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实验三 细菌的分布与消毒灭菌
【目的】
①了解细菌广泛分布于自然界及正常人体，树立“有菌观念”，从而认识无菌操作对于微生物学及医学实践的重要性。
②了解正常人体中寄居着种类繁多的细菌，正常情况下不引起人类疾病，称为正常菌群。
③熟悉外界因素对细菌的影响，学习常用的消毒灭菌方法。
④了解不同细菌对外界因素具有不同的抵抗力。
一、细菌的分布检查
（一）空气中的细菌检查
【材料】
普通琼脂平板培养基。
【方法】
①取普通琼脂平板一只开启皿盖，培养基面向上放于实验桌上，暴露5～30min后盖好。
②置37℃培养18～24小时后观察结果。
【结果】（填表10-1）
平板培养基表面或多或少有菌落生长。
（二）地面水中的细菌检查
【材料】
地面水(河水、井水或池水)、高层琼脂培养基、1ml无菌吸管、灭菌培养皿。
【方法】
①以无菌吸管吸取1ml地面水，加入灭菌平皿中。
②将已溶化且冷至45℃左右的高层琼脂倾注人上述平皿中，加盖后轻轻摇动，使水与琼脂充分混匀，静凝。
③37℃ 24小时后取出观察，计数菌落。
【结果】（填表10-1）
（三）衣服、票证、头发、手指皮肤上的细菌检查
【材料】
普通琼脂平板培养基。
【方法】
取普通平板一个，用蜡笔在平板背面玻璃上划成四等分，并贴上标签(图10-1)。然后以无菌操作法，用衣袖角、票证、头发及手指或指甲内污物，在平板培养基表面相应部位轻轻涂抹，置37℃培养24小时，观察并记录结果。
【结果】填表
培养基表面涂抹处有菌落生长。 衣服、票证、头发、
手指皮肤上的细菌检查
（四）正常人体咽喉部的细菌检查
【材料】
血液琼脂平板培养基、灭菌棉拭、接种环、酒精灯。
【方法】
取灭菌棉拭一支，在被检查者咽喉部轻轻涂擦后，再涂于血液琼脂培养基—侧，然后改用灭菌接种环作分离划线接种。盖上皿盖，37℃孵育24小时（或者采用咳喋法）。
【结果】（填表10-1）
琼脂平板表面有菌落生长。其中占优势的是一种细小菌落，其周围有草绿色的不完全溶血环。此为咽喉部的正常菌群—甲型链球菌。
（五）实验结果观察(填表)
细菌分布的实验结果
检查材料
空气
水
衣角
票证
头发
手指
咽喉部
细菌生长情况
菌落个数

实验体会

二、消毒灭菌试验
（一）煮沸与高压灭菌法
【原理】
高温对细菌有明显的致死作用，主要机制是凝固菌体蛋白质，也可能与细菌DNA单螺旋断裂、细菌细胞膜功能受损及菌体内电解质浓缩有关。
湿热灭菌法所需温度比干热法为低，时间较短。尤其是高压蒸气灭菌，因增加压力而提高沸点，灭菌效果最佳。有芽胞的细菌由于对热的抵抗力比无芽胞细菌强，所以只有采用高压蒸气灭菌法才能将芽胞彻底杀灭。
【材料】
琼脂平板两块、肉汤管两支、大肠埃希菌和枯草芽胞杆菌肉汤培养物。
【方法】
①取琼脂平板两块，用记号笔分别在二平板底部玻面上，注明大肠埃希菌和枯草芽胞杆菌，并分别将二块平板底玻璃面划分三等份，于每块平板的三等份上分别注明对照、加热100℃ 10min及加热121℃ 20min。
②取肉汤管二支，分别注明加热100℃ l0min及加热121℃ 20min，用毛细吸管吸取大肠埃希菌肉汤培养物，于上述二支肉汤管中各加入菌液一滴。混匀，再用接种环于二支肉汤管的任何一管中取一环菌液接种于大肠埃希菌平板的对照处，然后分别将肉汤管加热100℃ l0min及加热121℃ 20min(高压蒸气15磅、20min)，再各取一接种环分别接种于平板的相应部位。枯草芽胞杆菌以同法试验。
③将二块琼脂平板接种物置37℃培养24小时，比较培养基上二种细菌的生长情况。
【结果观察】（填表10-2）
表10-2 煮沸和高压灭菌实验结果
细菌名称
100℃ 10分钟
121℃ 20分钟
未加热(对照)
枯草芽胞杆菌

