JJF 1527-2015聚合酶链反应分析仪校准规范-（高清版）.pdf

中华人民共和国国家计量技术规范J J F1 5 2 72 0 1 5聚合酶链反应分析仪校准规范C a l i b r a t i o nS p e c i f i c a t i o nf o rP o l y m e r a s eC h a i nR e a c t i o nA n a l y z e r s 2 0 1 5-0 6-1 5发布2 0 1 5-0 9-1 5实施国 家 质 量 监 督 检 验 检 疫 总 局 发 布聚合酶链反应分析仪校准规范C a l i b r a t i o nS p e c i f i c a t i o nf o rP o l y m e r a s eC h a i nR e a c t i o nA n a l y z e r sJ J F1 5 2 72 0 1 5 归 口 单 位:全国生物计量技术委员会 主要起草单位:中国计量科学研究院 参加起草单位:上海市计量测试技术研究院广东省计量科学研究院天津市计量监督检测科学研究院 本规范委托全国生物计量技术委员会负责解释J J F1 5 2 72 0 1 5本规范主要起草人:高运华(中国计量科学研究院)参加起草人:张丽萍(上海市计量测试技术研究院)尹 强(广东省计量科学研究院)田 昀(天津市计量监督检测科学研究院)保志娟(广东省计量科学研究院)吴建英(上海市计量测试技术研究院)J J F1 5 2 72 0 1 5目 录引言()1 范围(1)2 引用文件(1)3 术语(1)3.1 聚合酶链反应(1)3.2 聚合酶链反应分析仪(1)4 概述(1)5 计量特性(1)6 校准条件(2)6.1 校准设备及标准物质(2)7 校准项目和校准方法(2)7.1 校准条件(2)7.2 温度示值误差、温度均匀性校准(2)7.3 升降温速率校准(4)7.4 定量P C R仪样本示值误差、样本线性的校准(5)8 校准结果表达(6)9 复校时间间隔(6)附录A 标准物质的准备及配制(7)附录B P C R反应体系的配制(9)附录C 温度示值误差校准结果的不确定度评定模型(1 0)附录D 样本示值误差结果的不确定度评定模型(1 2)附录E 校准原始记录参考格式(1 4)附录F 校准证书(内页)参考格式(1 5)J J F1 5 2 72 0 1 5引 言本规范的编制基于聚合酶链反应分析仪主要技术参数实验测试,参考了J J F1 0 3 02 0 1 0 恒温槽校准规范、S N/T2 1 0 2.12 0 0 8/I S O2 2 1 7 4:2 0 0 5 食源性病原体P C R检测技术规范 第1部分:通用要求及定义、S N/T2 1 0 2.22 0 0 8/I S O2 0 8 3 6:2 0 0 5 食源性病原体P C R检测技术规范 第2部分:P C R性能试验要求、Y Y/T1 1 7 32 0 1 0 聚合酶链反应分析仪等文件。本规范为首次发布。J J F1 5 2 72 0 1 5聚合酶链反应分析仪校准规范1 范围本规范适用于模块加热的聚合酶链反应(P C R)分析仪计量性能的校准,对于其他类型的P C R仪,可参照本规范执行。2 引用文件本规范引用了下列文件:G B/T6 6 8 22 0 0 8 分析实验室用水国家标准YY/T1 1 7 32 0 1 0 聚合酶链反应分析仪凡是注日期的引用文件,仅注日期的版本适用于本规范;凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本规范。3 术语3.1 聚合酶链反应 p o l y m e r a s ec h a i nr e a c t i o n,P C RYY/T1 1 7 32 0 1 03.1一种对特定的D NA或R NA片段在体外进行快速扩增的方法,由变性退火延伸三个基本反应步骤构成。