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测定胰岛素一级结构的方案

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2020年4月19日
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标题：测定胰岛素一级结构的方案

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提交时间： 11月19日星期一
摘要：研究蛋白质结构与功能关系是当前分子生物学的重大课题之一，1953年，英国生物化学家Fred Sanger报道了胰岛素(insulin)的一级结构，同年，Watson与Crick发现DNA的双螺旋结构。1969年，基本与应用化学联合会规定以各种氨基酸按一定顺序排列构成的蛋白质肽链骨架为蛋白质基本结构。测定蛋白质（胰岛素）结构，主要要测定出：多肽链的数目；每条多肽链末端氨基酸的种类；每条肽链上氨基酸的种类，数目及连接顺序；链内于连间二硫键的数目与位置。至此，一种蛋白质的结构已基本明确。

关键字：胰岛素 一级结构 测定方法 化学法与酶解法

1953年，英国生物化学家Fred Sanger报道了胰岛素(insulin)的一级结构，这是世界上第一个被确定一级结构的蛋白质。同年，Watson与Crick发现DNA的双螺旋结构。生物化学由此迈向了一个更高层次——分子生物学时代。
§ 胰岛素的一级结构
由51个氨基酸残基组成
分两条链：A链：21个氨基酸残基
B链：30个氨基酸残基
含三个二硫链：一个A链内的二硫
两个链间二硫键

· 胰岛素的功能：
胰岛素是由胰岛β细胞分泌的一种蛋白质类激素促进肌肉、脂肪组织细胞膜对葡萄糖的通透性
· 诱导、促进肝脏葡萄糖激酶等合成，增强糖的分解代谢
· 促进肝、肌肉中糖原合成
· 抑制糖异生
· 促进糖转变为脂肪
· 抑制脂肪分解
人与各种动物胰岛素一级结构比较
表：一些哺乳动物胰岛素一级结构的差异
名 称
A8
A9
A10
B30
与人的差异数
活性
人
苏氨酸
丝氨酸
异亮氨酸
苏氨酸
-

