亚急性瘤胃酸中毒耐受性不同...瘤胃上皮形态及功能差异研究_张涛.pdf

第 32 卷第 2 期Vol.32，No.2131-1392023 年 2 月草业学报ACTA PRATACULTURAE SINICA张涛，牟英玉，亓王盼，等.亚急性瘤胃酸中毒耐受性不同的奶牛瘤胃上皮形态及功能差异研究.草业学报，2023，32（2）：131139.ZHANG Tao，MU Ying-yu，QI Wang-pan，et al.Comparison of rumen epithelium morphology and function in dairy cows with differences insusceptibility for subacute ruminal acidosis.Acta Prataculturae Sinica，2023，32（2）：131139.亚急性瘤胃酸中毒耐受性不同的奶牛瘤胃上皮形态及功能差异研究张涛，牟英玉，亓王盼，张继友，毛胜勇*（南京农业大学消化道微生物研究室，反刍动物与营养饲料工程中心，动物科技学院，江苏 南京 210095）摘要：本试验旨在探究 SARA（亚急性瘤胃酸中毒）耐受性不同奶牛的瘤胃上皮形态及其功能差异。选取 12头装有永久性瘤胃瘘管的泌乳中期荷斯坦奶牛，饲喂精粗比为 4 6 的日粮，并根据瘤胃 pH 值的高低，分为 SARA 易感组（SUS，n=4）和 SARA 耐受组（TOL，n=4）。瘤胃上皮形态及功能分析结果显示，与 TOL组比较，SUS组奶牛瘤胃上皮的棘突层和基底层厚度明显增厚（P0.05），SUS 组奶牛瘤胃上皮组织中参与挥发性脂肪酸（VFA）吸收的PAT1、MCT4和 DRA基因表达量较 TOL组显著下调（P0.05），而 H+转运载体 NHE1、NHE2、NHE3和调节胞内pH的 vH+ATPase和 Na+/K+ATPase的表达量显著升高（P0.05）；对参与调控瘤胃 VFA代谢的基因定量结果表明，SUS组 PDHA1和 SREBP2的表达量显著高于 TOL组（P0.05），而 HMGCL-2的表达量显著降低（P0.05）；此外，SUS组 CDK2、CDK6和 Cyclin D1、Bad及 Caspase-9等参与瘤胃上皮细胞增殖与凋亡的基因表达量显著高于TOL 组（P0.05）。结果说明，在相同日粮条件下，SUS 组奶牛瘤胃上皮细胞调控游离脂肪酸吸收的基因表达量下调，造成瘤胃上皮对 VFA 的吸收能力下降，使得瘤胃内 VFA 累积和 pH 下降，并导致 SUS 组奶牛 SARA 的患病风险增高。关键词：奶牛；亚急性瘤胃酸中毒；耐受性；瘤胃上皮Comparison of rumen epithelium morphology and function in dairy cows withdifferences in susceptibility for subacute ruminal acidosisZHANG Tao，MU Ying-yu，QI Wang-pan，ZHANG Ji-you，MAO Sheng-yong*Laboratory of Gastrointestinal Microbiology，Ruminant Nutrition and Feed Engineering Center，College of Animal Science andTechnology，Nanjing Agricultural University，Nanjing 210095，ChinaAbstract：This experiment was conducted to compare the morphology and function of rumen epithelium in dairy cowswith differences in susceptibility to subacute ruminal acidosis（SARA）.Twelve multiparous fistulated Holstein cowsin mid lactation were housed in individual stalls and fed a diet with a concentrate to forage ratio of 4 6 throughout theexperimental period.Based on the ruminal