一个听神经病家系的AIFM1基因致病性新突变_徐晨宇.pdf

一个听神经病家系的 AIFM1 基因致病性新突变徐晨宇高玲丽唐晓敏孙宇轩潘春晨孙敬武基金项目:国家自然科学基金青年项目(编号:81800911)作者单位:230001安徽合肥安徽医科大学附属省立医院耳鼻咽喉头颈外科(徐晨宇，孙敬武)230001安徽合肥中国科学技术大学附属第一医院耳鼻咽喉头颈外科(高玲丽，唐晓敏，孙宇轩，潘春晨)通信作者:孙敬武，entsun ustc edu cn 摘要 目的探讨一个听神经病(AN)家系的致病基因突变和可能分子机制。方法收集 2020 年 10 月中国科学技术大学附属第一医院耳鼻咽喉头颈外科收治的 1 个三代 12 人的 AN 家系，采集其病史，绘制系谱图，行听力学、影像学及体格检查;利用高通量测序筛选致病基因;采用 Sanger 测序对致病基因位点进行变异确认及家系共分离验证;通过实时荧光定量聚合酶链反应(qT PC)对致病基因进行验证。结果该家系中的父亲(:1)及两个女儿(:4，:5)为耳聋患者，表现为言语识别率差，与纯音听阈不符，听力学检查符合 AN 特殊表现;高通量测序结果显示致病基因为 AIFM1:C 250 4G A 位点剪接突变;Sanger 测序结果显示致病基因突变位点与该家系的 AN 表型完全符合共分离;qT PC 结果显示患者 AIFM1 mNA 表达显著上调;该家系的遗传方式可能为 X 连锁显性遗传。结论本研究检测出听神经病 AIFM1 基因新的剪接突变，其遗传模式可能为 X 连锁显性遗传。关键词 听神经病;AIFM1 基因;剪接突变;高通量测序;X 连锁显性遗传doi:10.3969/j.issn.1000 0399.2023.03.009听神经病(auditory neuropathy，AN)是一种以外毛细胞功能正常，听觉通路的神经传导异常为特征的听力障碍，表现为耳声发射(otoacoustic emissions，OAE)或耳蜗微音器电位(cochlear microphonics，CM)可引出，听觉脑干反应(auditory brainstem responses，AB)缺失或严重异常1 2。此病主要影响患者的言语识别能力，是婴幼儿及青少年听力言语交流障碍的常见疾病之一3 4。AN 病因复杂，主要包括遗传因素与环境因素5，以遗传因素为主5 7，目前已经发现的 AN 致病基因有 OTOF、OPA1、DIAPH38。近期文献9 报道了一个 X 连锁进行性 AN 的中国家系，应用全外显子测序技术确定其致病基因为 AIFM1。AN 发病机制尚不清楚，漏诊及误诊率高。本研究证实一个 AN 家系患者中存在 AIFM1 新的剪接突变位点，现报道如下。1资料与方法1 1一般资料本研究家系资料的调查于2020 年10月在中国科学技术大学附属第一医院耳鼻咽喉头颈外科完成。此家系成员均来自于安徽省，汉族，先证者为一名 36 岁的女性，以听力下降伴交流障碍为主诉于2020 年就诊于我科门诊，为行人工耳蜗植入术入住我院。先证者所在家系包括三代 12 名成员(图 1)，追问病史发现该家系除先证者外，其他家系成员中也有出现进行性听力下降伴言语识别障碍症状者。征得患者本人及家属同意后，将该家系成员纳入本研究。纳入标准:纯音测听显示不同程度的感音神经性耳聋;AB反应波严重异常或引不出，OAE 或 CM 可引出。排除标准:排除听神经瘤等蜗后占位性病变10。图 1一个家系 12 名 AN 病患者家系图谱1 2方法由耳鼻喉科专科医生对全部 12 名 AN 家系成员进行详细病史采集:被采集人员的基本信息、主诉、现病史、既往史、出生史及新生儿期高危因素、其他系统情况、耳聋家族遗传史等。对于无法正常交流的患者及儿童由家属代诉。同时对家系成员进行了系统的全身体格检查(未见明显异常)，排除综合征性性耳聋。耳科检查重点关注有无耳廓畸形、外耳道闭锁、有无耳前瘘管，鼓膜穿孔以及鼻、咽、喉的发育状况。