猪
-
-

丙氨酸
1

抹香鲸
-
-

丙氨酸
1

马
-
甘氨酸

丙氨酸
2
↓
象
-
甘氨酸
缬氨酸

2
↓
牛
丙氨酸
-
缬氨酸
丙氨酸
3
↓
蛋白质分子的一级结构测定，概括起来包含多肽链的分离、降解、肽段的分离和顺序分析以及－S－S－定位等。
1.多肽链的分离
在测定一个蛋白质的结构以前，首先必须保证被测蛋白质的纯度，使结果准确可靠。其次要了解它的分子量和亚基数，按照其亚基数将蛋白质分成几个多肽链。
1)肽链的拆开
胰岛素分子多肽链的连接有共价结合和非共价结合两种。要拆开以共价结合的-S-S-连接的多肽链，采用的方法：
巯基乙醇还原： 利用还原剂巯基乙醇亦可使蛋白质的-S-S-断裂。当高浓度的巯基乙醇在pH8条件下室温保温几小时后，能够使-S-S-定量还原为桽H。与此同时反应系统中还需要有8摩尔脲或6摩尔盐酸胍使蛋白质变性，多肽链松散成为无规则的构型，此时还原剂就可作用于-S-S-。此反应是可逆的，因此要使反应完全，疏基乙醇的浓度必须在0.1-0.5摩尔。
2)末端分析
(1)N-末端测定：
二甲基氨基萘磺酰氯法： 1956年Hartley等报告了一种测定N-末端的灵敏方法，采用1-二甲基氨基萘-5-磺酰氯，简称丹磺酰氯。它与游离氨基末端作用，方法类似于Sanger的DNFB法(二硝基氟苯法(FDNB，DNFB)：1945年Sanger提出此方法，是她的重要贡献之一。DNP-氨基酸用有机溶剂抽提后，经过层析位置可鉴定它是何种氨基酸。Sanger用此方法测定了胰岛素的N末端分别为甘氨酸及苯丙氨酸。)，产物是磺酰胺衍生物。丹磺酰链酸具有强烈的黄色荧光。此法优点为灵敏性较高(比FDNB法提高100倍，样品量小于1毫微克分子)及丹磺酰氨基酸稳定性较高(对酸水解稳定性较DNP氨基酸高)，可用纸电泳或聚酰胺薄膜层析鉴定。
(2)C-末端分析：
肼解法： 这是测定C-末端最常见的方法。将多肽溶于无水肼中，100℃下进行反应，结果羧基末端氨基酸以游离氨基酸状释放，而其余肽链部分与肼生成氨基酸肼。这样羧基末端氨基酸能够采用抽提或离子交换层析的方法将其分出而进行分析。如果羧基末端氨基酸侧链是带有酰胺如天冬酰胺和谷氨酰胺，则肼解时不能产生游离的羧基末端氨基酸。另外肼解时注意避免任何少量的水解，以免释出的氨基酸混淆末端分析。
3)氨基酸组成分析
在进一步分析多肽链的氨基酸顺序之前，首先应了解它是由那几种氨基酸组成的，每种氨基酸有多少?分析组成的方法有：
离子交换层析法: Spaekman等发展了一种精确的氨基酸组分的定量方法。她们采用磺酸型的离子交换树脂，这是一种高分子量的固体聚苯乙烯，带有大量的功能基团，磺酸基在低pH和低离子强度条件下，根据氨基酸的酸碱性，氨基酸带正电，于是替换下树脂上的Na+，借助静电作用而结合到磺酸基上。
由于各种氨基酸在树脂上的亲和力不同，因此当改变溶液pH和离子强度，便可依次将它们洗脱下来而分开，并进行定量测定。在此基础上发展了氨基酸自动分析仪。随着科学技术的日益进展，氨基酸自动分析仪在样品的用量，分离速度及检测能力上也有了很大的提高。当前最好的仪器样品分析量只要几十Picomole,分析时间只要数十分钟，而且计算全部自动化，给研究蛋白质一级结构带来了极大的方便。
2.多肽链的降解
多肽链的氨基酸组成往往是比较复杂，因此直接分析多肽的氨基酸顺序还是很困难的，多采用将多肽链进一步降解成为更小的片段，然后再行分析。肽键的裂解是一级结构研究工作中的重要问题，它要求裂解点少，选择性强，而且反应产率高，当前主要有化学法和酶解法两类。
化学法
溴化氰法:　是最理想的化学方法，能选择性断裂甲硫氨酸所在的肽键.
溴化氢化学降解法其优点：
①一般蛋白质含甲硫氨酸较少，由此可获得大片段;
②专一性强;
③产率高达80%以上;
④作用条件温和，在室温中用几到十几小时即可。
3.肽段的分离
大部分肽段的分离主要经过凝胶过滤法，由于大分子肽溶解度小。往往采用甲酸、醋酸、丙酸等有机溶剂使之溶解。
4.肽的顺序分析
酶解法:分析肽段也可采用酶解法，利用专一性不同的两种酶将一个肽分别断裂成更小的寡肽，比较两种方法所得之肽段的重复性，进行氨基酸顺序的装配。例如，有一个肽段，经过氨基酸组成分析已知其为十肽，假如先以糜蛋白酶水解，则得到一套寡肽，再以胰蛋白酶水解此十肽，得到另一套寡肽。分析结果如下：
Ala·Phe+Gly·Lys·Asn·Tyr+Arg·Trp+His·Val
糜蛋白酶水解
+肽(Ala·Phe·Gly·Lys·Asn·Tyr·Arg·Trp·His·Val)
胰蛋白酶水解
Ala·Phe·Gly·Lys+Asa·Tyr·Arg+Trp·His·Val
将此两套寡肽能够做分析比较，因为十肽的N末端及C末端已事先测定分别为Ala及Val，因此第一段寡肽必然是Ala,Phe。如此类推如下
寡肽号
氨基酸组成部分顺序
A-1
Ala·Pha
B-1
Ala·Phe·Gly·Lys
A-2
Gly·Lys·Asn·Tyr
B-2
Asn·Tyr·Arg
A-3
Arg·Trp
B-3
Trp·His·Val
A-4
His·Val
+肽顺序
Ala·Phe·Gly·Lys·Asn·Tyr·Arg·Trp·His·Val
5.二硫键定位
蛋白质分子不经任何处理，直接用酶水解，检出其中二硫键的肽段，然后将二硫键拆开，分别测定两个肽的顺序，将此两肽结构与测出的一级结构比较，就能找出相应的二硫键的位置。
用酶直接水解变形的蛋白质： 由于二硫键只在偏酸性条件下才稳定存在，（在碱性条件下易发生交换），因此常见胃蛋白酶水解，且此酶专一性低，位点多，生成的肽段中包含二硫键的比较少，易于鉴定。
含-S-S-肽被分离后，即可进行肽段顺序分析，并与已测定的胰岛素的一级结构进行比较，即可找出相应的-S-S-位置，至此胰岛素的一级结构基本阐明。

参考文献
① 引自网上期刊： 作者 ：网站原创 ，《蛋白质一级结构的测定方法》 ， 4月27号.
② 引自期刊： 作者 ：曹秋平 《中国科学》 ，1981 年版， 7：第886页.
③ 引自百度文库.