大肠埃希菌

结果分析
（二）紫外线杀菌法
【原理】
波长265～266nm的紫外线因与DNA吸收光谱-致而有明显的杀菌作用。其机制是使细菌DNA相邻的胸腺嘧啶形成二聚体，从而破坏DNA构型，干扰其正常复制，导致细菌死亡。
紫外线杀菌力虽强，但穿透力弱，故只能用于实验室、病房或手术室内空气及物体表面的消毒灭菌。另外，杀菌波长的紫外线对人体皮肤、眼睛等有损伤作用，应注意防护。
【材料】
大肠埃希菌培养物、琼脂平板、接种环、酒精灯、紫外线灯。
【方法】
①以灭菌接种环挑取大肠埃希菌培养物，于琼脂平板上作来回密集划线接种。
②半启皿盖(将皿盖遮住涂面的1／2)，置于紫外线灯下lm以内接受照射30分钟。
③盖上皿盖，于37℃培养24小时后观察结果。
【结果观察】（填空）
平板上用黑纸遮盖部分 菌生长，未遮盖部分 菌生长。这说明紫外线具有 作用，但 力弱。
（三）化学消毒法
1、皮肤消毒试验
【原理】
乙醇可使菌体蛋白脱水凝固或与菌体蛋白、酶蛋白等结合而使之变性失活。70％～75 ％乙醇在15～30秒即将细菌杀死。但95％的乙醇消毒效果反不如70％～75％为好，因高浓度乙醇使菌体蛋白表面迅速凝固，影响乙醇继续进入菌体内发挥作用。2.5％的碘酒可使菌体酶蛋白中的硫氢基(-SH)改变，使酶失去活性，导致机能障碍而死亡。
【材料】
普通琼脂平板一个、2.5％碘酒、75％乙醇。
【方法】
取普通琼脂平板一个，用蜡笔在平板背面玻璃上划成五等分，并贴上标签；两人用手在培养基上各涂一格，然后用2.5％碘酒、75％乙醇消毒手指后再各涂另一格，留一格作对照，盖好平板，置37℃温箱中培养24小时观察结果。
【结果】（填表）
　 皮肤消毒试验结果

37℃ 24h培养细菌生长情况
结果解释
消毒前手指皮肤

消毒后手指皮肤

对照(不接种)