听982第 44 卷第 3 期安徽医学2023 年 3 月Anhui Medical Journal力学检查内容:纯音测听(pure tone audiometry，PTA)、畸变产物耳声发射(distortion product otoacousticemission，DPOAE)、AB。影像学检查包括高分辨率CT(high esolution CT，HCT)，以排除内耳畸形、内听道占位性病变等。1 3基因位点筛查对该 AN 家系进行常见致聋基因位点检测，确定有无突变基因。如果未发现常见基因位点突变，则进行下一步试验继续寻找致病基因。利用 9 项遗传性耳聋基因芯片(4 个耳聋基因 9 个突变位点 GJB2(35delG、176 _191del16、235delC、299 _300delAT)，GJB3(538C T)，线粒体 12SrNA(1494C T、1555A G)，SLC26A4(2168A G、IVS7 2A G)对该家系先证者及家系成员进行筛查。1 4耳聋基因靶向测序采用 Covaris S220 超声波打断仪将基因组 DNA 随机打断成约 150 bp 左右的片段。进行末端补平修复、片段两端加 A 尾，用连接酶在 DNA 片段的两端加上 Illumina 测序专用的接头(a-dapter)，连接的产物经过扩增、片段选择和纯化，构建DNA 测序文库。按照 Illumina 标准建库方法行 3 步酶促反应形成样本文库。文库质量检测，上机测序。1 5变异确认及家系共分离验证结果利用 Sanger测序验证经耳聋基因靶向测序得到的候选基因，进行家系共分离验证，排除其他候选基因，最终锁定致病基因 AIFM1 基因。针对检出的致病基因 AIFM1 突变位点设计验证引物。使用贝克曼自动化工作站预设程序配置 PC 扩增反应体系，并按如下步骤运行程序:96 90 s;96 15 s，50 6 s，60 210 s，28 个循环;4 Holds。PC 产物使用 3130XL 测序仪进行毛细管电泳测序并在 ABI 3130 Genetic Analyzer(Applied Bio-systems)上进行分析，再在家系成员中进行共分离验证。1 6实时荧光定量聚合酶链反应(quantitative real time polymerase chain reaction，qT PC)用 NAisoPlus 试剂盒(日本 Takara)提取全部 12 名患者血液样本中的总 NA。接着用 everTra Plus TM(Toyo-ta obo，日本)将1 mg NA 反向转录成 cDNA。所用引物如表 1 所示。用 SYB PreMix Ex Taq(Takara)扩增并用 oche Light Cycler 480 实时聚合酶链式反应系统检测。扩增步骤为:9530 s，955 s，6010 s，7215 s，共 40 个循环，用 2 CT 方法计算相对基因表达。表 1qT PC 所用引物GeneSequences(53)AIFM1F:GTGGTCGTGGGGATTGTGCTATG:TCATGCTGCTCACCGTCCTTAATGCJB2F:GGTGGACCTACACAAGCAGCATC:GGAGAAGCCGTCGTACATGACATAGSLC26A4F;TCGCTGTGGTGGCTTATGCTATTG:AGAAGATGTTGCTGATCCCAAAGGCF:forward:reverse2结果2 1系谱图及遗传特征先证者，女，36 岁，以听力下降伴交流障碍为主诉就诊，该患者家族中其父亲与妹妹有相似病史。该家系为一个三代 12 人的核心家系，父亲及两个女儿为患者，母亲及其他家庭成员表型正常。全部家系成员体格检查及颞骨影像学检查均未发现异常。该家系的遗传特征表现为父亲及女儿发病，其他家庭成员正常。由于发病代数少，且男女均有发病，故无法明确该家系的遗传方式。因此，该家系符合以下遗传方式:常染色显性遗传模式(父亲携带常染色体上的致病基因)或者 X 连锁显性遗传模式(父亲携带 X 染色体上的致病基因)。2 2家系的临床表型特征该家系成员均为安徽人，汉族，先证者(:4)主诉 13 岁开始出现听力下降和语言识别能力下降，导致无法正常进行语言交流，影响日常生活。