lncRNA_CRNDE靶...夺诱导的大鼠皮质神经元损伤_吴明锋.pdf

收稿日期 修回日期 作者单位 山东省蓬莱市人民医院 外科，；山东省泰安市中心医院 神经外科，作者简介 吴明锋（），男，主治医师文章编号（）基础医学 靶向 调控氧糖剥夺诱导的大鼠皮质神经元损伤吴明锋，韩晓艳，郭建磊，张士忠摘要目的：探讨 对氧糖剥夺（）诱导的大鼠皮质神经元损伤的影响及作用机制。方法：培养大鼠皮质神经元，分为对照组（组）、组、组、组、组、组、组和 组，法检测细胞中 和 表达水平，法检测细胞存活率，试剂盒法检测细胞培养上清液中乳酸脱氢酶（）漏出率，流式细胞术检测细胞凋亡率，检测细胞中、蛋白表达。双荧光素酶报告基因实验验证 和 的调控关系。结果：与 组比较，组 水平、漏出率、细胞凋亡率、蛋白水平升高（），水平、细胞存活率、蛋白水平降低（）。与 组比较，组细胞存活率、蛋白水平升高（），漏出率、细胞凋亡率和 蛋白水平降低（）。与 组比较，组细胞存活率、蛋白水平升高（），漏出率、细胞凋亡率和 蛋白水平降低（）。与 组比较，组细胞存活率、蛋白水平降低（），漏出率、细胞凋亡率和 蛋白水平升高（）。靶向负调控 表达。结论：干扰 表达可靶向上调 促进 诱导的大鼠皮质神经元增殖，并抑制神经元凋亡及 漏出率，减轻了神经元损伤。关键词 神经元损伤；长链非编码 ；氧糖剥夺；大鼠中图法分类号 文献标志码 ：，（，；，）：（）：，（），：，（），（），（），（），（），（），（），（）：，；蚌埠医学院学报 年 月第 卷第 期 缺血缺氧性脑损伤是新生儿较为常见的疾病，其临床病死率高达 ，也是目前新生儿死亡、小儿脑瘫及其他中枢神经系统损害的主要原因，严重威胁新生儿生命健康。研究认为，大脑缺血缺氧影响神经突结构和神经元极性，神经系统损伤是缺血缺氧性脑损伤的主要原因。因此，探究影响神经系统损伤的分子机制并采取相应的干预措施尤为重要。长链非编码 （）和微小（）是两类非编码，且 可靶向 调 控 靶 基 因 的 表 达，靶基因这一调控途径在神经系统疾病的发生发展中起重要调控作用。是一种，与多种疾病的发生发展密切相关。研究显示，在低氧状态下通过 轴调节心脏祖细胞的增殖和迁移，可为心肌梗死的治疗提供分子靶点；在脓毒症大鼠肝组织和肝细胞中表达降低，上调其表达通过靶向抑制 并促进 的表达减轻脓毒症大鼠肝损伤。但目前，对缺血缺氧性脑损伤的影响和作用机制还未明确。生物在线软件预测显示，可能靶向调控。有研究显示，在脑皮质损伤大鼠中表达下调，上调其表达可靶向抑制 来抑制肥大细胞死亡，改善脑皮质损伤大鼠的学习和记忆功能。本研究通过体外原代培养大鼠皮质神经元，建立氧糖剥夺（）诱 导 的 神 经 元 损 伤 模 型，旨 在 观 察 能否靶向 影响 诱导的神经元损伤，以期为缺血缺氧性脑损伤的治疗提供新的作用靶点。材料与方法 实验动物及试剂 雄性 大鼠，清洁级，日龄，体质量 ，河南省实验动物中心，许可证号：（豫）；胎牛血清（），浙江天杭生物科技股份有限公司；培养基和细胞计数试剂盒（），北京索莱宝科技有限公司；试剂盒和 试剂，美国 公司；逆转录试剂盒和 试剂盒，深圳晶美生物工程有限公司；引物、小干扰（）、乱序无意义阴性序列（）、野生型质粒（）和突变型质粒（）、模拟物（）及对照序列（）、抑制剂（）及阴性对照序列（），上海生工生物工程有限公司；乳酸脱氢酶（）试剂盒，南京建成生物工程研究所；细胞凋亡试剂盒和二喹啉甲酸（）蛋白检测试剂盒，上海碧云天生物技术有限公司；兔抗鼠 淋巴细胞瘤（）、淋巴细胞瘤 相关蛋白（）多克隆抗体，美国 公司；双荧光素酶活性检测试剂盒，美国 公司。方法 细胞培养及转染参照文献方法分离培养大鼠皮质神经元。大鼠脱颈椎处死取脑组织，分离大脑皮层，手术剪剪成 左右的小块，胰蛋白酶 消化 ，终止消化，过 目滤网，离心，弃上清液。加含 的 培养液，接种于 多聚赖氨酸浸泡过夜的 孔培养板中，置于 、湿度 培养箱（常规培养箱）中培养。