2、 化学消毒剂对细菌的影响
【原理】
有些化学药品浓度高时能杀灭病原微生物，称为化学消毒剂；浓度低时能抑制细菌生长，称为防腐剂。由于化学消毒剂对人体细胞往往具有毒性作用，故只能外用。不同细菌对不同的化学消毒剂具有不同的敏感性。
【材料】
1％龙胆紫、2％碘酒、2％红汞、1:1000新洁尔灭、无菌滤纸片、葡萄球菌培养液、大肠埃希菌培养液、琼脂平板、无齿小镊子。
【方法】
取琼脂平板两块，分别在其底部注明葡萄球菌及大肠埃希菌。同时将每块平皿底部玻璃面划分4等分，并分别标明龙胆紫、碘酒、红汞、新洁尔灭。(操作方法与药敏试验相似)
三、抗生素的抗菌试验(药敏试验，纸片法)
【原理】抗生素主要是指某些微生物(大多数为放线菌和真菌、极少数为细菌)在生长繁殖过程中产生的一种合成代谢产物。此种有机化合物具有抗生物作用，能抑制或杀灭某些生物细胞，主要是一些微生物和肿瘤细胞。一种抗生素只对一定种类的生物细胞具有选择性拮抗作用，这种作用范围称为抗菌谱。抗生素的抗菌试验(药敏试验)是指在体外测定药物抑制或杀死细菌能力的试验。
【材料】
①金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、琼脂平板培养基。
②抗生素纸片(青、链、氯、庆大霉素、磺胺等)、尖头镊子、酒精灯、接种环。
【方法】
①取琼脂平板培养基二块，于其底部玻璃上用标签纸注明本人所接种的菌株名称（或将平板底部以蜡笔划为六等分，分别在靠近边缘处注明青、链、氯、庆大等字样）。
②以灭菌接种环挑取菌液，在培养基表面作密集划线接种。
③将镊子火焰灭菌，待冷后再取各药物纸片，分别牢贴于种有细菌的平板培养基表面相应位置，每次贴片后镊子均应经火焰烧灼灭菌。每张纸片间距不少于24mm，纸片中心距平皿边缘不少于15mm，并分别作好标记。

在直径90mm的平板上均匀摆放药敏纸片的样板
④37℃孵育18～24h后，分别测量各纸片抑菌环直径(包括纸片在内)(mm)，抑菌环的边缘以肉眼见不到细菌明显生长为限。判定其敏感度。
【结果观察记录】填表。
药物敏感试验结果判断参考标准：
抗菌药物
抑 菌 圈 直 径（mm）
耐药
中度敏感
敏感
青霉素
链霉素
其它抗生素
＜10
＜10
＜10
10～12
10～14
10～15
≥13
≥15
≥16
敏感：表示常规剂量的药物在体内所达到的浓度能抑制或杀灭待测菌；中度敏感：指提高测定药物的剂量或在该药物浓集部位，细菌生长可被抑制；耐药：表示常规剂量的药物在体内所达到的浓度不能抑制或杀灭待测菌。
药物敏感试验(纸片扩散法)结果
抗生素
大肠埃希菌
金黄色葡萄球菌
抑菌圈直径(cm)
敏感度
抑菌圈直径(cm)
敏感度
青霉素