该家系中除了先证者之外，其父亲(:1)与妹妹(:5)与其症状相似，父亲在 23 岁开始出现听力下降伴交流困难，妹妹在 20 岁开始出现听力下降伴交流困难。全部 12 名家系成员既往无耳流脓或外伤史，无耳鸣、眩晕或走路不稳史，无明显的耳毒性药物接触史，无长期噪声接触史，全身及专科检查无其他器官系统疾病。3 名患者的双耳听力重度下降，低频听力下降较为严重，听力曲线呈上升型。(图 2A);3名患者在 90dB 声刺激下，听性脑干反应未引出(图2B);3 名患者的双侧 DPOAE 均可正常引出(图2C);3名患者未见内耳畸形及内听道占位(图 2D)。092徐晨宇等:一个听神经病家系的 AIFM1 基因致病性新突变第 44 卷第 3 期2023 年 3 月注:A 为3 名AN 患者PTA 结果;B 为3 名AN 患者AB 结果;C 为3 名 AN 患者 DPOAE 结果;D 为3 名 AN 患者 HCT 结果。图 2AN 患者听力学及影像学检查结果2 3常见耳聋基因位点筛查结果本研究家系全部12 名成员药物敏感性耳聋相关基因 12SrNA、先天性重度或极重度感音神经性耳聋相关基因 GJB2、后天性高频感音神经性耳聋(SNHL)相关基因 GJB3、大前庭水管综合症相关基因 SLC26A4 均正常;耳聋基因线粒体 mtDNA(1494C T、1555A G)、GJB2(35del G、299delAT、235delC、176del16、538C T)、GJB3(538C T)、SLC(2168A G、IVS7 2A G)均为野生型。2 4全外显子测序结果对先证者及其父母进行全外显子测序，发现先证者及其父亲携带 AIFM1 基因 c250 4G A 杂合突变，为剪接突变，变异来源于父亲。见表 2。该位点位于第 3 号外显子起始部位前 4位碱基，可导致 3 号外显子不能转录。HGMD 数据库中无该位点的记录。根据 ACMG 指南11 进行致病性分析，该剪切位点的变异为临床意义未明的变异，提示可能为潜在的致病变异。随后对其他家系成员进行该位点验证，发现其患病妹妹同样携带该基因位点突变，而家系中正常家庭成员并未发现该基因位点突变，临床表型符合家系共分离现象。表 2高通量测序结果分析基因位置转录本外显子核苷酸氨基酸变异类型正常人频率预测致病性分析AIFM1chrX:129283547 NM_004208Exon3c 250 4G A splicingunkonw0 0008659Uncertain2 5变异确认及家系共分离验证结果利用 Sanger测序法进行位点验证，发现该变异位点与该家系的 AN表型完全符合共分离:父亲及两个女儿均为患者，并且均携带先证者所发现的杂合剪切突变 AIFM1:c 250 4G A，母亲及其他家庭成员表型正常，未发现携带该变异。见图 3。注:A 为 AN 患者(图 1:4)c 250 4G A 突变图谱;B为 AN 患者(图 1:5)c 250 4G A 突变图谱;C 为 AN 患者(图 1:1)c 250 4G A 突变图谱;D 为其他正常家系成员sanger 测序图谱。图 3家系成员的 AIFM1 基因 sanger 测序图2 6qT PC 结果该家系 AN 患者不同基因 m-NA 表达如图 4 所示。这些结果提示 AN 患者 AIFM1的表达增加(P 0 001)，而 SLC26A4(P=0 083)和GJB2(P=0 182)的表达在正常人和 AN 患者之间无明显差异。注:A 为 AIFM1 基因表达;B 为 SLC26A4 基因表达;C 为GJB2 基因表达;normal 为正常人，AN 为听神经病患者;与正常人比较，P 0 001。图 4家系成员的 AN 相关基因 mNA 表达结果比较3讨论AN 主要表现为言语分辨率与纯音听阈不成比例的下降12，且听力下降以低频听力为主，AB 引不出或严重异常，OAE 能够引出，影像学检查未见明显异常13。AN 患者因其临床表现特殊，误诊漏诊率极高。本研究中的 3 名耳聋患者均出现了进行性听力下降，且言语识别率下降。