pH，cows with relatively lower and higher mean ruminal pH wereassigned，respectively，to susceptible（SUS，n=4）and tolerant（TOL，n=4）groups.The examination of ruminalepithelial morphology and function revealed that the cells in the spinous process and basal layer of ruminal epitheliumwere thicker in the SUS than in the TOL group（P0.05）.In the SUS group，the expression levels of PAT1，MCT4，and DRA genes involved in volatile fatty acid（VFA）absorption were significantly lower（P0.05），whileDOI：10.11686/cyxb2022065http：/收稿日期：2022-02-14；改回日期：2022-04-20基金项目：国家自然科学基金项目（32072755）资助。作者简介：张涛（1994-），男，湖南邵阳人，在读硕士。E-mial： 通信作者 Corresponding author.E-mail：Vol.32，No.2ACTA PRATACULTURAE SINICA（2023）the NHE1，NHE2，NHE3，vH+ATPase，and Na+/K+ATPase levels were significantly higher than in the TOLgroup（P0.05）.The results of gene expression for ruminal VFA metabolism showed that PDHA1 and SREBP2in the SUS group was higher（P0.05），while the expression of HMGCL-2 was significantly lower（P0.05）.Inaddition，the expression levels of genes involved in the proliferation and apoptosis of rumen epithelial cells，such asCDK2，CDK6，Cyclin D1，Bad and Caspase-9 in the SUS group were higher in the SUS group than in the TOLgroup（P0.05）.In summary，under the same diet，there was a lower expression of genes associated with freefatty acid absorption and a higher expression of genes related to non-free fatty acid absorption in rumen epithelial cellsof SUS cows.This results in free fatty acid accumulation and reduced ruminal pH in the SUS group，and increasedthe risk of SARA in these cows.Key words：dairy cows；subacute ruminal acidosis；tolerance；rumen epithelium我国是一个优质牧草资源十分匮乏的国家，奶牛生产中，为提高奶牛产奶量，养殖者常给奶牛饲喂高谷物日粮以提高产奶量。然而，奶牛摄入过多的易发酵碳水化合物易导致瘤胃微生物发酵速率加快，产生大量挥发性脂肪酸（volatile fatty acid，VFA），导致瘤胃内环境酸碱平衡被破坏，引起瘤胃 pH 急剧下降1，继而诱发亚急性瘤胃酸中毒（subacute ruminal acidosis，SARA）等瘤胃疾病2。研究发现，SARA 可引起瘤胃代谢紊乱，诱发皱胃移位、瘤胃炎、乳房炎及蹄叶炎等3-5，给奶牛养殖造成了巨大的经济损失。