DB65∕T 4671-2023 土壤中棉花黄萎病菌检测与分离鉴定规程(新疆维吾尔自治区).pdf
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1、ICS 65.020.01CCS B 05B65新疆维吾尔自治区地方标准DB 65/T 46712023土壤中棉花黄萎病菌检测与分离鉴定规程Co de o f practice fo r detectio n and iso latio n identificatio n o f co tto n Verticillium dahliae in so il2023-07-20 发布2023-09-20 实施新疆维吾尔自治区市场监督管理局 发 布DB 65/T 467 12023目 次前言.HI1 范围.12规范性引用文件.13术语和定义.14原理.15仪器和试剂.15.1仪器设备.25.2试剂
2、与材料.25.3培养基的配制.26 土壤采集与处理.26.1 土壤采集.26.2 土壤处理.27病菌数量检测.28病菌分离鉴定.28.1病菌分离纯化.28.2分子生物学鉴定.39标本及资料保存.39.1样品保存.39.2资料保存.3附录A(资料性)土壤样品处理流程.4附录B(资料性)溶液的配制.5附录C(资料性)选择性培养基上黄萎病菌菌落形态.6附录D(资料性)PDA培养基上棉花黄萎病菌菌落形态.7附录E(资料性)PCR反应体系与反应条件.8附录F(资料性)记录表格.9IDB 65/T 467 12023,、N-1刖 百本文件按照GB/T LI2020标准化工作导则 第1部分:标准化文件的结构
3、和起草规则的规 定起草。本文件由新疆维吾尔自治区农业农村厅提出。本文件由新疆维吾尔自治区农业农村厅归口并组织实施。本文件起草单位:新疆维吾尔自治区植物保护站、新疆农业科学院植物保护研究所。本文件主要起草人:刘海洋、王惠卿、王伟、张仁福、魏新政、姚举、努尔孜亚.。亚力买买提、丁 瑞丰、罗文芳。本文件实施应用中的疑问,请咨询新疆维吾尔自治区植物保护站。本文件的修改意见建议,请反馈至新疆维吾尔自治区农业农村厅(乌鲁木齐市胜利路157号),新 疆维吾尔自治区植物保护站(乌鲁木齐市胜利路157号),新疆维吾尔自治区市场监督管理局(乌鲁木 齐市新华南路167号)。新维吾尔自治区农业农村厅 联系电话:099
4、1-2878226;传真:0991-8551484;邮编:830000新疆维吾尔自治区植物保护站 联系电话:0991-5508625;传真:0991-5856274;邮编:830000新疆维吾尔自治区市场监督管理局联系电话:0991-2817 197;传真:0991-2311250;邮编:830004IIIDB 65/T 467 12023土壤中棉花黄萎病菌检测与分离鉴定规程1范围本文件规定了土壤中棉花黄萎病菌检测与分离鉴定的原理、仪器和试剂、土壤采集与处理、病菌数 量检测、病菌分离鉴定、标本及材料保存的要求。本文件适用于棉田土壤中棉花黄萎病菌无性态阶段的检测、分离与鉴定。2规范性引用文件本文
5、件没有规范性引用文件。3术语和定义下列术语和定义适用于本文件。3.1选择性培养基selective medium进行植物病原菌分离培养时,为促进目标菌落的形成,抑制其它杂菌的生长,在培养基中添加不同 的碳源、氮源以及抑制性物质配制成具有选择生长能力的培养基。3.2棉花黄萎病菌 verticillium dahliae棉花黄萎病菌无性态属丝抱纲(Hyphomycetes)、丝狗目(Hyphomycetsles)、轮枝菌科(Verticilliaceae)轮枝菌属(t”;打7了血。主要经由种子、土壤、病残体、雨水和灌溉水等进 行传播。3.3微菌核 microsclerotium棉花黄萎病菌生长过程
6、中,由单一或数条菌丝体膨大、胞壁增厚,向各个方向生长扩展并不断聚集 形成的暗褐色或黑色较为坚硬的不规则休眠体。3.4分生胞子梗 conidiophore在直立的分生胞子梗每节基部膨大处轮生若干个小梗,通常由2层4层轮生小梗及上部的顶枝构 成。4原理土壤是棉花黄萎病菌的主要生存场所之一,土壤环境内含有大量的微生物,首先利用水筛法处理土 壤得到土壤悬浊液,然后将土壤悬浊液涂布于选择性培养基,待目标菌落生长后,挑取典型黄萎病菌单 菌落的菌块,捣碎后利用梯度稀释法分离、纯化目标病原菌,对其进行形态特征和分子生物学鉴定。流 程图见附录A。5仪器和试剂1DB 65/T 467 120235.1 仪器设备取
7、土器、电子天平、摇床、分样筛(100目、500目)、高压灭菌锅、移液器、超净工作台、生化培 养箱、显微镜、高速冷冻离心机、PCR仪、电泳仪和凝胶成像仪。5.2 试剂与材料5.2.1试剂蔗糖、葡萄糖、MgS047 H20 KN03 K2HP0o Biotin、Na-EDTA Tris base、Tris-HcK 琼脂、青霉 素、链霉素、2X3 PCR Green Mix引物、真菌DNA提取试剂盒、dd4O和蒸储水。5.2.2材料载玻片、盖玻片、封口袋、容量瓶(250 mL)、烧杯(50 mL)和培养皿(90 mm)。5.3培养基的配制选择性培养基和PDA培养基的配制方法见附录B。.6 土壤采集与
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