一个听神经病家系的AIFM1基因致病性新突变_徐晨宇.pdf
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1、一个听神经病家系的 AIFM1 基因致病性新突变徐晨宇高玲丽唐晓敏孙宇轩潘春晨孙敬武基金项目:国家自然科学基金青年项目(编号:81800911)作者单位:230001安徽合肥安徽医科大学附属省立医院耳鼻咽喉头颈外科(徐晨宇,孙敬武)230001安徽合肥中国科学技术大学附属第一医院耳鼻咽喉头颈外科(高玲丽,唐晓敏,孙宇轩,潘春晨)通信作者:孙敬武,entsun ustc edu cn 摘要 目的探讨一个听神经病(AN)家系的致病基因突变和可能分子机制。方法收集 2020 年 10 月中国科学技术大学附属第一医院耳鼻咽喉头颈外科收治的 1 个三代 12 人的 AN 家系,采集其病史,绘制系谱图,行
2、听力学、影像学及体格检查;利用高通量测序筛选致病基因;采用 Sanger 测序对致病基因位点进行变异确认及家系共分离验证;通过实时荧光定量聚合酶链反应(qT PC)对致病基因进行验证。结果该家系中的父亲(:1)及两个女儿(:4,:5)为耳聋患者,表现为言语识别率差,与纯音听阈不符,听力学检查符合 AN 特殊表现;高通量测序结果显示致病基因为 AIFM1:C 250 4G A 位点剪接突变;Sanger 测序结果显示致病基因突变位点与该家系的 AN 表型完全符合共分离;qT PC 结果显示患者 AIFM1 mNA 表达显著上调;该家系的遗传方式可能为 X 连锁显性遗传。结论本研究检测出听神经病
3、AIFM1 基因新的剪接突变,其遗传模式可能为 X 连锁显性遗传。关键词 听神经病;AIFM1 基因;剪接突变;高通量测序;X 连锁显性遗传doi:10.3969/j.issn.1000 0399.2023.03.009听神经病(auditory neuropathy,AN)是一种以外毛细胞功能正常,听觉通路的神经传导异常为特征的听力障碍,表现为耳声发射(otoacoustic emissions,OAE)或耳蜗微音器电位(cochlear microphonics,CM)可引出,听觉脑干反应(auditory brainstem responses,AB)缺失或严重异常1 2。此病主要影响患
4、者的言语识别能力,是婴幼儿及青少年听力言语交流障碍的常见疾病之一3 4。AN 病因复杂,主要包括遗传因素与环境因素5,以遗传因素为主5 7,目前已经发现的 AN 致病基因有 OTOF、OPA1、DIAPH38。近期文献9 报道了一个 X 连锁进行性 AN 的中国家系,应用全外显子测序技术确定其致病基因为 AIFM1。AN 发病机制尚不清楚,漏诊及误诊率高。本研究证实一个 AN 家系患者中存在 AIFM1 新的剪接突变位点,现报道如下。1资料与方法1 1一般资料本研究家系资料的调查于2020 年10月在中国科学技术大学附属第一医院耳鼻咽喉头颈外科完成。此家系成员均来自于安徽省,汉族,先证者为一名
5、 36 岁的女性,以听力下降伴交流障碍为主诉于2020 年就诊于我科门诊,为行人工耳蜗植入术入住我院。先证者所在家系包括三代 12 名成员(图 1),追问病史发现该家系除先证者外,其他家系成员中也有出现进行性听力下降伴言语识别障碍症状者。征得患者本人及家属同意后,将该家系成员纳入本研究。纳入标准:纯音测听显示不同程度的感音神经性耳聋;AB反应波严重异常或引不出,OAE 或 CM 可引出。排除标准:排除听神经瘤等蜗后占位性病变10。图 1一个家系 12 名 AN 病患者家系图谱1 2方法由耳鼻喉科专科医生对全部 12 名 AN 家系成员进行详细病史采集:被采集人员的基本信息、主诉、现病史、既往史
6、、出生史及新生儿期高危因素、其他系统情况、耳聋家族遗传史等。对于无法正常交流的患者及儿童由家属代诉。同时对家系成员进行了系统的全身体格检查(未见明显异常),排除综合征性性耳聋。耳科检查重点关注有无耳廓畸形、外耳道闭锁、有无耳前瘘管,鼓膜穿孔以及鼻、咽、喉的发育状况。听982第 44 卷第 3 期安徽医学2023 年 3 月Anhui Medical Journal力学检查内容:纯音测听(pure tone audiometry,PTA)、畸变产物耳声发射(distortion product otoacousticemission,DPOAE)、AB。影像学检查包括高分辨率CT(high es