生产中发现，尽管通过营养配方调整、添加瘤胃缓冲剂或微生物制剂可降低 SARA 的发生率，但奶牛场中仍然存在一定程度 SARA 的发生率，这一现象显示，SARA 的发生除受日粮结构的影响外，还与其他因素有关。此外，近年来研究发现，即便在相同日粮条件下，奶牛发生 SARA 的严重程度也不一致6-8，造成营养配方调整方案实施困难，部分易感个体出现严重的酸中毒现象。这些结果说明，奶牛个体间对 SARA 的易感性存在差异，这种个体差异的存在可能是导致当前营养调控手段不能完全控制奶牛发生 SARA 的根本原因。因此，明确 SARA 耐受不同奶牛的瘤胃生理特征，有利于筛选 SARA 耐受性强的奶牛进行饲养，进而降低牛群患 SARA 的风险，减少蹄叶炎、真胃移位等营养代谢病的发生，从而推进奶牛分群饲养及健康养殖的发展。众所周知，SARA 的发生主要与瘤胃 pH 过低有关，而瘤胃 pH 主要受瘤胃内 VFA 生成和移除速率的影响9-10。因此，瘤胃内 VFA 生成和移除速率差异极有可能是造成 SARA 耐受性不同的关键因素。在瘤胃中，VFA 的移除主要通过瘤胃上皮对 VFA 吸收来实现，而瘤胃上皮对 VFA 的吸收主要与瘤胃上皮形态和功能有关。然而，目前关于不同 SARA易感奶牛的瘤胃上皮形态及其与 VFA吸收相关的功能基因表达差异的研究鲜有报道。由此，本研究拟在相同日粮条件下，以瘤胃 pH 为基准，筛选出对 SARA 耐受性不同的奶牛，结合伊红染色（hematoxylin-eosin staining，HE）切片及实时定量 PCR 等技术手段，比较研究两组奶牛瘤胃上皮组织形态及其功能基因表达差异，以揭示奶牛 SARA耐受性与其瘤胃上皮形态与功能基因表达的潜在关系。1材料与方法1.1试验设计及动物饲养管理本试验于 2019年 2月在江苏泰州天资牧业有限公司开展，选用 12头体重相近且装有永久性瘤胃瘘管的泌乳中期荷斯坦奶牛 23胎，泌乳天数为（11422）d，栓系饲喂，自由采食和饮水。试验期为 35 d，前 14 d为日粮适应期，后 21 d为试验期，奶牛试验期提供精粗比为 4 6的混合饲粮，饲粮配方及营养水平在张涛等11的研究中已详细描述。分别于每天 8：00和 19：00饲喂，剩料量控制在饲喂量的 5%10%，并于饲喂前挤奶。1.2样品采集在试验期第 20和 21天晨饲后的 0、2、4、6、8、12 h测定瘤胃 pH，并于 0、4、8、12 h测定瘤胃 VFA 浓度，随后基于瘤胃 pH 变化，将奶牛进行分组。在第 21天晨饲前，采集人员佩戴一次性灭菌长臂手套，通过瘤胃瘘管触及瘤胃腹囊乳头根部，用手指捏断瘤胃乳头根部，迅速放置培养皿中用冰磷酸盐缓冲溶液（phospate buffered saline，132第 32 卷第 2 期草业学报 2023 年PBS）清洗 3次后，挑选完整上皮乳头置于 4%多聚甲醛溶液中，并置于 4 C 保存，用于瘤胃上皮乳头组织形态学分析；取剩余部分乳头剪碎，于液氮中保存，用于 RNA提取。1.3样品测定1.3.1瘤胃上皮组织形态测定每头奶牛选取 3 个完整的瘤胃上皮乳头进行脱水、漂洗，并包埋于石蜡中。每个蜡块不连续切 5块厚 6 m 的组织，进行 HE 染色，最后封片。在 40倍物镜下对瘤胃上皮的各层厚度进行测量，每张切片选取 5个不同区域，每头动物共有 15个重复。瘤胃上皮各层厚度的测量具体步骤参照 Steele等12的研究方法。1.3.2瘤胃上皮乳头 RNA 提取及实时定量 PCR分析瘤胃上皮乳头 RNA 提取采用 TRIzol（Takara 生物，日本）方法，提取的 RNA 浓度使用 NanoDrop 1000 分光光度计（Nyxor Biotech，法国）测定。RNA 吸光值在 1.82.1，说明所提取的 RNA 纯度合格，之后用 1.4%的琼脂糖甲醛凝胶电泳验证 RNA 样品的完整性。RNA 经检测合格后，将每个样品的 RNA 浓度调整至 500 ng L-1，并使用反转录试剂盒（Takara 生物，日本）合成 cDNA。根据 GenBank上牛的核酸序列，应用 Primer 5.0（Whitehead Institute，美国）软件进行相应的定量引物设计。引物序列如表 1所示，所有引物由上海擎科生物科技有限公司合成。使用 ABI 7500定量 PCR仪（Thermo，新加坡）对目的基因及内参基因进行定量。反应程序如下：95 C 30 s预变性，95 C 5 s，60 C（目的基因）34 s，重复 40个循环。