右美托咪定对大鼠心肌缺血再灌注损伤的作用及其机制研究_冷志伟.pdf

广西医科大学学报JOURNAL OF GUANGXI MEDICAL UNIVERSITY2022 Dec；39（12）右美托咪定对大鼠心肌缺血再灌注损伤的作用及其机制研究*冷志伟，马文俊，张璐，黎杏梅，梁蓓薇，陈燕桦（广西医科大学第一附属医院，南宁530021）摘要目的：探讨右美托咪定对大鼠心肌缺血再灌注（I/R）损伤的作用及其机制。方法：将48只SPF级雄性SD大鼠随机分为4组：假手术组（Sham组）、I/R组、I/R+右美托咪定组（D组）、I/R+右美托咪定+PPAR抑制剂GW9662组（DG组）。I/R组、D组和DG组通过线栓法（缺血0.5 h，再灌注3 h）制备心肌I/R模型，Sham组仅开胸不结扎。D组从模型制备前5 min至再灌注结束经股静脉泵注5 g/kgh-1右美托咪定，DG组在模型制备前2 h腹腔注射1 mg/kg GW9622，并泵注与D组等剂量右美托咪定。监测大鼠心率和平均动脉压。采用TTC染色检测心肌损伤面积，苏木精伊红（HE）染色观察心肌组织病理形态变化。用western blotting法检测心肌组织PPAR、磷酸化（p-）PPAR、NF-B p65、Caspase 3、Bcl-2、Bax蛋白表达，实时荧光定量PCR（RT-qPCR）法检测PPAR、NF-B基因表达。结果：与I/R组比较，D组缺血期和再灌注期的心率和平均动脉压稳定，心肌损伤面积缩小，心肌组织病理损伤减轻，心肌组织中Bax、Caspase 3蛋白表达量降低，Bcl-2蛋白表达量升高，PPAR和p-PPAR基因及蛋白表达量升高，NF-B p65基因及蛋白表达量降低（均P0.05）；与D组比较，DG组Bcl-2蛋白表达量降低，NF-B p65、Bax、Caspase 3蛋白表达量升高（均P0.05），心肌损伤面积增加，心肌组织病理损伤加重。结论：右美托咪定对大鼠心肌I/R损伤具有保护作用，其机制可能与激活PPAR/NF-B信号通路有关。关键词心肌缺血再灌注；右美托咪定；PPAR；NF-B中图分类号：R614.1文献标志码：A文章编号：1005-930X（2022）12-1964-06DOI：10.16190/ki.45-1211/r.2022.12.015Effects and mechanism of dexmedetomidine on myocardial ischemia-reperfusion injury inratsLeng Zhiwei,Ma Wenjun,Zhang Lu,Li Xingmei,Liang Beiwei,ChenYanhua.(The First Affiliated Hospital ofGuangxi Medical University,Nanning 530021,China)AbstractObjective:To investigate the effects and mechanism of dexmedetomidine on myocardial ischemia-re-perfusion(I/R)injury in rats.Methods:Forty-eight SPF male SD rats were randomly divided into four groups:Sham group,I/R group,I/R+dexmedetomidine group(D group),and I/R+dexmedetomidine+PPAR inhibitorGW9662 group(DG group).The Myocardial I/R model was established in I/R group,D group and DG group bythread embolism method(0.5 h ischemia,3 h reperfusion),while the Sham group only underwent thoracotomywithout ligation.D group was injected with 5 g/kg.H-1dexmedetomidine via femoral vein pump from 5 min be-fore model preparation to the end of reperfusion;DG group was