红霉素

庆大霉素

先锋霉素

氯霉素

四、口腔内微生物检查（口腔专业）
【方法】
①滴一滴墨汁于洁净玻片的一端；
②用牙签取齿间牙垢少许在墨汁中涂匀；
③用玻片推成推片，干燥后油镜观察、绘图。 　　
【结果】（绘图）　　　　　　　　　　　　　　　　　　口腔内微生物
可见黑色背景中有着色发亮的细菌、螺旋体等微生物。
五、常用消毒灭菌器及无菌室介绍
(一)高压蒸气灭菌器
【构造】
高压蒸气灭菌器是双层的金属圆筒，盖旁附有螺旋，借以紧闭盖门，使蒸气不外溢。因而当蒸气压力升高时，其温度亦相应地增高，高压蒸气灭菌器上装有排气门、安全活塞，以调节器内压力。还有温度表和压力表，以显示内部的温度和压力。二者的关系见表10-5。器内装有带孔的金属搁板，用以放置欲灭菌物品。
【用法】
加适量水于器内，放入欲灭菌物品，将盖关上，转紧螺旋使之密闭。灭菌器底部用电炉加热，同时打开排气门，使器内冷气完全排出，否则压力表上所示压力并非全部为蒸气压力，再维持该压力20分钟后，停止加压。
蒸气压力与温度的关系
千帕斯卡 千克/平方厘米 磅/平方吋 温度
(kPa) (kg/cm2) (lb/in.2) (℃)
34.47　　　　　0.35　　　　　　　　　　5　　　　　　　　108.8
55.20　　　　　0.60　　　　　　　　　　8　　　　　　　　113.0
68.94　　　　　0.70　　　0　　　　　　10　　　　　　　　115.6
103.50　　000　1.05　　　　　　　　0　15　　　　　　　　121.3
137.80　　000　1.50　　　　　　0　　　20　　　　　　　　126.2
【注意事项】
1.必须待压力逐渐自行下降至零时，才可开盖取物。切不可突然打开排气门，放气减压，以免瓶内液体冲出外溢。
2.用于耐高温和耐湿物品的灭菌，如普通培养基、手术器械、手术衣及敷料等。
(二)干热灭菌器(干烤箱)
【构造】
箱壁为双层，两层间衬以石棉板隔热，底部装有电热线圈，箱壁有温度调节器和时间调节器，箱顶有温度计调节孔，灭菌开始时关闭调节孔。开启电源后，箱内温度逐渐升高，可保持恒温。
【用法】
将待灭菌物品包装妥当，放人箱内金属架上，关好玻璃门和金属门，开启电源，调节温度(160～170℃)和时间(2小时)。
【注意事项】
①温度不可超过180℃，以免烧焦棉塞及包装纸。
②灭菌后须待温度下降至接近室温时方可打开箱门，否则因冷空气骤进会引起玻璃器皿破裂。
③干烤灭菌主要应用于玻璃、陶瓷制品、凡士林、液体石蜡等物品。
(三)流通蒸气灭菌器
其构造原理同一般的蒸锅，底层盛水，器内有一至二层的带孔隔板，以放置待灭菌的物品。加热水后沸腾产生蒸气。在普通大气压下，蒸气温度只能达到100℃，维持此温度30分钟左右，只能杀死细菌繁殖体，而芽胞不一定死亡。所以使用流通蒸气灭菌器时，必须行间歇灭菌法，即每日一次，每次100℃蒸30分钟，取出置37℃孵箱培养过夜，使未死亡的芽胞发育成繁殖体。如此连续灭菌三次可达灭菌目的。本法用于一些不耐高温的培养基之灭菌。
(四)滤菌器
滤菌器是用以除去细菌的器具，它含有微细小孔，只允许液体及气体通过，而大于孔径的物体不能通过。滤菌器可以除去细菌，但不能除去病毒、支原体、衣原体及细菌L型等微生物。滤过除菌主要用于一些不耐高温的血清、抗生素、药液、酶制剂等。常用的滤器有蔡氏滤器和玻璃滤器。
(五)煮沸消毒器
煮沸100℃ 5min，能杀死一切细菌的繁殖体，煮沸消毒器可用于一般器械(剪刀、注射器)等的消毒。
(六)紫外线灯
常用于手术室、病房、无菌室、婴儿室等的空气消毒，其消毒效果与照射的时间、距离和强度有关，一般要求灯管离地面约3米高处，照射1～2小时。
(七)无菌室及无菌工作台的工作原理及使用
为避免环境和空气中的细菌污染培养物，一般较为细致的细胞培养、细菌培养的操作均应在紫外线消毒后的无菌室或超净工作台内进行。一些不能经受高压、高温消毒的试剂可用滤器滤膜除菌，器皿可用紫外线照射、75％乙醇或0.1％的十二烷基磺酸钠(SDS)浸泡消毒。