7、olution CT,HCT),以排除内耳畸形、内听道占位性病变等。1 3基因位点筛查对该 AN 家系进行常见致聋基因位点检测,确定有无突变基因。如果未发现常见基因位点突变,则进行下一步试验继续寻找致病基因。利用 9 项遗传性耳聋基因芯片(4 个耳聋基因 9 个突变位点 GJB2(35delG、176 _191del16、235delC、299 _300delAT),GJB3(538C T),线粒体 12SrNA(1494C T、1555A G),SLC26A4(2168A G、IVS7 2A G)对该家系先证者及家系成员进行筛查。1 4耳聋基因靶向测序采用 Covaris S220 超声波打
8、断仪将基因组 DNA 随机打断成约 150 bp 左右的片段。进行末端补平修复、片段两端加 A 尾,用连接酶在 DNA 片段的两端加上 Illumina 测序专用的接头(a-dapter),连接的产物经过扩增、片段选择和纯化,构建DNA 测序文库。按照 Illumina 标准建库方法行 3 步酶促反应形成样本文库。文库质量检测,上机测序。1 5变异确认及家系共分离验证结果利用 Sanger测序验证经耳聋基因靶向测序得到的候选基因,进行家系共分离验证,排除其他候选基因,最终锁定致病基因 AIFM1 基因。针对检出的致病基因 AIFM1 突变位点设计验证引物。使用贝克曼自动化工作站预设程序配置 P
9、C 扩增反应体系,并按如下步骤运行程序:96 90 s;96 15 s,50 6 s,60 210 s,28 个循环;4 Holds。PC 产物使用 3130XL 测序仪进行毛细管电泳测序并在 ABI 3130 Genetic Analyzer(Applied Bio-systems)上进行分析,再在家系成员中进行共分离验证。1 6实时荧光定量聚合酶链反应(quantitative real time polymerase chain reaction,qT PC)用 NAisoPlus 试剂盒(日本 Takara)提取全部 12 名患者血液样本中的总 NA。接着用 everTra Plus
10、TM(Toyo-ta obo,日本)将1 mg NA 反向转录成 cDNA。所用引物如表 1 所示。用 SYB PreMix Ex Taq(Takara)扩增并用 oche Light Cycler 480 实时聚合酶链式反应系统检测。扩增步骤为:9530 s,955 s,6010 s,7215 s,共 40 个循环,用 2 CT 方法计算相对基因表达。表 1qT PC 所用引物GeneSequences(53)AIFM1F:GTGGTCGTGGGGATTGTGCTATG:TCATGCTGCTCACCGTCCTTAATGCJB2F:GGTGGACCTACACAAGCAGCATC:GGAGAAG
11、CCGTCGTACATGACATAGSLC26A4F;TCGCTGTGGTGGCTTATGCTATTG:AGAAGATGTTGCTGATCCCAAAGGCF:forward:reverse2结果2 1系谱图及遗传特征先证者,女,36 岁,以听力下降伴交流障碍为主诉就诊,该患者家族中其父亲与妹妹有相似病史。该家系为一个三代 12 人的核心家系,父亲及两个女儿为患者,母亲及其他家庭成员表型正常。全部家系成员体格检查及颞骨影像学检查均未发现异常。该家系的遗传特征表现为父亲及女儿发病,其他家庭成员正常。由于发病代数少,且男女均有发病,故无法明确该家系的遗传方式。因此,该家系符合以下遗传方式:常染色显性