3.2 聚合酶链反应分析仪 p o l y m e r a s e c h a i nr e a c t i o na n a l y z e rY Y/T1 1 7 32 0 1 03.2基于P C R(聚合酶链反应)技术原理,模拟D NA或R NA的复制过程,在模板、引物、聚合酶等存在的条件下,特异扩增已知序列,对其进行检测分析的仪器设备。4 概述聚合酶链反应分析仪是基于P C R技术原理,模拟D NA或R NA的复制过程,在模板、引物、聚合酶等存在的条件下,特异扩增已知序列,对其进行检测分析的仪器设备,包括定性P C R仪和定量P C R仪两类。定性P C R通常由样品载台、热循环部件、控制部件和电源部件等部分组成。定量P C R仪主要由样品载台、热循环部件、控制部件、光学检测部件、电源部件、计算机及应用软件等部分组成。5 计量特性计量特性见表1。表1 聚合酶链反应分析仪计量特性项目定性P C R仪定量P C R仪温度示值误差+温度均匀度+平均升温速率+1J J F1 5 2 72 0 1 5表1(续)项目定性P C R仪定量P C R仪平均降温速率+样本示值误差-+样本线性-+注:+为校准项目;-为非校准项目。6 校准条件仪器使用允许的环境条件,测量过程中应测量和记录环境的温度、相对湿度。6.1 校准设备及标准物质6.1.1 温度校准装置由若干个(通常为1 5个)精密温度传感器、数据采集分析模块组成,测温范围(01 2 0),温度校准装置测量不确定度0.1,且需要通过计量检定。6.1.2 标准物质校准时应采用国内外有证标准物质,包括:质粒D NA标准物质、核糖核酸标准物质,其特性量值(拷贝数1 09c o p i e s/L,相对扩展不确定度5%)。6.1.3 电子天平精度0.0 1m g,且需要通过计量检定。6.1.4 移液器规格:2L、1 0L、1 0 0L、2 0 0L、10 0 0L,且需要通过计量检定。校准前按照附录A配制校准时使用的溶液。7 校准项目和校准方法7.1 校准条件校准前需将P C R仪开机预热3 0m i n。7.2 温度示值误差、温度均匀性校准7.2.1 将P C R仪及温度校准装置各部件连接完好,在温度传感器表面上涂抹适量的导热油,按图1所示将温度传感器置于P C R仪(9 6孔)加热模块设定孔中,其他型号的P C R仪可参照图1进行测试。2J J F1 5 2 72 0 1 5图1 温度传感器布点示意图7.2.2 参照送校单位提供的P C R仪说明书设定温度控制程序,如表2所示,不能设定3 0为温控程序起点的P C R仪,温控程序参照表2进行设定。表2 P C R仪温度控制程序标准程序表步骤设定温度点设定温度持续时间13 01m i n29 53m i n33 02m i n49 03m i n55 03m i n67 03m i n76 03m i n83 01m i n7.2.3 启动温度校准装置,记录整个数据采集过程并保存。7.2.4 温度示值误差校准结果按公式(1)和公式(2)计算:Td=Ts-Tc(1)Tc=1nni=1Ti(2)式中:Td 温控装置工作区域内温度示值误差,;Ts 温控装置工作区域内设定温度值,;Tc 所有测温传感器测量值的平均值,;Ti 第i个温度传感器测定值,。7.2.5 温度均匀度校准结果按公式(3)计算:Tu=Tm a x-Tm i n(3)3J J F1 5 2 72 0 1 5 式中:Tu 温度均匀度,;Tm a x 所有测温传感器测定值的最大值,;Tm i n 所有测温传感器测定值的最小值,。7.3 升降温速率校准7.3.1 参照送校单位提供的P C R仪说明书设定该P C R仪的温度控制程序,如表3所示。启动温度校准装置,记录整个数据采集过程并保存。表3 P C R仪温度控制程序标准程序表步骤设定温度点设定温度持续时间14 53m i n29 53m i n34 53m i n7.3.2 记录仪器显示温度达到设定温度恒温1 0s后,取5 0 温度点,温度记为TA,取9 0温度点,温度记为TB,从TA到达TB的时间记为t,按图2所示模式取点计算平均升温速率。图2 升降温速率计算模式按公式(4)计算平均升温速率:VUT=TB-TAt(4)式中:VUT 平均升温速率,/s;TA 5 0温度点测量值,;TB 9 0温度点测量值,;t 从TA到达TB的时间,s。