1、无菌室 无菌室或称洁净室，是在实验室内部安装的与外界隔离的用于无菌操作的实验室。简单的无菌室可用木结构和玻璃制成，室内应有空气过滤装置，应安装恒温恒湿的空气调节器、紫外线杀菌灯、照明灯、电源和煤气嘴等。
无菌室必须经常保持整洁，一般进入无菌室时，应着隔离衣、帽和专用鞋。用前必须先经紫外线杀菌灯照射30～60min；操作结束后应擦拭台面，并再经紫外线杀菌灯照射处理，随时保持室内的无菌状态。
缓冲间是其它实验室与无菌室隔室的中间区域，它能保持无菌操作的环境，可与更衣间为同一间，其间设吹风机、恒温培养箱和小型低速离心机等。
另外，无菌室应避免日光直射，天花板不宜过高，一般为2.5m左右，以确保紫外线的消毒作用。
2、无菌工作台 无菌工作台又称超净工作台，系在接种罩的基础上设计出来的无菌工作台。目前多采用垂直层流的气流形式，通过变速离心风机将负压箱内经过预滤器过滤的空气压入静压箱，再经高效过滤器进行二级过滤，从出风面吹出的洁净风流 ，以一定的和均匀的断面风速通过工作区时，将尘埃颗粒和微生物颗粒带走，从而形成无尘无菌的工作环境。
使用时应提前50min打开紫外线杀菌灯，30min后关闭并启动送风机。净化区内严禁存放不必要的物件，以保持洁净气流型不受干扰。应定期用电风速计测量工作区平均风速(每月1次) ，保持其在0.32～0.48m/s。每2～3个月将预滤器中无纺布滤料拆下进行清洗或予以更换，每3个月用尘埃粒子计数器测定工作台的洁净度(≤3.5颗/L)和平板法测定其平均菌落数(≤0 .5个/皿时)。当加大风机输入电压已不能使净化工作区平均风速达到规定参数时，应更换高效过滤器。
六、医院感染的微生物学监测（医院见习）
(一)压力蒸气灭菌效果的监测
目前应用的压力蒸气灭菌器有两种：一种是普通的下排气式压力蒸气灭菌器，另一种是近年来出现的预真空高压蒸气灭菌器。前者一次灭菌全过程需时70min，而后者只需20min。对于压力蒸气灭菌效果的检查包括：
1、操作步骤检查 　遵守操作规程，仪表的检查(压力表、留点温度计、温度记录、定时器等)；
2、化学指标检查 　应用指示剂颜色的改变进行监测。如三M指示纸；某些物质的熔解，如琥珀酸酐120℃熔解、苯甲酸121～123℃熔解。
3、生物指标的监测 　为直接检查灭菌效果，通常应用嗜热脂肪芽胞杆菌(NCTCl0003或ATCC 7953，SSIK 31)，有市售商品药片供应，菌片含菌量为5×105～6／片，此菌在121℃±0.5℃饱和蒸汽中存活时间≥3～9min，杀灭时间为＜19min。灭菌前于灭菌器中选择五点放置(通常将菌片放于小试管中，小试管置于灭菌器不同位置)，灭菌后以无菌手续将菌片取出，放于溴甲酚紫蛋白胨水培养基中于55℃培养48h。如培养基不变色，外观澄清说明无细胞生长；如外观混浊且培养基变为黄色则说明有菌生长，灭菌不彻底，需查找原因并重新灭菌。
(二)紫外线杀菌效果的监测
①紫外线灯：常用于手术室、病房、无菌室、婴儿室等的空气消毒，其消毒效果与照射的时间、距离和强度有关，一般要求灯管离地面约3米高处，照射1～2小时。
②紫外线消毒效果监测：包括日常监测、紫外灯管照射强度监测和生物监测。日常监测包括灯管应用时间、累计照射时间和使用人签名。对新的和使用中的紫外灯管应进行照射强度监测，新灯管的照射强度不得低于100uW/cm2，使用中灯管不得低于70uW/cm2照射强度，监测应每半年一次。生物监测必要时进行，经消毒后的物品或空气中的自然菌应减少90.00％以 上，人工染菌杀灭率应达到99.90％。生物学监测应用枯草芽胞杆菌黑色变种(ATCC9372)，有市售菌片供应，含菌量为105～6／片。
(三)消毒剂的使用监测
1、消毒剂鉴定试验　 包括消毒剂定性试验和消毒剂定量消毒试验。
2、消毒剂使用过程中污染菌的监测以及常用消毒剂的中和剂。
(四)微生物污染监测
1、物体表面细菌污染监测 　采样方法为应用大小为5cm×5cm的正方形无菌规格扳，放于物体表面，用浸有生理盐水的棉拭子在规格扳内往返涂抹10次，将取完标本的棉拭子放入盛有定量无菌盐水的试管中，之后进行稀释数菌并计算出细菌的数量（可用倾碟法），按卫生部要求医院各类病房物体表面细菌数不得超过8个/cm3。计算公式如下：
平均平板菌落数×稀释倍数
采样面积