言语识别主要是听觉中枢的功能，对主诉“听得到声音但听不懂意思”的患者行言语识别率检查，有助于 AN 的诊断，言语识别障碍是 AN192第 44 卷第 3 期安徽医学2023 年 3 月Anhui Medical Journal的显著特征14 15。AN 主要影响低频听力16，这是由于听觉传入神经放电在低频声刺激时相对集中于某一特定时相，而毛细胞的神经递质释放在高频声刺激时不再受感受器电位的控制，而神经纤维动作电位期又使其失去了锁相的特性 17。汪吉宝等 18 测试了 106 例 AN 患者的纯音听力，结果表明，听力损失最多的频率为 0 25 kHZ 和0 5 kHZ，共 173 耳(81 8%);汪锦玲等19 发现在 254例 AN 患者中，76 3%的患者纯音测听呈低频听力下降;Jafari 等20 研究发现，成人 AN 中有超过 60%的人为低频听力下降。本研究对 3 名患者进行纯音测听检查，纯音测听的结果均表现为低频听力下降，听力图呈上升型，符合 AN 特征。AB 引不出或严重异常是 AN 另一个重要的特征。听神经的去同步性放电可能是 AN 患者 AB 异常的原因。听神经的放电失同步化与神经的脱髓鞘病变有关，在有髓鞘的哺乳动物神经中，产生动作电位的离子活动仅限于郎飞(anvier)，结膜中富含能产生动作点位的 Na+通道，而结间膜中 Na+通道很少，而 K+通道多。因此，促进有髓神经动作电位产生的 Na+电流并不是沿着神经持续产生的，而是仅限于 anvier。将动作电位限制在 anvier 上，能够增加有髓神经的传导速度。当神经发生脱髓鞘病变，则神经冲动传导的速度就会降低。如果轴突中的脱髓鞘区的长度不同，相邻轴突之间放电的同步程度就会受到影响。还有研究21 表明，内毛细胞与听神经之间的突触传递障碍也与 AN 的发生有关。本研究中的 3 名听神经病患者AB 检查未见明显分化波形。AN 主要为内毛细胞、内毛神经纤维及突触的异常，外毛细胞通常是正常的，因此 DPOAE 大多表现正常22。薛飞等23 对 70 例 AN 患者(140 耳)和 30 例正常人(60 耳)进行了 DPOAE 测试，结果显示，和正常人一样，AN 患者的 DPOAE 全部可以引出，与本研究结果一致。本研究通过全外显子测序找到了该家系致病基因的突变位点 AIFM1:C 250 4G A(splicing)，并通过Sanger 测序验证了突变位点，其符合家系共分离现象。最后，采用 qT PC 对 AIFM1 基因突变进行了进一步的验证，结果显示与正常人相比，该家系的 AN 患者AIFM1 表达明显增加(P 0 05)。AIFM1 基因是一种位于线粒体膜间间隙的黄素蛋白，它位于人类染色体 X(Xq25 Xq26)24。本研究在中国 AN 人群中检测到 AIFM1:c 250 4G A(splicing)突变，该基因位点突变是一个剪接突变，这也是首个 AIFM1:c 250 4G A 剪接突变引起 AN 的家系。此外，本研究发现先证者父亲为半杂合变异，先证者及其妹妹为杂合变异，检测出的 AIFM1 突变为杂合突变，而 AIFM1 基因位于 X 染色体上，结合家系图，可以排除常染色体显性遗传，确定该家系的遗传模式为X 连锁显性遗传。这表明 AIFM1 基因突变引起的听神经病存在 X 连锁显性遗传模式，这在之前未被大家引起重视，同时也提醒临床医师应进一步关注，注意女性携带突变的情况。综上所述，本研究检测出一个三代 12 人家系的AN AIFM1 基因新的剪接突变，其遗传模式可能为 X 连锁显性遗传。