进出口动物源性食品中沃尼妙林及其同系物泰妙菌素残留量的测定方法_高效液相色谱串联质谱法_意见稿.doc

GB/T 1234—××××
9993333
中华人民共和国出入境检验检疫行业标准
SN
中华人民共和国
国家质量监督检验检疫总局
发 布
20 -××-××实施
20 -××-××发布
进出口动物源性食品中沃尼妙林及其同系物泰妙菌素残留量的测定方法 高效液相色谱串联质谱法

Determination of valnemulin and tiamulin Residues in foodstuffs of animal origin for import and export —LC-MS-MS method
（征求意见稿）

SN/T ××××—××××

2
SN/Txxxxx—xxxx
前 言
本标准的附录A、附录B、附录C为资料性附录。
本标准是按照GB/T 1.1-2009《标准化工作导则 第1部分：标准的结构和编写的规则》、GB/T 20001.4-2001《标准编写规则 第4部分：化学分析方法》和行业标准SN/T0001-1995《出口商品中农药、兽药残留量及生物毒素检验方法标准编写的基本规定》起草。
本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。
本标准起草单位：中华人民共和国秦皇岛出入境检验检疫局。
本标准主要起草人：刘晓茂、李学民、杨志伟、葛娜、张守军、曹亚平、张进杰

I
进出口动物源性食品中沃尼妙林及其同系物泰妙菌素残留量的测定方法 高效液相色谱串联质谱法

1　 范围
本标准规定了动物源性食品中沃尼妙林及其同系物泰妙菌素残留量的液相色谱-串联质谱测定方法。
本标准适用于动物组织、内脏、鱼、蛋和奶中沃尼妙林及其同系物泰妙菌素残留量的测定。
2　 规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有修改单）适用于本文件。
GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法
3　 方法提要
用乙腈提取试样中的沃尼妙林和泰妙菌素，OasisMCX SPE小柱净化, 经C18色谱柱分离，以电喷雾离子源(ESI)在正离子多反应监测(MRM)模式下进行测定, 外标法定量。
4　 试剂和材料
除另有说明外，所用试剂均为优级纯，水为GB/T6682规定的一级水。
4.1 甲醇：色谱纯。
4.2 乙腈：色谱纯。
4.3 甲酸：优级纯。
4.4 正己烷：优级纯。
4.5 氨水：25%。
4.6 氯化钠：优级纯。
4.7 无水硫酸钠：650℃灼烧4h，在干燥器内冷却至室温，贮于密封瓶中备用。
4.8 甲酸-水（1+19，V/V）：取5mL甲酸（4.3）用水定容至100mL。
4.9 氨水-甲醇（1+19，V/V）：取5mL氨水（4.5）用甲醇（4.1）定容至100mL。
4.10 乙腈-水（1+3，V/V）：取25mL乙腈（4.2）用水定容至100mL。
4.11 标准物质：沃尼妙林(CAS：101312-92-9)；纯度大于等于98%；泰妙菌素(CAS：55297-95-5)；纯度大于等于98%
4.12 沃尼妙林标准贮备溶液：1.0 mg/mL。称取适量的沃尼妙林标准物质，用甲醇溶解并配制成1.0 mg/mL的标准贮备液。避光保存于－18℃冰柜中。
4.13 泰妙菌素标准贮备溶液：1.0 mg/mL。称取适量的泰妙菌素标准物质，用甲醇溶解并配制成1.0 mg/mL的标准贮备液。避光保存于－18℃冰柜中。
4.14 沃尼妙林和泰妙菌素混合标准工作溶液：1.0 μg/mL。吸取适量沃尼妙林标准贮备溶液（4.12和泰妙菌素标准贮备溶液（4.13），用乙腈-水（4.10）稀释成1.0 μg/mL的标准工作溶液，4℃冷藏避光保存。
4.15 MCX固相萃取小柱：60mg，3ml，或相当者。
4.16 微孔滤膜：0.2 μm，尼龙。
5 仪器
5.1 液相色谱-串联四极杆质谱仪，配有电喷雾离子源（ESI）。
5.2 分析天平：感量分别为0.01 mg和0.01g。
5.3均质器：15 000r/min。
5.4 振荡器。
5.5 离心机：10 000r/min。
5.6 旋转蒸发器。
5.7 固相萃取装置。
5.8 真空泵：真空度应达到80kPa。