7.3.3 平均降温速率校准结果按公式(5)计算:4J J F1 5 2 72 0 1 5取9 0温度点,温度记为TA,取5 0温度点,温度记为TB,从TA到达TB的时间记为t,按图2所示模式取点计算平均降温速率。按公式(5)计算平均降温速率:VD T=TB-TAt(5)式中:VD T 平均降温速率,/s;TA 5 0温度点测量值,;TB 9 0温度点测量值,;t 从TA到达TB的时间,s。7.4 定量P C R仪样本示值误差、样本线性的校准7.4.1 标准物质的配制标准物质配制方法见附录A。7.4.2 校准板的制备用经过计量校准的移液器,将配制好的P C R反应体系加入到反应板中,按图3所示准备9 6孔校准板,其他型号的仪器可参照本示例准备。P C R反应体系的配制方法见附录B。图3 P C R仪样本示值误差、样本线性误差和检测限校准用9 6孔反应板7.4.3 参照送校单位提供的P C R仪说明书设定该P C R仪的温度控制程序,如表4所示。5J J F1 5 2 72 0 1 5表4 定量P C R仪校准温度控制程序步骤设定温度点设定温度持续时间循环数15 02m i n129 51 0m i n139 53 0s46 01m i n4 57.4.4 分析参数的设置参照送校单位提供的P C R仪说明书设定P C R仪的数据分析参数。7.4.5 样本示值误差按公式(6)计算样本示值误差c=cc-cs(6)式中:c 样本示值误差,c o p i e s/L;cc 仪器测量平均值,c o p i e s/L;cs 标准物质标称值,c o p i e s/L。7.4.6 样本线性以系列稀释的标准物质(至少5个)扩增C t值与浓度对数值进行线性回归,计算其线性回归系数r。8 校准结果表达经校准后的聚合酶链反应分析仪应填发校准证书,校准证书应符合J J F1 0 7 12 0 1 0中5.1 2的要求,参照附录F给出校准项目名称、测量值以及扩展不确定度。9 复校时间间隔根据实际使用情况,用户可自行确定仪器复校时间间隔,建议不超过1年。6J J F1 5 2 72 0 1 5附录A标准物质的准备及配制1.试剂质粒D NA标准物质或核糖核酸标准物质其特性量值(拷贝数1 09c o p i e s/L,相对扩展不确定度5%)满足校准需求,水为符合G B/T6 6 8 22 0 0 8规定的一级水。2.仪器电子天平,精度0.0 1m g;移液器,规格:1 0 0L、10 0 0L,且需要通过计量检定。3.标准物质系列稀释配制将标准物质从-2 0冰箱中取出,置冰上溶解,然后室温平衡3 0m i n。用经过高温高压灭菌处理的纯水进行稀释配制,并定为阴性对照样本。用电子天平配制系列稀释样品,其中S0为浓度为11 09c o p i e s/L的标准物质,S1、S2、S3、S4、S5、S6、S7为S0系列稀释后的样品,每步样品配制后要充分震荡混匀,详细配制方法见表A.1。表A.1 标准物质系列稀释配制m g项目S0S1S2S3S4S5S6S7H2O终浓度(c o p i e s/L)S11 0 09 0 011 08S21 0 09 0 011 07S31 0 09 0 011 06S41 0 09 0 011 05S51 0 09 0 011 04S61 0 09 0 011 03S71 0 09 0 011 02 4.未知样品的配制以配制好的S3为起点,用经过校准的天平(0.0 1m g)配制未知样品1(U1)和未知样品2(U2),样品配制后要充分震荡混匀,详细配制方法见表A.2。7J J F1 5 2 72 0 1 5表A.2 未知样品的配制m g项目S3U1H2O终浓度(c o p i e s/L)U15 0 05 0 05.01 05U23 5 03 5 02.51 058J J F1 5 2 72 0 1 5附录BP C R反应体系的配制1.