参考文献 1 STA A，PICTION T W，SININGE Y，et al Auditoryneuropathy J Brain，1996，119(Pt 3):741 753 2 MOSE T，STA A Auditory neuropathy neural and syn-aptic mechanisms J Nat ev Neurol，2016，12(3):135 149 3SHEAE A E，HANSEN M Auditory synaptopathy，auditory neuropathy，and cochlear implantationJ Laryn-goscope Investig Otolaryngol，2019，4(4):429 440 4 党炯，郭玉芬，徐百成 听神经病的研究进展 J 中华耳科学杂志，2021，19(3):490 495 5ZENG F G，KONG Y Y，MICHALEWSKI H J，et al Per-ceptual consequences of disrupted auditory nerve activity J J Neurophysiol，2005，93(6):3050 3063 6ANCE G，STA A Pathophysiological mechanisms andfunctional hearing consequences of auditory neuropathy J Brain，2015，138(Pt 11):3141 3158 7 MANCHAIAH V K，ZHAO F，DANESH A A，et al Thegenetic basisofauditoryneuropathyspectrumdisorder(ANSD)J Int J Pediatr Otorhinolaryngol，2011，75(2):151 158 8 徐彬，付勇 听神经病相关基因的研究进展 J 中华耳科学杂志，2020，18(4):774 777 9 ZONG L，GUAN J，EALY M，et al Mutations in apoptosis inducing factor cause X linked recessive auditory neuropathyspectrum disorder J J Med Genet，2015，52(8):523 531 10 中国听神经病临床诊断与干预多中心研究协作组，中华耳鼻咽喉头颈外科杂志编辑委员会，中华医学会耳鼻咽喉头颈外科学分会，等 中国听神经病临床实践指南(2022 版)J 中华耳鼻咽喉头颈外科杂志，2022，57(3):241 262 11 王秋菊，沈亦平，陈少科，等 遗传变异分类标准与指南 J 中国科学(生命科学)，2017，47(6):668 688292徐晨宇等:一个听神经病家系的 AIFM1 基因致病性新突变第 44 卷第 3 期2023 年 3 月3 种血管通路在老年维持性血液透析患者中的应用效果比较翟蕾段淑敏韩玲玉杨铭霞基金项目:河南省医学科技攻关计划项目(编号:LHGJ20190502)，开封市科技发展计划(编号:2204010)作者单位:475000河南开封河南大学第一附属医院重点部门管理中心(翟蕾)，护理部(段淑敏、韩玲玉)，心血管内科(杨铭霞)通信作者:杨铭霞，zhailei126 yeah net。摘要 目的比较自体动静脉内瘘(AVF)、人造血管内瘘(AVG)和中心静脉导管(CVC)3 种血管通路在老年维持性血液透析(MHD)患者中的应用效果，为老年 MHD 患者血管通路的选择提供依据。方法前瞻性收集 2017 年 1 月至 2019 年 6 月在河南大学第一附属医院内分泌科行 MHD 的老年患者127 例，根据采用的血管通路方式不同将患者分为 AVF 组62 例、AVG 组25 例和 CVC 组40 例。比较3 组患者持续透析1 年后的透析效能(尿素氮下降率、尿素氮清除率、血管通路血流量)、心脏结构 左心室舒张末期内径(LVDd)、左心室后壁舒张末期厚度(LVPWT)、室间隔舒张末期厚度(IVSTd)、心功能(左心室肥厚、左心室收缩功能障碍、左心室舒张功能障碍)、并发症(感染、血流不畅、血栓栓塞、肌肉痉挛、心衰)以及贫血相关指标差异。结果AVF 组的尿素氮下降率、清除率、血管通路血流量、血红蛋白、血清白蛋白、血清铁蛋白、转铁蛋白饱和度以及 LVDd、LVPWT 和 IVSTd 值均明显高于CVC 组(t=2 512、2 366、2 582、2 644、2 723、3 113、2 603、2 833、3 559、2 932，P 均 0 05)。