DB65∕T 4671-2023 土壤中棉花黄萎病菌检测与分离鉴定规程(新疆维吾尔自治区).pdf

ICS 65.020.01CCS B 05B65新疆维吾尔自治区地方标准DB 65/T 46712023土壤中棉花黄萎病菌检测与分离鉴定规程Co de o f practice fo r detectio n and iso latio n identificatio n o f co tto n Verticillium dahliae in so il2023-07-20 发布2023-09-20 实施新疆维吾尔自治区市场监督管理局 发 布DB 65/T 467 12023目 次前言.HI1 范围.12规范性引用文件.13术语和定义.14原理.15仪器和试剂.15.1仪器设备.25.2试剂与材料.25.3培养基的配制.26 土壤采集与处理.26.1 土壤采集.26.2 土壤处理.27病菌数量检测.28病菌分离鉴定.28.1病菌分离纯化.28.2分子生物学鉴定.39标本及资料保存.39.1样品保存.39.2资料保存.3附录A（资料性）土壤样品处理流程.4附录B（资料性）溶液的配制.5附录C（资料性）选择性培养基上黄萎病菌菌落形态.6附录D（资料性）PDA培养基上棉花黄萎病菌菌落形态.7附录E（资料性）PCR反应体系与反应条件.8附录F（资料性）记录表格.9IDB 65/T 467 12023,、N-1刖 百本文件按照GB/T LI2020标准化工作导则 第1部分：标准化文件的结构和起草规则的规 定起草。本文件由新疆维吾尔自治区农业农村厅提出。本文件由新疆维吾尔自治区农业农村厅归口并组织实施。本文件起草单位：新疆维吾尔自治区植物保护站、新疆农业科学院植物保护研究所。本文件主要起草人：刘海洋、王惠卿、王伟、张仁福、魏新政、姚举、努尔孜亚.。亚力买买提、丁 瑞丰、罗文芳。本文件实施应用中的疑问，请咨询新疆维吾尔自治区植物保护站。本文件的修改意见建议，请反馈至新疆维吾尔自治区农业农村厅（乌鲁木齐市胜利路157号），新 疆维吾尔自治区植物保护站（乌鲁木齐市胜利路157号），新疆维吾尔自治区市场监督管理局（乌鲁木 齐市新华南路167号）。新维吾尔自治区农业农村厅 联系电话：[phone]；传真：[phone]；邮编：830000新疆维吾尔自治区植物保护站 联系电话：[phone]；传真：[phone]；邮编：830000新疆维吾尔自治区市场监督管理局联系电话：[phone]；传真：[phone]；邮编：830004IIIDB 65/T 467 12023土壤中棉花黄萎病菌检测与分离鉴定规程1范围本文件规定了土壤中棉花黄萎病菌检测与分离鉴定的原理、仪器和试剂、土壤采集与处理、病菌数 量检测、病菌分离鉴定、标本及材料保存的要求。本文件适用于棉田土壤中棉花黄萎病菌无性态阶段的检测、分离与鉴定。2规范性引用文件本文件没有规范性引用文件。3术语和定义下列术语和定义适用于本文件。3.1选择性培养基selective medium进行植物病原菌分离培养时，为促进目标菌落的形成，抑制其它杂菌的生长，在培养基中添加不同 的碳源、氮源以及抑制性物质配制成具有选择生长能力的培养基。3.2棉花黄萎病菌 verticillium dahliae棉花黄萎病菌无性态属丝抱纲(Hyphomycetes)、丝狗目(Hyphomycetsles)、轮枝菌科(Verticilliaceae)轮枝菌属(t”;打7了血。主要经由种子、土壤、病残体、雨水和灌溉水等进 行传播。3.3微菌核 microsclerotium棉花黄萎病菌生长过程中，由单一或数条菌丝体膨大、胞壁增厚，向各个方向生长扩展并不断聚集 形成的暗褐色或黑色较为坚硬的不规则休眠体。