lncRNA_CRNDE靶...夺诱导的大鼠皮质神经元损伤_吴明锋.pdf
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1、收稿日期 修回日期 作者单位 山东省蓬莱市人民医院 外科,;山东省泰安市中心医院 神经外科,作者简介 吴明锋(),男,主治医师文章编号()基础医学 靶向 调控氧糖剥夺诱导的大鼠皮质神经元损伤吴明锋,韩晓艳,郭建磊,张士忠摘要目的:探讨 对氧糖剥夺()诱导的大鼠皮质神经元损伤的影响及作用机制。方法:培养大鼠皮质神经元,分为对照组(组)、组、组、组、组、组、组和 组,法检测细胞中 和 表达水平,法检测细胞存活率,试剂盒法检测细胞培养上清液中乳酸脱氢酶()漏出率,流式细胞术检测细胞凋亡率,检测细胞中、蛋白表达。双荧光素酶报告基因实验验证 和 的调控关系。结果:与 组比较,组 水平、漏出率、细胞凋亡率
2、、蛋白水平升高(),水平、细胞存活率、蛋白水平降低()。与 组比较,组细胞存活率、蛋白水平升高(),漏出率、细胞凋亡率和 蛋白水平降低()。与 组比较,组细胞存活率、蛋白水平升高(),漏出率、细胞凋亡率和 蛋白水平降低()。与 组比较,组细胞存活率、蛋白水平降低(),漏出率、细胞凋亡率和 蛋白水平升高()。靶向负调控 表达。结论:干扰 表达可靶向上调 促进 诱导的大鼠皮质神经元增殖,并抑制神经元凋亡及 漏出率,减轻了神经元损伤。关键词 神经元损伤;长链非编码 ;氧糖剥夺;大鼠中图法分类号 文献标志码 :,(,;,):():,(),:,(),(),(),(),(),(),(),():,;蚌埠医学
3、院学报 年 月第 卷第 期 缺血缺氧性脑损伤是新生儿较为常见的疾病,其临床病死率高达 ,也是目前新生儿死亡、小儿脑瘫及其他中枢神经系统损害的主要原因,严重威胁新生儿生命健康。研究认为,大脑缺血缺氧影响神经突结构和神经元极性,神经系统损伤是缺血缺氧性脑损伤的主要原因。因此,探究影响神经系统损伤的分子机制并采取相应的干预措施尤为重要。长链非编码 ()和微小()是两类非编码,且 可靶向 调 控 靶 基 因 的 表 达,靶基因这一调控途径在神经系统疾病的发生发展中起重要调控作用。是一种,与多种疾病的发生发展密切相关。研究显示,在低氧状态下通过 轴调节心脏祖细胞的增殖和迁移,可为心肌梗死的治疗提供分子靶
4、点;在脓毒症大鼠肝组织和肝细胞中表达降低,上调其表达通过靶向抑制 并促进 的表达减轻脓毒症大鼠肝损伤。但目前,对缺血缺氧性脑损伤的影响和作用机制还未明确。生物在线软件预测显示,可能靶向调控。有研究显示,在脑皮质损伤大鼠中表达下调,上调其表达可靶向抑制 来抑制肥大细胞死亡,改善脑皮质损伤大鼠的学习和记忆功能。本研究通过体外原代培养大鼠皮质神经元,建立氧糖剥夺()诱 导 的 神 经 元 损 伤 模 型,旨 在 观 察 能否靶向 影响 诱导的神经元损伤,以期为缺血缺氧性脑损伤的治疗提供新的作用靶点。材料与方法 实验动物及试剂 雄性 大鼠,清洁级,日龄,体质量 ,河南省实验动物中心,许可证号:(豫);
5、胎牛血清(),浙江天杭生物科技股份有限公司;培养基和细胞计数试剂盒(),北京索莱宝科技有限公司;试剂盒和 试剂,美国 公司;逆转录试剂盒和 试剂盒,深圳晶美生物工程有限公司;引物、小干扰()、乱序无意义阴性序列()、野生型质粒()和突变型质粒()、模拟物()及对照序列()、抑制剂()及阴性对照序列(),上海生工生物工程有限公司;乳酸脱氢酶()试剂盒,南京建成生物工程研究所;细胞凋亡试剂盒和二喹啉甲酸()蛋白检测试剂盒,上海碧云天生物技术有限公司;兔抗鼠 淋巴细胞瘤()、淋巴细胞瘤 相关蛋白()多克隆抗体,美国 公司;双荧光素酶活性检测试剂盒,美国 公司。方法 细胞培养及转染参照文献方法分离培养
6、大鼠皮质神经元。大鼠脱颈椎处死取脑组织,分离大脑皮层,手术剪剪成 左右的小块,胰蛋白酶 消化 ,终止消化,过 目滤网,离心,弃上清液。加含 的 培养液,接种于 多聚赖氨酸浸泡过夜的 孔培养板中,置于 、湿度 培养箱(常规培养箱)中培养。培养 后,加含 、和 谷氨酰胺的神经培养液培养。以后每 半量换液 次,培养至第 代时用于实验。将神经元以 每 孔 个 接 种 于 孔 板 中,采用 脂质体法,分别转染、共 转 染 与、与。转染时间为 ,然后更换培养基,再培养,收集细胞备用。诱导的神经元损伤模型建立 参照文献方法建立 诱导的神经元损伤模型。将神经元接种于培养板中,培养 后,弃培养基,换为无糖 培养
7、基,并置于 、湿度 培养箱中培养 。细胞分组处理未转染的神经元分为 组和 组,其中 组神经元用常规培养箱培养,组神经元按照 进行 处理。转染、共转染 与、与 的神经元均按照 进行 处理,并分别记为 组、组、组、组、组和 组。检测 和 表达 神经元以 个 孔接种于 孔板中,按 分组处理,培养 后,收集神经元。试剂提取神经元中总,然后逆转录为,最 ,后行 扩增。扩增条件:,共 个循环。引物序列:上游 ,下游 ;上游 ,下游 ;上游 ,下游 ;上游 ,下游 。法计算 相对、相 对 的 表达量。法检测神经元存活率神经元以 个 孔接种于 孔板中,按 分组处理,培养 后,加 试剂。孵育神经元 后,酶标仪
8、处测吸光度值(),并计算神经元存活率。存活率()实验组 对照组。试剂盒检测培养上清液中 水平 神经元以 个 孔接种于 孔板中,按 分组处理,培养 后,收集培养上清液,离心 ,保留上清液。参照 试剂盒说明书,检测上清中 活性,计算其漏出率。漏出率()活性实验组 活性对照组。流式细胞仪检测神经元凋亡神经元以 个 孔接种于 孔板中,按 分组处理,培养 后,收集神经元。清洗神经元 次,参照 试剂盒说明书,用流式细胞仪检测神经元凋亡。法检测 和 蛋白表达 神经元以 个 孔接种于 孔板中,按 分组处理,培养 后,收集神经元。试剂提取神经元中总蛋白,并用 法对蛋白定量。然后以每孔 蛋白行 电泳,并将分离蛋白
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