intraperitoneally injected with 1 mg/kg GW96222 h before model preparation and pumped with the same dose of dexmedetomidine as D group.Heart rate andmean arterial pressure were monitored.TTC staining was used to detect the area of myocardial injury,and hema-toxylin-eosin(HE)staining was used to observe the pathological changes in myocardial tissues.The protein ex-pressions of PPAR,phosphorylated(p-)PPAR,NF-B p65,Caspase 3,Bcl-2 and Bax in myocardial tissueswere detected by western blotting.The expressions of PPAR and NF-B genes were detected by Real-time fluo-rescence quantitative polymerase chain reaction(RT-qPCR).Results:Compared with I/R group,heart rate andmean arterial pressure in D group during ischemia and reperfusion were stable,the area of myocardial injury andthe pathological injury of myocardial tissues were re-duced,the protein expressions of Bax and Caspase 3in myocardial tissues decreased,the protein expres-sion of Bcl-2 as well as the gene and protein expres-*基金项目：广西自然科学基金资助项目（No.2018GXNSFAA294007）通信作者，E-mail：收稿日期：2022-09-30 1964sions of PPAR and p-PPAR increased,and NF-B p65 gene and protein expression decreased(all P0.05);compared with D group,the protein expression of Bcl-2 in DG group decreased while the protein expressions ofNF-B p65,Bax and Caspase 3 increased(all P0.05)with the area of myocardial injury increasing and the path-ological injury of myocardial tissues aggravated.Conclusion:Dexmedetomidine has a protective effect on myo-cardial I/R injury in rats,and its mechanism may be related to the activation of PPAR/NF-B signaling pathway.Keywordsmyocardial ischemia-reperfusion;dexmedetomidine;PPAR;NF-B心肌梗死是许多国家心脏病发病率和病死率升高的最常见原因1，尽早实现再灌注治疗有利于预防心肌细胞死亡和收缩功能障碍2。经皮冠状动脉介入治疗和冠状动脉旁路移植术是目前临床上有效的冠心病治疗方法3。然而，研究表明，再灌注本身可能加重损伤，诱发心肌细胞死亡，导致缺血后梗死范围扩大，即缺血再灌注（I/R）损伤4。目前，心肌I/R对心肌所造成的损伤还没有更好的治疗措施。因此，有必要开发新的策略来预防心肌I/R损伤，以改善冠心病患者的临床预后。