使用 20 L 反应体系，所有样品设 3个重复，目的基因相对表达量以甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH）作为内参进行校正，数据分析采用 2-Ct方法13。1.4数据处理采用 Excel（2019）初步整理数据后，采用 SPSS 26.0软件中单因素重复测量模型分析瘤胃 pH 数据，时间点作为重复。瘤胃上皮乳头组织形态学及其功能基因表达数据使用 SPSS 软件中独立样本 T 检验分析，P0.05表示差异显著。2结果与分析根据测得的瘤胃 pH，本试验将瘤胃 pH 平均值最高（pH=6.11，n=4）和最低（pH=5.76，n=4）的奶牛分为耐受组（tolerant，TOL）和易感组（susceptible，SUS），具体数据详见 Zhang等14的研究。2.1SARA易感与耐受奶牛瘤胃上皮形态比较HE 染色切片结果如图 1所示，测量结果显示，与 TOL 组奶牛比较，SUS 组奶牛的瘤胃上皮乳头的棘突层和基底层厚度（P=0.001）及总厚度（P=0.001）显著增厚，两组瘤胃上皮乳头的角质层（P=0.568）、颗粒层（P=0.360）厚度无显著性差异（表 2）。2.2SARA易感与耐受奶牛瘤胃上皮细胞中与 pH调节及氢离子转运相关的基因表达量比较为探究瘤胃上皮对 VFA 的吸收能力与 SARA 耐受性之间的潜在关系，本研究对 SARA 耐受性不同的奶牛瘤胃上皮细胞的 VFA 吸收相关基因表达量进行了定量分析。如图 2A 所示，SUS组奶牛瘤胃上皮细胞中参与瘤胃 pH 调节的 vH+ATPase和 Na+/K+ATPase基因及 Na+/H+交换蛋白 NHE1、NHE2和 NHE3表达量显著高于TOL 组（P0.01）。如图 2B 所示，与 TOL 组比较，SUS 组瘤胃上皮细胞与短链脂肪酸转运相关的蛋白基因PAT1、MCT4和 DRA的表达量显著下降（P0.01）。2.3SARA易感与耐受奶牛瘤胃上皮细胞中与 VFA转运及代谢相关的基因表达量比较瘤胃 VFA 经瘤胃上皮后，部分在瘤胃上皮细胞内代谢，为瘤胃上皮细胞提供能量。因此，本研究检测了瘤胃上皮细胞有关 VFA 代谢的相关基因表达量。结果如图 3A 显示，SUS 组丙酰基辅酶 A 羧化酶（Propionyl-CoAcarboxylase）和丙酮酸脱氢酶 1（PDHA1）的 mRNA 表达量显著高于 TOL 组，而乳酸脱氢酶 a（LDH a）的基因表达量显著降低（P0.01）。瘤胃上皮细胞中调控胆固醇及酮体合成的基因定量结果显示（图 3B），与 TOL 组比较，SUS组奶牛瘤胃上皮细胞中的 SREBP1和 SREBP2表达量显著升高（P0.05），而 HMGCL-2表达量显著下降（P0.01）。133Vol.32，No.2ACTA PRATACULTURAE SINICA（2023）2.4SARA易感与耐受奶牛瘤胃上皮细胞中与增殖和凋亡相关的基因表达量比较此前结果发现，两组奶牛瘤胃上皮厚度差异显著，暗示其瘤胃上皮细胞增殖和凋亡进程存在变化。因此，本研究对控制瘤胃上皮细胞增殖和凋亡的基因表达量进行定量，结果显示，SUS组 CDK2、CDK6和 Cyclin D1表达表 1瘤胃上皮细胞功能基因实时定量 PCR引物序列Table 1The primer sequences of rumen epithelium cell for qRT-PCR基因名称Gene name甘油醛-3-磷酸脱氢酶 GAPDH钠-氢离子交换蛋白1 NHE1钠-氢离子交换蛋白2 NHE2钠-氢离子交换蛋白3 NHE3氢离子ATP酶 vH+ATPase钠/钾离子ATP酶 Na+/K+ATPase钠/氢离子逆转运体 Na+/H+antiporterG蛋白偶联受体41 GPR41G蛋白偶联受体43 GPR43单羧酸转运蛋白1 MCT1氨基酸转运蛋白 1 PAT1腺瘤下调蛋白 DRA单羧酸转运蛋白4 MCT4阴离子交换蛋白2 AE2酰基辅酶A合成酶 Acyl-CoA synthetase丙酰基辅酶A羧化酶Propionyl-CoA carboxylase丁酰基辅酶A合成酶Butyrl-CoA synthetase乳酸脱氢酶a LDHa丙酮酸脱氢酶1 PDHA1三羟基三甲基辅酶A合成酶1HMGCS-1三羟基三甲基辅酶A合成酶2HMGCS-23羟甲基3甲基戊二酰辅酶A裂合酶HMGCL-2胆固醇调节元件结合蛋白1 