AVF 组的左心室肥厚、左心室收缩功能障碍发生率均明显高于 CVC 组(P 0 05)，AVF 组总体并发症发生率明显低于 AVG 和 CVC 组(P 0 05)。结论AVF 对老年 MHD 患者的透析效果及安全性均优于 AVG 和 CVC，但其对患者心功能影响程度高于 AVG 和 CVC。关键词 自体动静脉内瘘;人造血管内瘘;中心静脉导管;维持性血液透析;并发症doi:10.3969/j.issn.1000 0399.2023.03.010维持性血液透析(maintenance hemodialysis，MHD)是终末期肾衰竭患者常用的透析方式，功能良好的血管通路是 MHD 患者接受充分性透析的关键1。目前，临床常用的血液透析循环通路主要包括自体动静脉内瘘(arteriovenous fistula，AVF)、人造血管内瘘(ar-teriovenous grafts，AVG)和中心静脉导管(central ve-nous catheter，CVC)3 种类型2 3。其中，AVF 是目前临床首选的透析方式，具有血流量充分、并发症少及使 12 ANCE G，STA A Pathophysiological mechanisms andfunctional hearing consequences of auditory neuropathy J Brain，2015138(Pt 11):3141 3158 13 王秋菊，ANOLD S 听神经病:从发现到渐入精准J 中华耳鼻咽喉头颈外科杂志，2018，53(3):161 171 14 冀飞，吴南 听神经病的诊断和干预 J 中国听力语言康复科学杂志，2017，15(1):61 66 15 冀飞，陈艾婷，赵阳，等 听神经病患者的单音节识别率与言语声强的函数关系分析 J 中国听力语言康复科学杂志，2010(4):23 26 16 汪吉宝，段家德，陈海华，等 听神经病 106 例听力学分析 J 中华耳鼻咽喉头颈外科杂志，2008，43(5):347 350 17 李兴启，孙建和，杨仕明，等 耳蜗病理生理学 M 北京:人民军医出版社，2011:269 278 18 汪吉宝，段家德，陈海华，等 听神经病 106 例听力学分析 J 中华耳鼻咽喉头颈外科杂志，2008，43(5):347 350 19 王锦玲，石力，薛飞，等 听神经病听力学特征及病损部位分析 J 听力学及言语疾病杂志，2007，15(2):89 97 20 JAFAI Z，MALAYEI S，ASHAYEI H，et al Adultswith auditory neuropathy:comparison of auditory steady state response and pure tone audiometryJ J Am AcadAudiol，2009，20(10):621 628 21 MOLLE A，JHO H D，YOKOTA M，et al Contributionfrom crossed and uncrossedbrainstem structures to the brain-stem anditory evoked potentials:a study in humans J La-ryngoscope，1995，105:10 22 查定军，黄维国，王锦玲，等 初始音强度差对听力正常青年人畸变产物耳声发射的影响J 听力学及言语疾病杂志，2000，8:24 26 23 薛飞，王锦玲，孟美娟，等 听神经病患者畸变产物耳声发射的特征 J 听力学及言语疾病杂志，2003，11(4):258 260 24 HANGEN E，BLOGMGEN K，BENIT P，et al Life with orwithout AIF J Trends Biochem Sci，2010，35(5):278 287(2022 08 21 收稿)(本文编校:刘菲，胡欣)392第 44 卷第 3 期安徽医学2023 年 3 月Anhui Medical Journal