过氧化物酶体增殖物激活受体（PPAR）作为细胞内重要的配体激活受体和细胞转录分化因子，在哺乳动物多种组织中均有分布，如脂肪组织、平滑肌组织、心肌组织等5。核因子 B（NF-B）作为一种重要的炎症因子，广泛参与机体对外界刺激（如病毒、高温、辐射、重金属）的反应6；且在各类炎症细胞和细胞免疫中发挥作用。研究发现，PPAR/NF-B通路在心肌I/R损伤过程中起到重要的作用7。多项研究表明，右美托咪定作为围术期常用的镇静镇痛药，在I/R及其他因素所致的心脏损伤中具有一定的保护作用8-10，包括预防心律失常、稳定血压、减轻心肌I/R损伤等11。本研究旨在观察右美托咪定对大鼠心肌I/R损伤的作用及其对PPAR/NF-B信号通路的影响。1材料与方法1.1实验动物成年雄性SD大鼠，体重300350 g，购于广西医科大学实验动物中心，动物生产许可证号：SCXK桂2020-0004，动物使用许可证号：SYXK-桂2020-0004。对大鼠进行分笼饲养，水和食物充足，温度2025，12 h/12明暗交替。本研究经广西医科大学实验动物伦理委员会批准（审批号：202101014）。1.2主要试剂与仪器右美托咪定（江苏恒瑞医药股份有限公司）；PPAR抑制剂GW9662（碧云天科技有限公司）；Bax单克隆抗体（万类生物）；Caspase 3单克隆抗体（万类生物）；Bcl-2 单克隆抗体（abcam）；磷酸化（p-）PPAR 单克隆抗体（Abcam）；PPAR 单克隆抗体（Gene Tex）；NF-B p65单克隆抗体（Cell signalingTechnology）；GAPDH（Proteintech）；荧光二抗（Ther-mofisher Scientific）；BCA试剂盒（南宁市博达实验耗材经营部）；实时荧光定量PCR（RT-qPCR）试剂盒（南宁市美仑实验器材经营部）；快速RNA提取试剂盒（南宁市基诺生物技术有限公司）。1.3实验方法1.3.1动物分组将48只SD大鼠随机分为4组：假手术组（Sham组）、I/R组、I/R右美托咪定组（D组）、I/R右美托咪定GW9662组（DG组），每组12只。1.3.2I/R模型制备及给药采用改良线栓法12制备大鼠心肌I/R模型。建模前8 h禁食不禁水，腹腔注射1%戊巴比妥钠（30 mg/kg）麻醉大鼠，行气管插管，连接小动物呼吸机。在胸骨左侧逐层钝性分离肌肉组织，剪断第34肋，暴露心脏；撕开心包膜，在左心耳与主动脉根部之间、下缘26 mm处，用眼科缝合针将6-0丝线穿过心肌层，收紧结扎线。以左心室变白、心电图ST段抬高为结扎成功标志。缺血0.5 h后松开结扎线，再灌注3 h。Sham组仅开胸不结扎。各组大鼠均行股静脉穿刺，放置穿刺针，连接泵注管。D组从建模前5 min至再灌注结束，通过微量泵经股静脉泵注5 g/kgh-1右美托咪定；DG组建模前2 h腹腔注射1 mg/kg的GW9662，并经股静脉泵注与D组等剂量的右美托咪定。Sham组和I/R组泵注等量生理盐水。1.3.3大鼠血流动力学监测分别在缺血期、再灌注期，每5 min测量1次心率和血压。取5次测量的平均值。1.3.4TTC法检测心肌损伤面积再灌注结束后行颈静脉穿刺，放置静脉穿刺留置导管。将20 mL冷志伟,等.右美托咪定对大鼠心肌缺血再灌注损伤的作用及其机制研究 1965广西医科大学学报2022 Dec；39（12）10%TTC溶液注入颈静脉。10 min后取出心脏，用生理盐水洗净，沿心尖至心底以横切面切成均匀厚度的环形切片，置于甲醛溶液中固定24 h。拍照，用Image J软件分析计算心肌损伤面积。1.3.5苏木精伊红（HE）染色取部分左心室组织，固定于4%多聚甲醛，常规石蜡包埋，4 m厚连续切片，行HE染色，显微镜下观察心肌组织病理形态学改变。1.3.6Western blotting检测相关蛋白指标取部分左心室组织，提取组织总蛋白，BCA法测定蛋白浓度，SDS-PAGE凝胶电泳分离蛋白，将蛋白转移至PVDF膜，BSA封闭1 h；加入一抗稀释液（PPAR、p-PPAR、NF-B p65均为1 1 000，Caspase 3、Bcl-2、Bax均为1 1 500）4 孵育过夜，TBST洗膜，加入荧光二抗（1 2 000）室温孵育1 h，TBST洗膜，ECL显影。用Odessey红外荧光扫膜仪扫膜，Image J软件分析蛋白条带灰度值。以目的蛋白条带灰度值与内参GAPDH条带灰度值的比值表示目的蛋白表达量。1.3.7RT-qPCR法检测心肌组织PPAR、NF-B基因表达取左心室，提取心肌组织总RNA，逆转录为cDNA，行PCR扩增。