SREBP1胆固醇调节元件结合蛋白2 SREBP23-羟基丁酸脱氢酶1 BDH1周期蛋白依赖性激酶2 CDK 2周期蛋白依赖性激酶4 CDK 4周期蛋白依赖性激酶6 CDK 6细胞周期蛋白E1 Cyclin E1细胞周期蛋白D1 Cyclin D1B淋巴细胞瘤-2基因相关启动子 BadB淋巴细胞瘤-2基因关联蛋白 BaxB淋巴细胞瘤-2基因 Bcl-2半胱氨酸蛋白酶3 Caspase-3半胱氨酸蛋白酶9 Caspase-9引物片段Primer sequence（5-3）F：TGCCGCCTGGAGAAACC；R：CGCCTGCTTCACCACCTTF：GAAAGACAAGCTCAACCGGTTT；R：GGAGCGCTCACCGGCTATF：TTGTGCGATGACCATGAATAAGT；R：TGATGGTCGTGTAGGATTTCTGAF：AGCCTTCGTGCTCCTGACA；R：TGACCCCTATGGCCCTGTACF：TTTTATTGAACAAGAAGCCAATGA；R：GATTCATCAAATTGGACATCTGAAF：CATCTTCCTCATCGGCATCA；R：ACGGTGGCCAGCAAACCF：GAAAGACAAGCTCAACCGGTTT；R：GGAGCGCTCACCGGCTATF：TTCCTCTCCTGCCTCTACACCATC；R：GCCGCTGCCAGGTTGATGAAGF：CCACAGACTGAACCAGACCA；R：CCAGGAACATCCCTAGTCCAF：CGCGGGATTCTTTGGATTT；R：GTCCATCAGCGTTTCAAACAGTACF：GGGCACTTCTTCGATGCTTCT；R：GTCGTGGACCGAGGCAAAF：TGCACAAAGGGCCAAGAAA；R：GCTGGCAACCAAGATGCTATGF：ATCTACGCGGGATTCTTTGGAT；R：AAGGTCCATCAGCGTTTCAAACF：AGCAGCAACAACCTGGAGT；R：GGTGAAACGGGAGACGAAF：CCGATCAGGTCCTGGTAGTGA；R：GCCTCCGCATGACTTTTCCF：AGAATGGAAGATGCCCTGGAT；R：CCTCTCGAAGCAATGCGATATF：ACCCTTTGACATTCAGATCATTGAT；R：CCAATGTTTCCTTCCGTGTTGF：CCAACCCAGTGGATATTCTCACA；R：TCACACGGTGCTTGGGTAATCF：CAGTTTGCTACTGCTGATCCTGAA；R：AGGTGGATCGTTGCAGTAAATGTF：AGGATACTCATCACTTGGCCAACT；R：CATGTTCCTTCGAAGAGGGAATF：CCT GCTGCAATCACTGTCATG；R：TCTGTCCCGCCACCTCTTCF：TGCAGATGGGAGTGAGTGTCA；R：GACGCCCCCTGTGCATAGF：CCAGCTGACAGCTCCATTGA；R：TGCGCGCCACAAGGAF：CTGGCTCCAGGGAGATGAC；R：GCTCTGCAGGTGTGGAAGACF：GACTGCCACCACTCCCTACAC；R：TCCGCAGCCACCAGTAGTAGTF：CTCACTGATCTTGTCTGGTT；R：TAAGCAACGACTAAGAGGAGF：ACTCTGGTATCGTGCTCCAGAAG；R：CAGAAGAGAGGCTTTCGACGAAF：TTCGTGGAAGTTCAGATGTC；R：TGCCTTGTTCATCAATGTCTF：TTGACAGGACTGTGAGAAGC；R：TTCAGTACAGGCAGTGGCGAF：GCACTTCCTCTCCAAGATGC；R：GTCAGGCGGTGATAGGAGAGF：GCAGGCCTTATGCAAAACGA；R：CTTTGGGTCAGACCTCAGTCTTCF：GCTGTGGACACAGACTCTC；R：CTGATCAACTGGGCACCTTF：AGGTTGGTAACCGGACCCTA；R：TTCCTGCCTGTCCTCGAATGF：CAGCGTCGTAGCTGAACGTAA；R：ATCGACAGGCCATGCCAGTATF：AGCAAATGGTCCAGGCTTTG；R：ATTCTCTCGACGGACACAGG基因登录号Gene