6 试样的制备与保存
6.1 动物组织、内脏、鱼
从原始样品取出有代表性样品约500g，用组织捣碎机充分捣碎混匀，混匀，均分成两份，分别装入洁净容器内。密封作为试样，注明标记。 将试样于－18 ℃冷冻保存。试样在制备和保存过程中避免受到污染或待测物含量发生变化。
6.2 蛋
从原始样品取出有代表性样品约500g，去壳后用组织捣碎机充分捣碎混匀，混匀，均分成两份，分别装入洁净容器内。密封作为试样，注明标记。 将试样置于4℃冷藏避光保存。试样在制备和保存过程中避免受到污染或待测物含量发生变化。
6.3 奶
从原始样品取出有代表性样品约500g，用组织捣碎机充分捣碎混匀，混匀，均分成两份，分别装入洁净容器内。密封作为试样，注明标记。将试样置于4℃冷藏避光保存。试样在制备和保存过程中避免受到污染或待测物含量发生变化。
7测定步骤
7.1 提取
7.1.1　动物组织、内脏和鱼
称取2 g（精确至0.01 g）样品至离心管中，加入5g无水硫酸钠(4.7)、10 mL乙腈，用均质器于10 000 r／min速率下均质2min，振荡10min，以4 000r/min离心10min。上层清液转移至鸡心瓶中，用10mL乙腈重复上述提取、离心操作，合并两次提取的上清液，浓缩至近干，用5mL 甲酸-水（4.8）溶解，混匀，待净化。
7.1.2　蛋和奶
称取5 g（精确至0.01 g）样品至离心管中，加入2g氯化钠、10 mL乙腈，振荡 20 min，以4000r/min离心5min。取上层清液5mL，于鸡心瓶中，浓缩至近干，用5mL 甲酸-水（4.8）溶解，混匀，待净化。
7.2 净化
依次用3 mL 氨水-甲醇（4.9）、3 mL甲醇和10 mL水淋洗MCX固相萃取小柱，弃去淋洗液。将上述提取液过柱，再依次用3 mL甲酸-水（4.8）、3 mL甲醇，3mL正已烷淋洗小柱，弃去全部流出液，减压抽干，最后用5 mL氨水-甲醇(4.9)洗脱，收集洗脱液，40℃氮气吹干，1 mL 乙腈-水（4.10）溶液定容过膜，待测。

7.3测定
7.3.1液相色谱参考条件
a） 色谱柱： C18，1.7μm，50 mm×2.1 mm（内径）或相当者；
b） 柱温：35℃;
c） 进样量：10 µL。
d） 流动相：Ａ：甲酸（1+999）溶液(4.3)水溶液；Ｂ：乙腈。梯度洗脱条件见表1。
表1液相色谱梯度洗脱条件
时间 / min
流速/µL /min
A / %
B / %
0
300
95
5
0.8
300
60
40
2.3
300
40
60
2.4
300
5
95
4
300
5
95

7.3.2质谱参考条件
a) 离子源：电喷雾离子源；
b) 扫描方式：正离子扫描；
c) 检测方式：多反应监测（MRM）；
d) 雾化气、气帘气、辅助加热气、碰撞气均为高纯氮气；使用前应调节各气体流量以使质谱灵敏度达到检测要求，参考条件见附录A。
e)喷雾电压、去集簇电压、碰撞能量等参数应优化至最优灵敏度，参考条件见附录A。

7.3.3液相色谱-串联质谱测定
7.3.3.1定性确证
被测组分选择1个母离子，2个以上子离子，在相同实验条件下，样品中待测物质的保留时间与混合基质标准校准溶液中对应组分的保留时间偏差在±2.5%之内；且样品谱图中被测组分的相对离子丰度与浓度接近的混合基质标准校准溶液谱图中对应的相对离子丰度进行比较，偏差不超过表2规定的范围，则可判定样品中存在对应的待测物。
表2 定性确证时相对离子丰度的最大允许偏差
相对离子丰度K
K＞50%
20%<K<50%
10%<K<20%
K≤10%
允许的最大偏差
±20%
±25%
±30%
±50%