PCR反应条件：95 预变性30 s；95 变性5 s，60 退火、延伸30 s，共40个循环。引物由上海生工生物工程有限公司设计并合成。引物序列如下：PPAR上游：5-TCTGTGG-ACCTCTCTGTGATGGATG-3，下游：5-GTCAG-CTCTTGTGAACGGGATGTC-3；NF-B 上游：5-TCAGAGGCCAGAAGAGGGTGTTG-3，下游：5-TCGTCGTCTGCCATGTTGAAGATG-3；GAPDH上游：5-GCATCTTCTTGTGCAGTGCC-3，下游：5-GAGAAGGCAGCCCTGGTAAC-3。采用2-CT法计算目的基因相对表达量。1.4统计学方法采用SPSS 23.0 软件对数据进行统计分析，正态分布的计量资料以均数标准差（x s）表示，多组间比较采用方差分析，组间两两比较采用LSD-t检验，以P0.05为差异有统计学意义。2结果2.1各组大鼠血流动力学指标比较各组大鼠建模前心率和平均动脉压比较，差异均无统计学意义（均P0.05）；建模后，与Sham组比较，I/R组缺血期心率和平均动脉压升高，再灌注期心率和平均动脉压降低（均P0.05）；与I/R组比较，D组缺血期的心率和平均动脉血压均降低，再灌注期的心率和平均动脉压均升高（均P0.05）；与D组比较，DG组缺血期和再灌注期的心率下降，而缺血期的平均动脉压升高，再灌注期的平均动脉压降低（均P0.05），见表1。组别Sham组I/R组D组DG组n12121212心率/（次/min）缺血期375.504.08430.503.40404.255.23*380.753.84*再灌注期376.086.99313.1710.87355.508.00*323.838.15*平均动脉压/kPa缺血期11.890.5114.010.5810.590.61*11.180.70*再灌注期11.620.878.641.149.170.31*8.490.37表1各组大鼠缺血期和再灌注期心率、平均动脉压的比较x s与Sham组比较，P0.05；与I/R组比较，*P0.05；与D组比较，P0.05。2.2各组大鼠心肌损伤面积比较经TTC染色后，正常心肌组织染成鲜红色，损伤区域心肌组织染成白色。与Sham组比较，I/R组心肌损伤面积增加（P0.05）；与I/R组比较，D组心肌损伤面积减小（P0.05）；与D组比较，DG组心肌损伤面积增加（P0.05），见图1。2.3各组大鼠心肌组织病理学改变光镜下Sham组心肌细胞形态正常，排列有序，无空泡状坏死。I/R组、D组和DG组出现不同程度的心肌细胞肿大，排列无序，有空泡状坏死，周围可见纤维结缔组织；与I/R组比较，D组心肌细胞肿胀程度较小，细胞排列相对有序，空泡状坏死细胞较少，未见纤维结缔组织；与D组比较，DG组心肌细胞肿胀断裂，细胞排列无序，可见大量纤维结缔组织，见图2。2.4各组心肌组织 PPAR、p-PPAR、NF-B p65、1966Bax、Caspase 3、Bcl-2蛋白表达比较与Sham组比较，I/R组NF-B p65、Caspase 3、Bax蛋白表达量升高，PPAR、p-PPAR/PPAR、Bcl-2表达量降低（均P0.05）；与I/R组比较，D组NF-B p65、Caspase 3、Bax蛋白表达量降低，PPAR、p-PPAR/PPAR、Bcl-2表达量升高（均P0.05）；与D组比较，DG组NF-B p65、Bax、Caspase 3蛋白表达量升高，PPAR、p-PPAR/PPAR、Bcl-2蛋白表达量降低（均P0.05），见图3。与Sham组比较，P0.05；与I/R组比较，*P0.05；与D组比较，P0.05。图3各组心肌组织PPAR、p-PPAR、NF-B p65、Bax、Caspase 3、Bcl-2蛋白表达比较A：各组大鼠心肌组织TTC染色图；B：各组大鼠心脏损伤面积百分比；与Sham组比较，P0.05；与I/R组比较，*P0.05；与D组比较，P0.05。图1各组大鼠心脏TTC染色结果A：sham组；B：I/R组；C：D组；D：DG组。标尺=50 m。图2各组大鼠心肌HE染色图（400）冷志伟,等.