试剂d d H2O、1 0P C Rb u f f e r、2 5mm o l/LM g C l2、d N T P s、1 0m o l/LP r o b e、1 0m o l/LP r i m e r1、1 0m o l/LP r i m e r2、5U/LT a qe n z y m e、D NA。2.仪器移液器。规格:2L、1 0L、1 0 0L、2 0 0L、10 0 0L,且需要通过计量检定。3.P C R反应体系的配制参照表B.1进行P C R反应体系溶液的配制。表B.1 P C R反应体系的配制试剂终浓度体积d d H2O2 0.6L1 0P C Rb u f f e r15L2 5mm o l/LM g C l22.5mm o l/L5Ld NT P s0.2mm o l/L4L1 0m o l/LP r o b e0.2m o l/L1L1 0m o l/LP r i m e r10.4m o l/L2.0L1 0m o l/LP r i m e r20.4m o l/L2.0L5U/LT a qe n z y m e0.0 4U/L0.4LD NA1 0.0Lt o t a l5 0L 注:1 如果M g2+、d NT P s和T a qe n z y m e已经在1 0P C Rb u f f e r中,不需再加,如果使用2P C Rb u f f e r,调整加样体积使终浓度合适。2 d d H2O为灭菌双蒸水,P r o b e为荧光标记探针,P r i m e r为引物,T a qe n z y m e为热启动酶,b u f f e r为缓冲溶液,d NT P s为四种脱氧核糖核苷-磷酸混合物。9J J F1 5 2 72 0 1 5附录C温度示值误差校准结果的不确定度评定模型C.1 测量模型Td=Ts-Tc 式中:Td 温控装置工作区域内温度示值误差,;Ts 温控装置工作区域内设定温度值,;Tc 所有测温传感器测量值的平均值,。C.2 不确定度来源(1)测量重复性引入的不确定度。(2)标准温度传感器引入的不确定度。C.3 不确定度分量的计算(1)重复性引入的不确定度u1(Ti)在各个温度测量时间段内,读取1 5个测温探头的数据,见表C.1,计算其标准偏差s。表C.1 重复性引入不确定度数据项目1234567891 01 11 21 31 41 5S D3 0 3 0.5 73 0.5 33 0.5 03 0.6 93 0.0 83 0.5 63 0.6 53 0.0 53 0.6 83 0.6 93 0.1 53 0.6 93 0.7 93 0.5 73 0.8 0 0.35 0 4 9.9 84 9.9 94 9.9 05 0.0 64 9.7 85 0.0 25 0.2 04 9.8 95 0.2 05 0.3 75 0.0 35 0.3 05 0.4 55 0.3 45 0.3 2 0.26 0 5 9.5 85 9.7 05 9.5 35 9.6 75 9.6 95 9.6 45 9.8 85 9.9 05 9.8 96 0.1 46 0.0 86 0.0 06 0.1 36 0.1 85 9.9 7 0.37 0 6 9.1 66 9.4 66 9.2 16 9.3 06 9.6 96 9.3 86 9.6 26 9.9 36 9.6 36 9.9 57 0.1 76 9.7 56 9.9 67 0.1 36 9.6 3 0.49 0 8 8.6 98 9.2 38 8.8 78 8.9 18 9.8 38 9.0 48 9.3 49 0.1 78 9.3 88 9.7 89 0.4 28 9.3 98 9.6 39 0.0 78 9.1 3 0.69 5 9 3.4 99 4.1 79 3.8 09 3.8 39 4.9 59 4.0 49 4.3 09 5.2 89 4.3 19 4.8 19 5.5 79 4.2 99 4.5 79 5.0 59 3.8 7 0.6 根据测量结果计算,u1(Ti)=ni=1(Ti-T)2/n-1 (2)标准温度传感器引入的不确定度标准温度传感器校准不确定度由标准温度传感器校准证书得到。u2(Ts)=uc/k=0.0 9 0/2=0.0 4 5C.4 标准不确定度一览表标准不确定度一览表见表C.2。