IDNM_001034034NM_174833XM_604493AJ131764.1NM_001076798NM_001076798U49432NM_005304NP_001157256.1NM_001037319BC_123616NM_001083676.1NM_001109980NM_001205664.1BC114698.1BC123876BC109602BC142006NM_001101046AY581197NM_001045883NM_001075132NM_001113302.1XM_002687950.1NM_001034600NM_001014934NM_001037594NM_001192301XM_612960NM_001046273BC 103323.1NM_173894.1NM_001075417-2NM_001077840.1NM_001205504.1134第 32 卷第 2 期草业学报 2023 年量极显著高于 TOL组（P0.01，图 4A），且控制细胞凋亡的 Bad（P0.05）和 Caspase-9（P0.6，P0.05为筛选标准，以确定瘤胃发酵参数与上皮细胞差异表达基因的相关性。如图 5 所示，瘤胃 pH 与钠氢离子交换蛋白 NHE1 和图 1瘤胃上皮乳头光学显微镜图Fig.1Light micrograph of rumen epithelial papillae表 2SUS和 TOL组奶牛瘤胃上皮厚度变化Table 2The changes in rumen epithelial thickness between the SUS（susceptible）and TOL（tolerant）groups（m）项目Item角质层 Corneum颗粒层 Stratum棘突层和基底层 Spinous and basale总厚度 Total thickness均值 Mean易感组 SUS20.1915.23137.04172.46耐受组 TOL19.2414.4293.13126.79标准误差SEM1.640.8811.0612.60P 值P value0.5680.3600.0010.001SEM：Standard error.图 2瘤胃上皮细胞参与离子交换及 VFA吸收相关基因相对表达量Fig.2The relative expression levels of ion exchange and VFA absorption-related gene in rumen epithelial cells*P0.05，*P0.01.下同 The same below.135Vol.32，No.2ACTA PRATACULTURAE SINICA（2023）NHE2 表达量呈显著负相关（P0.6，P0.05。Red means positive correlation，blue means negative correlation.136第 32 卷第 2 期草业学报 2023 年3讨论长期饲喂高精料日粮可引起奶牛瘤胃内 VFA 浓度升高，使瘤胃 pH 长期处于较低水平，进而引发一系列营养代谢疾病如瘤胃炎等15-16。生产实践中发现，在饲喂相同高精料日粮条件下，奶牛个体间发生 SARA 的严重程度不一致8-17。本试验采用相同日粮饲喂，发现 12头奶牛的平均瘤胃 pH 出现明显的差异，部分奶牛的瘤胃平均pH 值明显要低于另一些奶牛，且部分奶牛的瘤胃 pH 值已达到 SARA 的标准，该结果与以往有关 SARA 易感性的研究结果一致18-19，表明奶牛个体间 SARA 耐受程度不同的现象普遍存在。前期研究结果表明，SUS 组奶牛的瘤胃 TVFA、丙酸、丁酸及戊酸浓度显著高于 TOL 组，并揭示了部分瘤胃微生物与 SARA 耐受性差异的潜在关联14，但瘤胃内 VFA 的积累不仅取决于微生物的发酵速率，同时与瘤胃上皮对 VFA 的吸收代谢息息相关。因此在该研究中，对两组奶牛瘤胃上皮形态及其对 VFA的吸收代谢进行了深入研究。瘤胃上皮乳头棘突层和基底层含有丰富的细胞器，是 VFA 吸收和代谢的主要场所20。本研究中，SUS组奶牛瘤胃上皮棘突层和基底层的厚度明显要比 TOL组奶牛厚，该结果表明，两组奶牛瘤胃上皮细胞对 VFA 的吸收代谢能力可能存在差异。由此，本试验进而研究了两组奶牛瘤胃上皮细胞调控 VFA 吸收与代谢相关基因的表达。