右美托咪定对大鼠心肌缺血再灌注损伤的作用及其机制研究 1967广西医科大学学报2022 Dec；39（12）2.5各组心肌组织PPAR和NF-B基因表达比较与Sham组比较，I/R组PPAR mRNA相对表达量降低，NF-B mRNA 相对表达量升高（均 P0.05）；与I/R组比较，D组PPAR mRNA相对表达量升高，NF-B mRNA相对表达量降低（均P0.05）；与D组比较，DG组PPAR mRNA相对表达量降低，NF-B mRNA相对表达量升高（均P0.05），见图4。与Sham组比较，P0.05；与I/R组比较，*P0.05；与D组比较，P0.05。图4各组心肌组织PPAR、NF-B基因表达比较3讨论心肌 I/R 损伤是冠心病手术常见的一种并发症，目前主要机制有钙超载、白细胞浸润、氧自由基的大量产生、高能磷酸化合物缺乏等13。右美托咪定作为一种术中常用的麻醉镇静药，具有良好的稳定心率、降低血压的作用。研究表明，在心脏外科手术中，右美托咪定能够通过抗炎通路减轻心肌I/R损伤14。本研究通过TTC染色和HE染色发现，D组大鼠心肌损伤面积减小，心肌细胞形态、排列相对稳定，与文献报道15结果相一致。这提示右美托咪定对心肌I/R损伤具有保护作用。近年来多项研究表明，PPAR/NF-B信号通路不仅参与机体免疫调节、炎症反应及肿瘤等生理病理过程，还参与感染、细胞周期调控、细胞分化及凋亡等16-17。PPAR可直接与NF-B的亚基p65/p50结合，发生蛋白蛋白相互作用，形成转录抑制复合物，降低 NF-B 与 DNA 结合活性，抑制 NF-BDNA合成，减少与凋亡相关的靶基因激活，进而抑制组织中凋亡因子的释放18。Fujimoto等19研究发现，右美托咪定能够活化PPAR，增强Bcl-2表达，抑制细胞凋亡，减少炎症因子的释放，减轻心肌炎症反应。本研究发现，模型组心肌组织PPAR表达量降低，NF-B p65蛋白表达量升高，同时，Bax和Caspase 3蛋白表达水平显著升高。说明I/R大鼠心肌中NF-B信号通路活化，心肌损伤明显；经右美托咪定干预后，PPAR蛋白表达显著上调，NF-B蛋白表达明显下调，心肌组织中凋亡相关蛋白Bax和Caspase 3表达水平显著下降，而抗凋亡蛋白Bcl-2表达水平升高。PPAR抑制剂GW9662消除了右美托咪定对心肌I/R损伤的保护作用。表明右美托咪定通过激活PPAR/NF-B信号通路抑制心肌炎症反应及细胞凋亡，从而减轻大鼠心肌I/R损伤。综上所述，右美托咪定能够降低大鼠心肌I/R损伤，抑制心肌细胞凋亡和炎症反应，其机制可能与PPAR/NF-B通路有关。但右美托咪定对心肌I/R损伤的作用机制和相关靶点还需要更深入的研究。参考文献：1 刘宁,陈林,尹唯思,等.冠状动脉非阻塞性心肌梗死的研究进展 J.中国老年学杂志,2021,41(7):1560-1564.LIU N,CHEN L,YIN W S,et al.Research progress ofcoronary non-obstructive myocardial infarctionJ.Chi-nese Journal of Gerontology,2021,41(7):1560-1564.2 郭伟楠,殷玥,马恒.缺血/再灌注后心肌细胞死亡方式的选择及其机制探讨 J.心脏杂志,2015,27(4):470-473.GUO W N,YIN Y,MA H.Indicators and mechanism ofmyocardial cell death after ischemia/reperfusion J.Chi-nese Heart Journal,2015,27(4):470-473.3 郭晓芳,陈静静,陈霞.老年患者冠心病治疗的研究进展 J.医学综述,2021,27(11):2189-2193.GUO X F,CHEN J J,CHEN X.Research progress in thetreatment of coronary heart disease in elderly patientsJ.Medical Recapitulate,2021,27(11):2189-2193.4IVANOVA E A,MYASOEDOVA V A,MELNICHENKOA A,et al.Peroxisome proliferator-activated receptor(PPAR)gamma agonists as therapeutic agents for cardio-vascular disorders:focus 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