01J J F1 5 2 72 0 1 5表C.2 标准不确定度一览表项目来源u1(Ti)/u2(Ts)/3 00.30.0 4 55 00.20.0 4 56 00.30.0 4 57 00.40.0 4 59 00.60.0 4 59 50.60.0 4 5C.5 合成不确定度合成不确定度用公式u()=u12(Ti)+u22(Ts)计算得到,结果见表C.3。C.6 扩展不确定度取k=2,则仪器示值误差的扩展不确定度用U=2u()计算,结果见表C.3。表C.3 合成和扩展不确定度结果项目合成不确定度u()/扩展不确定度U/包含因子k3 00.2 50.525 00.2 10.526 00.2 20.527 00.3 20.729 00.5 11.129 50.6 01.2211J J F1 5 2 72 0 1 5附录D样本示值误差结果的不确定度评定模型D.1 测量模型C=Cc-Cs 式中:C 样本示值误差,c o p i e s/L;Cc 仪器测量平均值,c o p i e s/L;Cs 标准物质标称值,c o p i e s/L。D.2 不确定度来源(1)测量重复性引入的不确定度。(2)标准物质引入的不确定度。D.3 不确定度分量的计算(1)重复性引入的不确定度u1(Ci)计算未知样1和未知样2的定量结果的相对标准偏差R S D,测量数据及计算结果见表D.1。表D.1 定量重复性引入的不确定度(1 05c o p i e s/L)项目12345678R S DU15.15.34.85.25.14.75.15.25.24.74.95.15.45.15.35.24.84.95.25.35.24.95.54.94.3%U22.42.32.52.42.52.62.32.32.52.42.62.42.32.42.52.72.42.52.52.42.62.42.52.54.4%u1(Ci)=ni=1(Ci-C)2/n-1 (2)标准物质引入的不确定度由标准物质证书得到。u2(Cs)=uc/k=4.3%/2=2.2%,k=2。D.4 相对标准不确定度一览表相对标准不确定度一览表见表D.2。表D.2 相对标准不确定度一览表项目来源u1(Ci)u2(Cs)U14.3%2.2%U24.4%2.2%21J J F1 5 2 72 0 1 5D.5 合成相对标准不确定度合成相对标准不确定度用公式u(C)=u12(Ci+u22(Cs)计算得到,结果见表D.3。D.6 扩展标准不确定度扩展不确定度用公式U=2u()Ci计算得到,结果见表D.3。表D.3 合成和扩展不确定度结果项目Cic o p i e s/L合成不确定度u(C)扩展不确定度Uc o p i e s/L包含因子kU15.11 054.9%5.01 042U22.41 055.0%3.01 04231J J F1 5 2 72 0 1 5附录E校准原始记录参考格式送检单位:校准日期:年 月 日仪器名称:制 造 厂:型 号:出厂编号:证书编号:环境温度:相对湿度:%气压:k P a1.温度示值误差和温度均匀度设定温度A1A4A7A1 0A1 2D1D7D1 2E4E1 0H1H4H7H1 0H1 23 0.05 0.06 0.07 0.09 0.09 5.02.平均升温速率 TA=,TB=,t=s。3.平均降温速率 TA=,TB=,t=s。4.样本示值误差项目测量值c o p i e s/LU1U25.样本线性校 准 员:核 验 员:41J J F1 5 2 72 0 1 5附录F校准证书(内页)参考格式1.温度示值误差设定温度TcTd不确定度(k=2)3 0.05 0.06 0.07 0.09 0.09 5.02.温度均匀度设定温度/极差/3 0.05 0.06 0.07 0.09 0.09 5.03.平均升温速率4.平均降温速率5.样本示值误差项目标准值c o p i e s/L测量值c o p i e s/L示值误差c o p i e s/L不确定度c o p i e s/L(k=2)U1U26.样本线性校 准 员:核 验 员:51J J F1 5 2 72 0 1 5