众所周知，瘤胃对 VFA 的吸收机制主要包括被动扩散、阴离子交换及质子耦合等，其中脂溶性 VFA 可直接通过瘤胃壁之间的间隙进入血液，而大部分游离的脂肪酸通过阴离子交换及质子耦合途径吸收21-22。DRA 与PAT1是主要的 VFA-/H+交换载体，而 MCT4是 VFA-/H+共转运载体，对瘤胃内 VFA-吸收起关键作用21-23。SUS 组奶牛瘤胃上皮细胞中参与挥发性脂肪酸酸根离子吸收的 DRA、PAT1和 MCT4的相对表达量明显较低，表明其对瘤胃内游离脂肪酸酸根离子的吸收作用较弱。在瘤胃中，非游离态的 VFA 主要通过被动扩散进入瘤胃上皮细胞，并迅速解离成 VFA-和 H+，H+浓度的升高可引起细胞内 pH值下降，从而激活细胞膜上的 NHE家族基因，将 H+运输至细胞外以维持细胞内稳态24-25。SUS 组瘤胃上皮细胞中 NHE1、NHE2、NHE3 和 Na+/K+ATPase等基因表达量上调，表明其有利于胞内 H+外排，进而导致瘤胃中 pH 下降。关联分析结果也证实了这一推测，NHE 家族基因表达量与瘤胃 pH 呈显著负相关，而 DRA、PAT1和 MCT4基因则与瘤胃 pH 呈显著正相关。由此，以上的结果表明，两组奶牛的瘤胃上皮细胞对 VFA的吸收模式存在差异，主要表现在 SARA易感奶牛的瘤胃上皮对瘤胃中游离的脂肪酸酸根离子的吸收减缓，而对瘤胃内非游离 VFA的吸收增加。瘤胃内 VFA 被瘤胃上皮细胞吸收后，大部分 VFA 在瘤胃上皮细胞内被代谢，仅少部分直接进入血液，且VFA 的代谢速率会影响其吸收速率。本试验进一步探究了两组奶牛瘤胃上皮细胞中调控 VFA 代谢的相关基因表达差异。研究表明，瘤胃中 75%的丙酸和 95%的丁酸经瘤胃上皮细胞代谢26，其中丁酸主要由瘤胃上皮细胞中的酰基辅酶 A合成酶家族加入辅酶 A酯生成乙酰辅酶 A，最终合成酮体和胆固醇27-28。本研究发现，SUS组奶牛瘤胃上皮细胞中丙酸代谢途径中的 Propionyl-CoA carboxylase和 PDHA1 基因表达量明显较高，证明 SUS 组奶牛瘤胃上皮丙酸代谢更为活跃，且 SUS 组瘤胃内丙酸和丁酸浓度升高亦可促进瘤胃上皮代谢。然而，SUS 组的 SREBP1和 SREBP2表达量却高于 TOL 组，说明 SUS 组中 SREBP 通路被激活，但激活该通路的主要因子仍不清楚，需进一步研究。此外，本研究发现，SUS 组奶牛瘤胃上皮细胞中促进细胞增殖（CDK2，CDK6 和 CyclinD1）和凋亡（Bad，Caspase-9）的基因表达量明显较高，结果说明 SUS 组奶牛瘤胃上皮细胞周期进程加快，这也可能是导致这些奶牛瘤胃上皮层总厚度增加的原因之一。4结论综上所述，本研究表明，SUS组奶牛瘤胃上皮细胞调控游离脂肪酸吸收的 DRA、PAT1和 MCT4基因表达量下调，而调节非游离脂肪酸吸收的 NHE 家族基因表达量增加，结果导致奶牛瘤胃内游离脂肪酸的累积，瘤胃 pH下降，这也是不同奶牛对 SARA 耐受性存在个体差异的根本原因之一。此外，SUS 组奶牛瘤胃上皮细胞参与调控细胞增殖与凋亡的基因表达量显著增高，说明 SUS 组奶牛的瘤胃上皮细胞周期进程加快，导致瘤胃上皮层总厚度增厚。137Vol.32，No.2ACTA PRATACULTURAE SINICA（2023）参考文献 References：1 Wang H R.Mechanism analysis and nutritional strategies for prevention of sub-acute ruminal acidosis in ruminants.ChineseJournal of Animal Nutrition，2014，26（10）：3140-3148.王洪荣.反刍动物瘤胃酸中毒机制解析及其营养调控措施.动物营养学报，2014，26（10）：3140-3148.2 Oetzel G R.Diagnosis and management of subacute ruminal acidosis in dairy herds.Veterinary Clinics of North America：FoodAnimal Practice，2017，33（3）：463-480.3 Plaizier J C，Li S，Danscher A M，et al.Changes in microbiota in rumen digesta and feces due to a grain-based