培养 后，加含 、和 谷氨酰胺的神经培养液培养。以后每 半量换液 次，培养至第 代时用于实验。将神经元以 每 孔 个 接 种 于 孔 板 中，采用 脂质体法，分别转染、共 转 染 与、与。转染时间为 ，然后更换培养基，再培养，收集细胞备用。诱导的神经元损伤模型建立 参照文献方法建立 诱导的神经元损伤模型。将神经元接种于培养板中，培养 后，弃培养基，换为无糖 培养基，并置于 、湿度 培养箱中培养 。细胞分组处理未转染的神经元分为 组和 组，其中 组神经元用常规培养箱培养，组神经元按照 进行 处理。转染、共转染 与、与 的神经元均按照 进行 处理，并分别记为 组、组、组、组、组和 组。检测 和 表达 神经元以 个 孔接种于 孔板中，按 分组处理，培养 后，收集神经元。试剂提取神经元中总，然后逆转录为，最 ，后行 扩增。扩增条件：，共 个循环。引物序列：上游 ，下游 ；上游 ，下游 ；上游 ，下游 ；上游 ，下游 。法计算 相对、相 对 的 表达量。法检测神经元存活率神经元以 个 孔接种于 孔板中，按 分组处理，培养 后，加 试剂。孵育神经元 后，酶标仪 处测吸光度值（），并计算神经元存活率。存活率（）实验组 对照组。试剂盒检测培养上清液中 水平 神经元以 个 孔接种于 孔板中，按 分组处理，培养 后，收集培养上清液，离心 ，保留上清液。参照 试剂盒说明书，检测上清中 活性，计算其漏出率。漏出率（）活性实验组 活性对照组。流式细胞仪检测神经元凋亡神经元以 个 孔接种于 孔板中，按 分组处理，培养 后，收集神经元。清洗神经元 次，参照 试剂盒说明书，用流式细胞仪检测神经元凋亡。法检测 和 蛋白表达 神经元以 个 孔接种于 孔板中，按 分组处理，培养 后，收集神经元。试剂提取神经元中总蛋白，并用 法对蛋白定量。然后以每孔 蛋白行 电泳，并将分离蛋白湿转至 膜。于 脱脂奶粉溶液中封闭 后，分别置于（）、（）一抗孵育液中，孵育过夜。再置于山羊抗兔二抗（）孵育液中，孵育 。最后加显影液避光显影，型凝胶成像系统（北京六一生物科技有限公司）曝光拍照。双荧光素酶报告基因实验将对数期的大鼠皮质神经元以每孔 个接种于 孔板中，采用 脂质体法，分别共转染 与 或 、与 或 。转染时间为，然后更换培养基，再培养，收集细胞并裂解。然后参照双荧光素酶活性检测试剂盒操作说明，检测荧光素酶活性。统计学方法 采用（或）检验。结果 和 在 诱导的大鼠皮质神 经 元 中 的 表 达 与 组 比 较，组 水平升高（），水平降低（）（见表）。表 和 在 诱导的大鼠皮质神经元中的表达（）分组 干扰 表达对 诱导的大鼠皮质神经元损伤的影响 与 组比较，组神经元存活率降低（），漏出率升高（），神经元凋亡率升高（），蛋白表达降低（），蛋白表达升高（）。与 组比较，组神经元存活率升高（），漏出率降低（），神经元凋亡率降低（），蛋白表达升高（），蛋白表达降低（）（见图、及表）。过表达 对 诱导的大鼠皮质神经元损伤的影响与 组比较，组神经元存活率升高（），漏出率降低（），神经元凋亡率降低（），蛋白表达升高（），蛋白表达降低（）（见图、及表）。敲减 逆转干扰 表达对 诱导的大鼠皮质神经元损伤的影响与 蚌埠医学院学报 年 月第 卷第 期 组 比 较，组神经元存活率降低（），漏出率升高（），神经元凋亡率升高（），蛋白表达降低（），蛋白表达升高（）（见图、及表）。表 干扰 对 诱导的大鼠皮质神经元损伤的影响（）分组存活率 漏出率 凋亡率 蛋白 蛋白 示 值表 过表达 对 诱导的大鼠皮质神经元损伤的影响（）分组存活率 漏出率 凋亡率 蛋白 蛋白 靶 向 负 调 控 表 达 与 的核苷酸序列见图。共转染 与 的神经元荧光素酶活性低于共转染 与 的神经元（，），而共转染 与 的神经元荧光素酶活性与共转染 与 的神经元荧光素酶活性比较差异无统计学意义（，）。同时转染 的神经元中 水平高于转染 的神经元（，）。