菌落数/cm2＝
2、空气中细菌监测 室内空气中微生物的发生源主要为人和动物。人可不断地从呼吸道、消化道、皮肤、毛发等排出微生物进入空气中。一般情况下，人体排菌量每分钟不超过1000个，但患者的排泄物和分泌物，如飞沫、痰液等含有大量的病原菌，可严重污染空气和物体表面。当人们在进行各种工作时也会污染空气，如医疗操作、医疗用品和卫生用品生产、微生物试验、穿衣、铺床等都可使微生物进入空气中。
空气中微生物学监测是通过空气采样、细菌培养来了解各种场所空气中所含微生物的数量，从而评价卫生状况，以便有的放矢地采取对策。此外，通过对某种消毒措施使用前后的采样及分析，以评价消毒效果。
根据采样原理可将采样方法分为沉降、固体撞击、液体冲击和过滤4种。本实验介绍自然沉降平板采样法用于细菌总数的检测。其中应用重力沉降作用捕获空气中的气溶胶粒子是沉降法中最简便的方法。
【材料】
分离培养基：营养琼脂平板、血琼脂平板等。
【方法】
①采样方法
采样时间：选择消毒处理后与操作前期进行。
采样高度：与地面垂直高度为80～150cm处。
布点方法：室内面积≤30m2时，可设内、中、外对角线3点；内和外部位，距离墙壁lm处。室内面积≥30m2，设东、南、西、北、中5点，亦可根据室内面积布点大于5点，各点间距为lm。
平皿暴露采样：将培养基平皿打开，暴露5分钟(亦可5～30分钟)后，盖好平皿，置于37℃培养24～48小时，计算菌落数。
②测算方法：采用营养琼脂和血琼脂琼脂板作平皿暴露法采样，记录每只平皿上的菌落数，按奥氏公式，将所得菌落数计算成浮游菌数，根据公式测算，5分钟在100cm2面积上降落的细菌数，相当于10L空气中所含细菌数。其公式如下：
A T 10 AT
100 5 100 50000N

CFU／m3＝N × × × ＝
A＝平皿面积(cm2)。 T：平皿暴露于空气中的时间(分钟)。 N＝平均菌落数：(CFU)。
③空气消毒后整个检测过程必须严格地按无菌操作规程进行，防止操作过程中微生物的再污染而影响检验结果。
④医院空气中细菌含量要达到卫生部的要求，手术室、产房、及婴儿室等空气中细菌要求细菌总数不得超过10CFU/m3～500 CFU/m3。
(五)医护人员手部细菌污染监测
　采样部位为右手每个手指的掌面，先用生理盐水棉拭子往返涂抹后将拭子置于含10ml生理盐水的试管中混匀，进行数菌，计算每平方厘米的细菌数。卫生部要求医护人员手部细菌数不得超过8个/cm2。
【思考题】
1.做了微生物分布检查及消毒灭菌的试验后，对建立无菌观念和为什么要进行无菌操作是否有了一定体会?
2.何谓药物敏感性试验，有什么临床意义?使用抗生素时应注意什么?
3.通过检查口腔内的微生物或药剂的微生物学检查，你有何体会?
4.医院感染微生物学的监测有哪些内容？空气中的微生物可通过哪些方法进行监测？
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