107个/mL，收获的病毒液毒力达 7.5106 3.4108 FFU/mL；刘岩松等9使用篮式生物反应器制备森林脑炎灭活疫苗（Vero 细胞），获得细胞密度 1.04107个/mL，病毒收获液平均滴度 8.4 lg LD50/mL。但片状载体工艺存在无法将载体取出进行计数的缺点7，对于片状载体细胞计数方法的文献报道较少。周蕾等6使用培养瓶培养的细胞，先建立 Vero细胞浓度与电容的线性关系，然后检测生物反应器内电容，通过电容值和线性方程算出细胞密度。基于此，本文建立了葡萄糖消耗量与 Vero 细胞数量的计算方法，即每消耗1 g葡萄糖对应的细胞数量为4.107108个，在 Cellipower 09-5L 反应器内细胞生长 6 d 累计消耗葡萄糖71.28 g，所获得细胞数量为2.931010个，为生物反应器片状载体细胞培养工艺细胞计数提供了一种方法。参考文献1 EGURA M M,MANGION M,GAILLET B,et al.New developments in（下转第118页）118生物化工2023 年所示，各个监测指标中总氮和总磷显著相关，头孢类抗生素与总磷、总氮和高锰酸盐指数之间均无明显相关性。3 结论2022 年太湖流域镇江水系总磷最高浓度为 0.22 mg/L，总氮最高浓度为 2.88 mg/L，高锰酸盐指数最高浓度为 6.3 mg/L；共检出 8 种头孢类抗生素，其中头孢氨苄和头孢噻呋的检出浓度均值均超过0.76 ng/L；头孢类抗生素污染与富营养化水平无显著相关。镇江市濒江临河，是长江和大运河交汇的枢纽，位于水系上游，水质情况直接影响下游的苏锡常三市，流域内抗生素的持续生产和广泛使用，会在空间和时间上对太湖水系的生态环境带来较大的威胁，其生态污染风险不可忽视。目前亟需对重点流域开展抗生素常规监测，加快控制抗生物污染带来的健康危害。参考文献1 李卫,王道科,王凯.头孢菌素类抗生素的药理特性及应用 J.中学生物教学,2021(26):84.2 李梅,孙灵灵,袁宗辉,等.兽用头孢菌素类抗生素研究进展 J.中国畜牧兽医,2018,45(7):1978-1989.3 马晓力,沈耀良.ABR 反应器处理高浓度头孢抗生素废水实验研究 J.江苏环境科技,2008(4):33-35.4 郁晞,沈燕,邵未艾,等.20192021 年淀山湖水源富营养化及磺胺类抗生素污染现况 J.环境卫生学杂志,2022,12(5):378-382.5 刘晔.镇江市主要入太湖流域河流氮磷污染分析及控制对策研究 D.镇江:江苏大学,2014.表 4 头孢类抗生素与其他监测指标相关性分析（n=36）项目总磷总氮高锰酸盐指数头孢类抗生素总磷1-0.381*-0.1290.142总氮-0.381*10.2570.158高锰酸盐指数0.1290.2571-0.078头孢类抗生素0.1420.158-0.0781注：*表示在 0.05 水平上（双尾）相关性显著。lentiviral vector design,production and purificationJ.Expert Opin Biol Ther,2013,13(7):987-1011.2 MERTEN O W.Advances in cell culture:anchorage dependence J.Philos Trans R Soc Lond B BiolSci,2015,370(1661):20140040.3 MCCARRON A,DONNELLEY M,PARSONS D.Scale-up of lentiviral vectors for gene therapy:advances and challengesJ.Cell Gene Ther Insights,2017,3(9):719-729.4 RAJENDRAN R,LINGALA R,VUPPU S K,et al.Assessment of packed bed bioreactor systems in the production of viral vaccinesJ.AMB Express,2014,4(1):25.5 MEUWLY F,PAPP F,RUFFIEUX P A,et al.Use of glucose consumption rate(GCR)as a tool to monitor and control animal cell production processes in packed-bed bioreactors J.J Biotechnol,2006,122(1):122-129.6 周蕾,陈建民,王鑫,等.一种篮式生物反应器内 Vero 细胞计数方法的建立 J.大连工业大学学报,2018,37(3):163-166.7 张家友,刘洋,赵巍,等.微载体与片状载体培养 MDCK-G1 细胞的比较 J.中国生物制品学杂志,2020,33(2):175-178.8 杨屹,郭秀侠,崔文广,等.应用篮式生物反应器制备 Vero 细胞人用狂犬病疫苗 C/2011 中国生物制品年会暨第十一次全国生物制品学术研讨会论文集.成都:中华预防医学会,2011:67-70.9 刘岩松,王华,孙宏亮,等.应用篮式生物反应器制备森林脑炎灭活疫苗(Vero 细胞)J.中国生物制品学杂志,2015,28(12):1324-1326.（上接第 111 页）