7.3.3.2定量测定
外标法定量：在仪器最佳工作条件下，混合基质标准校准溶液进样测定，以混合基质标准校准溶液浓度为横坐标，以峰面积为纵坐标，绘制标准工作曲线，用标准工作曲线对待测样品进行定量，样品溶液中待测物的响应值均应在仪器测定的线性范围内。沃尼妙林和泰妙菌素的标准物质多反应监测(MRM)色谱图参见附录B中的图B.1。
7.4 空白实验
除不称取试样外，均按上述步骤进行。
7.5 结果计算与表述
按式(1)计算试样中沃尼妙林和泰妙菌素的含量：
……………………（1）
式中：
X－试样中被测化合物的含量；单位为微克每千克（µg/kg）；
A－样液中被测化合物的峰面积；
A0－空白实验中被测化合物的峰面积；
c－标准工作溶液中被测化合物的浓度，单位为纳克每毫升（ng / mL）；
V－样液最终定容体积，单位为毫升（mL）；
AS－标准工作溶液中被测化合物的峰面积；
m－最终样液所代表的试样量，单位为克（g）。
8 测定低限、回收率
8.1测定低限
本方法测定低限： 本方法的沃尼妙林和泰妙菌素测定低限均为5.0 μg/kg。
8.2回收率
猪肉、鱼肉、猪肝、牛奶、鸡蛋中沃尼妙林和泰妙菌素添加浓度及其回收率实验数据见附录C中的表C.1。

附 录 A
（资料性附录）

参考质谱条件：
a) 离子源：电喷雾离子源；
b) 扫描方式：正离子扫描；
c) 检测方式：多反应监测（MRM）；
d) 毛细管电压：5400V
e) 气帘气压力流速：3.5 L/min；
f) 雾化气压力流速：6 L/min；
g) 辅助气压力流速：8 L/min；
h) 辅助气温度：550℃；
i)监测离子对、采集时间、保留时间、去簇电压和碰撞能量见表A.1。

表A.1 沃尼妙林和泰妙菌素的质谱参数
化合物
定性离子对/(m/z)
定量离子对/(m/z)
采集时间/(ms)
保留时间/min
去簇电压DP/(V)
碰撞能量CE/(V)
泰妙菌素
494.30/192.10
494.30/192.10
80
1.98
234
25
494.30/119.00
38
沃尼妙林
565.30/263.10
565.30/263.10
80
2.09
100
25
565.30/285.20
29

1）非商业性声明：附录B所列参数是在API5500质谱仪上完成的，此处列出试验用仪器型号仅是为了提供参考，并不涉及商业目的，鼓励标准使用者尝试采用不同厂家或型号的仪器。

附 录 B
（资料性附录）
沃尼妙林和泰妙菌素的多反应检测（MRM）色谱图
响应值/cps
响应值/cps
泰妙菌素
沃尼妙林
图B.1. 沃尼妙林和泰妙菌素的多反应检测（MRM）色谱图

附 录 C
（资料性附录）

沃尼妙林和泰妙菌素添加浓度及平均回收率的实验数据如下：

表C.1 沃尼妙林和泰妙菌素的添加浓度及平均回收率（n=10）
化合物
鸡肉
鱼肉
猪肝
鸡蛋
牛奶
添加水平
/μg/kg
平均
回收率/%
添加水平
/μg/kg
平均
回收率/%
添加水平
/μg/kg
平均
回收率/%
添加水平
/μg/kg
平均
回收率/%
添加水平
/μg/kg
平均
回收率/%
沃尼
妙林
5.0
91.4
5.0
91.0
5.0
89.5
5.0
86.9
5.0
80.0
20.0
94.0
20.0
93.2
20.0
90.5
20.0
89.2
20.0
82.0
100.0
93.4
100.0
92.5
100.0
92.2
100.0
90.4
100.0
86.2
泰妙
菌素
5.0
92.2
5.0
91.2
5.0
87.5
5.0
89.2
5.0
79.9
20.0
93.5
20.0
93.5
20.0
89.5
20.0
92.5
20.0
80.3
100.0
94.0
100.0
93.2
100.0
90.5
100.0
92.6
100.0
87.0