subacute ruminalacidosis（SARA）challenge.Microbial Ecology，2017，74（2）：485-495.4 Plaizier J C，Li S，Tun H M，et al.Nutritional models of experimentally-induced subacute ruminal acidosis（SARA）differ intheir impact on rumen and hindgut bacterial communities in dairy cows.Frontiers in Microbiology，2016，7：2128.5 Pourazad P，Khiaosa-Ard R，Qumar M，et al.Transient feeding of a concentrate-rich diet increases the severity of subacuteruminal acidosis in dairy cattle.Journal of Animal Science，2016，94（2）：726-738.6 Humer E，Ghareeb K，Harder H，et al.Peripartal changes in reticuloruminal pH and temperature in dairy cows differing in thesusceptibility to subacute rumen acidosis.Journal of Dairy Science，2015，98（12）：8788-8799.7 Jing L，Dewanckele L，Vlaeminck B，et al.Susceptibility of dairy cows to subacute ruminal acidosis is reflected in milk fatty acidproportions，with C18：1 trans-10 as primary and C15：0 and C18：1 trans-11 as secondary indicators.Journal of Dairy Science，2018，101（11）：9827-9840.8 Khiaosa-ard R，Pourazad P，Aditya S，et al.Factors related to variation in the susceptibility to subacute ruminal acidosis in earlylactating Simmental cows fed the same grain-rich diet.Animal Feed Science and Technology，2018，238：111-122.9 Yan L，Zhang B，Shen Z.Dietary modulation of the expression of genes involved in short-chain fatty acid absorption in the rumenepithelium is related to short-chain fatty acid concentration and pH in the rumen of goats.Journal of Dairy Science，2014，97（9）：5668-5675.10 Gao X，Oba M.Characteristics of dairy cows with a greater or lower risk of subacute ruminal acidosis：Volatile fatty acidabsorption，rumen digestion，and expression of genes in rumen epithelial cells.Journal of Dairy Science，2016，99（11）：8733-8745.11 Zhang T，Mu Y Y，Qi W P，et al.Analysis of plasma and milk fatty acid and metabolite composition in lactating dairy cowswith differing tolerance to