12、遗传模式(父亲携带常染色体上的致病基因)或者 X 连锁显性遗传模式(父亲携带 X 染色体上的致病基因)。2 2家系的临床表型特征该家系成员均为安徽人,汉族,先证者(:4)主诉 13 岁开始出现听力下降和语言识别能力下降,导致无法正常进行语言交流,影响日常生活。该家系中除了先证者之外,其父亲(:1)与妹妹(:5)与其症状相似,父亲在 23 岁开始出现听力下降伴交流困难,妹妹在 20 岁开始出现听力下降伴交流困难。全部 12 名家系成员既往无耳流脓或外伤史,无耳鸣、眩晕或走路不稳史,无明显的耳毒性药物接触史,无长期噪声接触史,全身及专科检查无其他器官系统疾病。3 名患者的双耳听力重度下降,低频听力
13、下降较为严重,听力曲线呈上升型。(图 2A);3名患者在 90dB 声刺激下,听性脑干反应未引出(图2B);3 名患者的双侧 DPOAE 均可正常引出(图2C);3名患者未见内耳畸形及内听道占位(图 2D)。092徐晨宇等:一个听神经病家系的 AIFM1 基因致病性新突变第 44 卷第 3 期2023 年 3 月注:A 为3 名AN 患者PTA 结果;B 为3 名AN 患者AB 结果;C 为3 名 AN 患者 DPOAE 结果;D 为3 名 AN 患者 HCT 结果。图 2AN 患者听力学及影像学检查结果2 3常见耳聋基因位点筛查结果本研究家系全部12 名成员药物敏感性耳聋相关基因 12SrN
14、A、先天性重度或极重度感音神经性耳聋相关基因 GJB2、后天性高频感音神经性耳聋(SNHL)相关基因 GJB3、大前庭水管综合症相关基因 SLC26A4 均正常;耳聋基因线粒体 mtDNA(1494C T、1555A G)、GJB2(35del G、299delAT、235delC、176del16、538C T)、GJB3(538C T)、SLC(2168A G、IVS7 2A G)均为野生型。2 4全外显子测序结果对先证者及其父母进行全外显子测序,发现先证者及其父亲携带 AIFM1 基因 c250 4G A 杂合突变,为剪接突变,变异来源于父亲。见表 2。该位点位于第 3 号外显子起始部位
15、前 4位碱基,可导致 3 号外显子不能转录。HGMD 数据库中无该位点的记录。根据 ACMG 指南11 进行致病性分析,该剪切位点的变异为临床意义未明的变异,提示可能为潜在的致病变异。随后对其他家系成员进行该位点验证,发现其患病妹妹同样携带该基因位点突变,而家系中正常家庭成员并未发现该基因位点突变,临床表型符合家系共分离现象。表 2高通量测序结果分析基因位置转录本外显子核苷酸氨基酸变异类型正常人频率预测致病性分析AIFM1chrX:129283547 NM_004208Exon3c 250 4G A splicingunkonw0 0008659Uncertain2 5变异确认及家系共分离验证
16、结果利用 Sanger测序法进行位点验证,发现该变异位点与该家系的 AN表型完全符合共分离:父亲及两个女儿均为患者,并且均携带先证者所发现的杂合剪切突变 AIFM1:c 250 4G A,母亲及其他家庭成员表型正常,未发现携带该变异。见图 3。注:A 为 AN 患者(图 1:4)c 250 4G A 突变图谱;B为 AN 患者(图 1:5)c 250 4G A 突变图谱;C 为 AN 患者(图 1:1)c 250 4G A 突变图谱;D 为其他正常家系成员sanger 测序图谱。图 3家系成员的 AIFM1 基因 sanger 测序图2 6qT PC 结果该家系 AN 患者不同基因 m-NA
17、表达如图 4 所示。这些结果提示 AN 患者 AIFM1的表达增加(P 0 001),而 SLC26A4(P=0 083)和GJB2(P=0 182)的表达在正常人和 AN 患者之间无明显差异。注:A 为 AIFM1 基因表达;B 为 SLC26A4 基因表达;C 为GJB2 基因表达;normal 为正常人,AN 为听神经病患者;与正常人比较,P 0 001。图 4家系成员的 AN 相关基因 mNA 表达结果比较3讨论AN 主要表现为言语分辨率与纯音听阈不成比例的下降12,且听力下降以低频听力为主,AB 引不出或严重异常,OAE 能够引出,影像学检查未见明显异常13。AN 患者因其临床表现特
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