3.4分生胞子梗 conidiophore在直立的分生胞子梗每节基部膨大处轮生若干个小梗，通常由2层4层轮生小梗及上部的顶枝构 成。4原理土壤是棉花黄萎病菌的主要生存场所之一，土壤环境内含有大量的微生物，首先利用水筛法处理土 壤得到土壤悬浊液，然后将土壤悬浊液涂布于选择性培养基，待目标菌落生长后，挑取典型黄萎病菌单 菌落的菌块，捣碎后利用梯度稀释法分离、纯化目标病原菌，对其进行形态特征和分子生物学鉴定。流 程图见附录A。5仪器和试剂1DB 65/T 467 120235.1 仪器设备取土器、电子天平、摇床、分样筛（100目、500目）、高压灭菌锅、移液器、超净工作台、生化培 养箱、显微镜、高速冷冻离心机、PCR仪、电泳仪和凝胶成像仪。5.2 试剂与材料5.2.1试剂蔗糖、葡萄糖、MgS047 H20 KN03 K2HP0o Biotin、Na-EDTA Tris base、Tris-HcK 琼脂、青霉 素、链霉素、2X3 PCR Green Mix引物、真菌DNA提取试剂盒、dd4O和蒸储水。5.2.2材料载玻片、盖玻片、封口袋、容量瓶（250 mL）、烧杯（50 mL）和培养皿（90 mm）。5.3培养基的配制选择性培养基和PDA培养基的配制方法见附录B。.6 土壤采集与处理6.1 土壤采集选择发生黄萎病的棉田，按十字交叉法进行5点取样，每点利用取土器取棉株根围10 cm20 cm耕 层土壤200 g,阴凉通风处晾干，保存于4 冰箱备用。6.2 土壤处理称取6 g采集土壤样品，放入盛有100 mL水的容量瓶中，在摇床上以120 r/min转速震荡10 min,后 倒入上层100目、下层500目的双层圆筛，将泥土冲洗干净。将留在下层500目筛网上的土壤残留物全部 转移到容量为30 mL容量瓶中，用无菌水定容至30 mLo在超净台上用移液器吸取1 mL摇匀土壤悬浊液，涂布于选择性培养基表面，涂布5皿，重复3次。在超净工作台上晾干，放置20 培养箱中培养。7病菌数量检测培养5 d7 d后，取出选择性培养平板，在自来水下洗除选择性培养基表面杂物，目检并配合显微 镜检查黄萎病菌微菌核形成情况，统计每个培养平板上长出的黄萎病菌菌落数量，5个培养平板上生长 的黄萎病菌菌落之和，即为1 g土壤中所含的黄萎病菌数量。选择性培养平板上黄萎病菌菌落特征见附 录C。8病菌分离鉴定8.1病菌分离纯化挑取培养基上典型黄萎病菌单菌块置入2 mL离心管中，捣碎后加入1 mL无菌水在振荡器上充分振荡 1 min,利用梯度稀释法，依次稀释至浓度为10工108的菌悬液，利用移液器吸取2 mL,涂布于选择性 培养基表面，涂布5皿，在超净工作台上晾干后收至生化培养箱中，在20 下培养5 d7 d。之后在超 2DB 65/T 467 12023净工作台上，将选择性培养基上生长的黄萎病菌单菌落接种于PDA培养基上保存。记录在25 下黄萎病 菌菌落生长速度与产微菌核能力。PDA培养平板上黄萎病菌菌落形态见附录D。8.2分子生物学鉴定将PDA培养平板上棉花黄萎病菌接种于200 mL PDA液体培养基中，静止培养5 d7 d,用灭菌纱布 过滤收集菌丝，用滤纸吸干水分，液氮研磨。利用真菌DNA提取试剂盒提取棉花黄萎病菌的基因组DNA,利用引物ISSR25：5-A CA CA CA CA CA CA CA CCA-3,进行扩增。若PCR扩增出5条条带为落叶型黄萎病菌，PCR 扩增出3条条带为非落叶型黄萎病菌。扩增反应体系、条件及图谱见附录E。9标本及资料保存9.1样品保存检测鉴定完成后，检出的棉花黄萎病菌需作为标本保存的，接种于PDA培养基中置于4 冰箱妥 善保存1年。废弃样品及耗材应进行灭菌处理。