，表 敲减 逆转干扰 对 诱导的大鼠皮质神经元损伤的影响（，）分组存活率 漏出率 凋亡率 蛋白 蛋白 讨论 作为一种，参与多种疾病的发展进程。研究显示，在肝癌、前列腺癌和宫颈癌等肿瘤中的表达明显增加，促进肿瘤的发展进程。等研究显示，在硫酸葡聚糖钠（）诱导的结肠炎小鼠结肠组织和结肠上皮细胞系、和 中均表达升高，干扰其表达可靶向上调 并下调 抑制了 诱导的结肠上皮细胞凋亡，其可能是炎性肠病的新治疗靶标。等研究显示，敲减 可通过阻断 途径降低败血症诱导的急性肾损伤，有望成为败血症相关急性肾损伤的临床治疗靶标。但目前，对氧糖剥夺诱导的神经元损伤的影响和机制还未知。是一种糖酵解酶，主要存在于细胞质中。当细胞受损时，细胞膜通透性增加，立即释放至细胞外。因此，细胞培养基中 活性的高低是反映细胞受损程度的灵敏性指标。本研究显示，大鼠皮质神经元经氧糖剥夺处理后，细胞活性降低，凋亡加剧，漏出率显著升高，与张璟璇等报道的结果一致，表明氧糖剥夺致大鼠皮质神经元损伤模型建立成功。本研究显示，氧糖剥夺促进了大鼠皮质神经元中 的表达，而干扰 表达促进了氧糖剥夺诱导的大鼠皮质神经元增殖，且抑制 了 神 经 元 凋 亡 及 漏 出 率，说 明 干 扰 表达减轻了氧糖剥夺诱导的大鼠皮质神经元损伤。细胞凋亡是一种受多种基因调控的程序性死亡过程。和 参与调控细胞凋亡，抗凋亡蛋白 表达增加抑制细胞凋亡，而促凋亡蛋白表达增加则促进细胞凋亡。本研究显示，干扰 表达抑制了氧糖剥夺诱导的大鼠皮质神经元中 蛋白的表达，而促进了 蛋白的表达，进一步说明干扰 表达抑制了氧糖剥夺诱导的大鼠皮质神经元凋亡，减轻了氧糖剥夺诱导的大鼠皮质神经元损伤。基因定位于人 号染色体，与人类多种疾病的发生发展密切相关。例如，靶向抑制 表达降低 和 诱导的心脏成纤维细胞增殖及胶原形成，改善心肌梗死小鼠的心脏功能。可靶向抑制 减少多巴胺能神经元丢失和 降低，减轻神经损伤，轴为帕金森病的治疗提供了新靶点。本研究显示，过表达 增强了氧糖剥夺诱导的大鼠皮质神经元增殖活性，且抑制了神经元凋亡，降低了细胞 漏出率，表明过表达 减轻了氧糖剥夺诱导的大鼠皮质神经元损伤。可发挥 分子海绵作用影响 靶基因的表达，进而发挥生物学调控作用。为了研究 影响氧糖剥夺诱导的大鼠蚌埠医学院学报 年 月第 卷第 期皮质神经元损伤的分子机制，本研究首先利用双荧光素酶报告基因实验及检测干扰 对 表达的影响，证实了 在大鼠皮质神经元中靶向负调控 表达，这与氧糖剥夺促进了大鼠皮质神经元中 的表达，而降低了 表达的结果一致；此外，敲减 逆转了干扰 对氧糖剥夺诱导的大鼠皮质神经元增殖、凋亡及 漏出率的影响，提示 通过靶向负调控 来影响氧糖剥夺诱导的大鼠皮质神经元损伤，但是 具体调控的 的靶基因还有待进一步探究。综上，氧糖剥夺处理的大鼠皮质神经元中 表达升高，干扰 表达促进了氧糖剥夺诱导的大鼠皮质神经元增殖，并抑制了神经元凋亡及 漏出率，减轻了神经元损伤，这可能与 靶向负调控 有关，轴可能为缺血缺氧性脑损伤的治疗提供了新的分子靶点。但本研究尚未对 的靶基因进行探究，尚需更深一步探究 作用的 的靶基因在氧糖剥夺处理的大鼠皮质神经元损伤中的作用；同时，本研究仅利用体外细胞实验进行了探究，还需进一步建立动物模型，在体内观察 靶基因这一信号通路对大鼠皮质神经元损伤的影响。参考文献 阎雯，齐薛浩 及 样受体 在新生大鼠神经元缺氧缺血损伤中的作用机制研究 中国现代医学杂志，（）：赵婧，李强，何玲 通路在体外培养神经元缺氧缺血损伤中的作用 重庆医学，（）：，（）：，（）：，（）：，（）：，（）：，（）：，（）：，（）：，（）：，（）：，（）：张璟璇，袁美春，李海霞，等 人参皂苷 对氧糖剥夺诱导的大鼠原代皮层神经元损伤的保护作用 中成药，（）：，（）：陈朝琴，薛治乾，李文霞 淫羊藿通过 对高糖高脂诱导的胰岛 细胞损伤的影响及机制研究 蚌埠医学院学报，（）：，（）：，（）：陈宋，姜从桥 调控 促进结肠癌细胞增殖，迁移和侵袭 蚌埠医学院学报，（）：（本文编辑 周洋），