9.2资料保存妥善记录土壤样品采集地点、时间、检测时间、结果等，并有实验人员的签字。检测鉴定过程及有 关数据、表格要进行详细记录并归档保存。具体记录表格见附录F。3DB 65/T 467 12023附录 A（资料性）土壤样品处理流程土壤样品处理流程见图A.1。图A.1 土壤样品处理流程图4DB 65/T 467 12023附录 B（资料性）溶液的配制B.1选择性培养基配方及制作方法B.1.1配方蔗糖2 g、Biotin 1 mg、Na-EDTA 0.15 g、2 mol/L MgS0,r7 H20 0.5 mL、2 mol/L KN03 5 mL、1 mol/L K2HP04 2 mL、1 mol/L Tris base 35 mL、1 mol/L Tris-Hcl 15 mL、琼脂 16 g、青霉素或链霉素0.2 goB.1.2制作方法在 1000 mL烧杯中加入蔗糖2 g、Biotin 1 mg、Na-EDTA 0.15 g、2 mol/L MgS04-7 H20 0.5 mL、2 mol/L KN03 5 mL、1 mol/L K2HPO4 2 mL、1 mol/L Tris base 35 mL 1 mol/L Tris-Hcl 15 mL,定容至 1000 mLo充分混和溶解，按250 mL/瓶分装为4瓶，每瓶中加入4 g琼脂，121 高压灭菌25 min。温度降至 约50 时，每瓶在灭菌条件下加青霉素或链霉素50 mg,混和均匀。B.2 PDA培养基配方及制作方法B.2.1配方马铃薯200 g、葡萄糖15 g、琼脂12 g、蒸储水1000 mLoB.2.2制作方法将洗净去皮的马铃薯切成1 cm小块，加水1000 mL煮沸30 min,用纱布滤去马铃薯，加水补足1000 mL；加入葡萄糖15 g,充分混和溶解，按250 mL/瓶分装为4瓶，每瓶中加入3 g琼脂，121 高压灭菌25 min。5DB 65/T 467 12023附录 C（资料性）选择性培养基上黄萎病菌菌落形态选择性培养基上黄萎病菌菌落形态见图C.1,局部黄萎病菌菌落形态放大图见图C.2。图C 1选择性培养基上黄萎病菌形态图C 2局部黄萎病菌菌落形态放大6DB 65/T 467 12023附录 D（资料性）PDA培养基上棉花黄萎病菌菌落形态PDA培养基上棉花黄萎病菌菌落形态见图D.1,棉花黄萎病菌的分生胞子梗和微菌核形态见图D.2。图D.1 PDA培养基上棉花黄萎病菌菌落形态（由左至右依次为菌核型；中间型；菌丝型）图D 2棉花黄萎病菌的分生胞子梗和微菌核形态（左为分生袍子梗；右为微菌核）7DB 65/T 467 12023附录 E(资料性)PCR反应体系与反应条件E.1 PCR反应体系反应体系：总体积25 n L：2X Tap PCR Green Mix 12.5 u L,Template DNA 1.0 u L,Primer(10 nM)0.5 uL,ddH2O 11.0 uLoE.2 PCR反应条件94c预变性4 min；94 变性30 s,55 退火45 s,7 2 延伸1 min,30个循环;7 2 c延伸10 min。PCR产物经1%的琼脂糖凝胶电泳检测，凝胶成像仪拍照。PCR扩增图谱见图E.Io2000bp-lOOObp-MCDDNNNNDNNDNNZOOObp-inoobp-750bp-SOObp-图E 1棉花黄萎病菌PCR扩增结果(A)与常规方法(B、C)比较n注：M：marker；D：落叶型黄萎病菌株；N：非落叶型黄萎病菌株；C：空白对照。8DB 65/T 467 12023附录 F（资料性）记录表格记录表格见表F.Io表F.1记录表格生产/经营者地址联系电话取样日期,取样地点经纬度检测时间实验人员样品编号品种名称病菌数量病菌类型备注：9