家蚕几丁质去乙酰化酶BmCDA2的基因表达和免疫定位_何允.pdf

何允 等/家蚕几丁质去乙酰化酶 BmCDA2 的基因表达和免疫定位 Chinese Journal of Biotechnology http:/ Apr.25,2023,39(4):1655-1669 DOI:10.13345/j.cjb.220472 2023 Chin J Biotech,All rights reserved 资助项目：国家自然科学基金(31872429)；重庆市自然科学基金(cstc2021jcyj-msxmX1166)This work was supported by the National Natural Science Foundation of China(31872429)and the Natural Science Foundation of Chongqing(cstc2021jcyj-msxmX1166).*Corresponding author.E-mail: Received:2022-06-14;Accepted:2022-07-28;Published online:2022-08-03 1655 生物工程学报 家蚕几丁质去乙酰化酶 BmCDA2 的基因表达和 免疫定位 何允1,3，陈怡菲1,3，王清浪1,3，张自钰1,3，董浩南1,3，申太霞1,3，侯勇1,3，龚竞1,2*1 西南大学 家蚕基因组生物学国家重点实验室，重庆 400715 2 西南大学 蚕桑纺织与生物质科学学院，重庆 400715 3 西南大学 前沿交叉学科研究院生物学研究中心，重庆 400715 何允,陈怡菲,王清浪,张自钰,董浩南,申太霞,侯勇,龚竞.家蚕几丁质去乙酰化酶 BmCDA2 的基因表达和免疫定位J.生物工程学报,2023,39(4):1655-1669.HE Yun,CHEN Yifei,WANG Qinglang,ZHANG Ziyu,DONG Haonan,SHEN Taixia,HOU Yong,GONG Jing.Gene expression and immunolocalization of chitin deacetylase BmCDA2 in silkwormJ.Chinese Journal of Biotechnology,2023,39(4):1655-1669.摘 要：几丁质的去乙酰化修饰与昆虫的发育变态密切相关，几丁质去乙酰化酶(chitin deacetylase,CDA)是这个过程中的关键酶。家蚕(Bombyx mori)是鳞翅目昆虫的代表性昆虫，目前对家蚕 CDAs的研究较少。为了更好地揭示 BmCDAs 对家蚕变态发育的作用，本研究采用生物信息学分析、蛋白表达纯化以及免疫荧光定位等方法对表皮中高量表达的 BmCDA2 进行了研究。结果发现，BmCDA2有两种 mRNA拼接形式 BmCDA2a和 BmCDA2b，分别在幼虫眠期和化蛹期表皮高量表达，两个基因均有几丁质去乙酰化酶催化结构域(catalytic domain)、几丁质结合结构域(chitin binding domain)和低密度脂蛋白受体结构域(low density lipoprotein receptor domain)；Western blotting 结果显示，该蛋白在表皮存在，荧光免疫定位发现 BmCDA2 蛋白随着幼虫新表皮的生成而逐渐增多，推测 BmCDA2 可能参与了幼虫新表皮的形成。该结果丰富了家蚕 CDAs 的生物学功能信息，也为其他昆虫 CDA 的研究提供一些有价值的参考。关键词：家蚕；几丁质去乙酰化酶 2；原核表达；免疫荧光定位 动物及兽医生物技术 ISSN 1000-3061 CN 11-1998/Q 生物工程学报 Chin J Biotech http:/ 1656 Gene expression and immunolocalization of chitin deacetylase BmCDA2 in silkworm HE Yun1,3,CHEN Yifei1,3,WANG Qinglang1,3,ZHANG Ziyu1,3,DONG Haonan1,3,SHEN Taixia1,3,HOU Yong1,3,GONG Jing1,2*1 State Key Laboratory of Silkworm Genome Biology,Southwest University,Chongqing 400715,China 2 College of Sericulture,Textile and Biomass Sciences,Southwest University,Chongqing 400715,China 3 Biological Science Research Center,Academy for Advanced Interdisciplinary Studies,Southwest University,Chongqing 400715,China Abstract:Deacetylation of chitin is closely related to insect development and metamorphosis.Chitin deacetylase(CDA)is a key enzyme in the process.However,to date,the CDAs of Bombyx mori(BmCDAs),which is a model Lepidopteran insect,were not well studied.In order to better understand the role of BmCDAs in the metamorphosis and development of silkworm,the BmCDA2 which is highly expressed in epidermis was selected to study by bioinformatics methods,protein expression purification and immunofluorescence localization.The results showed that the two mRNA splicing forms of BmCDA2,namely BmCDA2a and BmCDA2b,were highly expressed in the larval and pupal epidermis,respectively.Both genes had chitin deacetylase catalytic domain,chitin binding domain and low density lipoprotein receptor domain.Western blot showed that the BmCDA2 protein was mainly expressed in the epidermis.Moreover,fluorescence immunolocalization showed that BmCDA2 protein gradually increased and accumulated with the formation of larval new epidermis,suggesting that BmCDA2 may be involved in the formation or assembly of larval new epidermis.The results increased our understandings to the biological functions of BmCDAs,and may facilitate the CDA study of other insects.Keywords:Bombyx mori;chitin deacetylase 2;prokaryotic expression;immunofluorescence localization 家蚕是鳞翅目蚕蛾科的代表性昆虫，由野蚕驯化而来，作为一种重要的经济昆虫在我国已经有 5 000 年的饲养历史。同时，家蚕是一种完全变态昆虫，一生会经历卵、幼虫、蛹和成虫 4 个阶段，不同发育阶段昆虫外部形态和内部器官结构功能都会发生极大的变化1。蜕皮是昆虫一个关键的发育过程2-3。昆虫身体的外表皮是一种细胞分泌物，它不会随虫体的增长而增长4。家蚕幼虫阶段分为 5 个龄期，每次在新旧龄期交替的时候旧表皮蜕去，新表皮生成；末龄幼虫上簇结茧后将完成从幼虫到蛹的变态发育，如果不能正常蜕皮，轻则影响生长发育进程，严重的情况将直接导致蚕体死亡。家蚕表皮主要是由角质层蛋白和几丁质微纤维组成5。几丁质广泛存在于甲壳类动物、昆虫和真菌中6。对昆虫而言，几丁质是其表皮、中肠围食膜、脂肪体基底膜、翅原基基底膜、丝腺基底膜等的主要结构成分，在昆虫的外骨骼系统和营养基质中扮演重要的角色7。而几丁质微纤维是由几丁质前体经过去乙酰化修饰而形成8，去乙酰化 何允 等/家蚕几丁质去乙酰化酶 BmCDA2 的基因表达和免疫定位 ：010-64807509： 1657 程度的差异将决定昆虫表皮的溶解性和软硬程度。这个过程受到几丁质去乙酰化酶(chitin deacetylase,CDA)的作用9。该酶具有一个保守的结构区域几丁质去乙酰化酶催化结构域(catalytic domain,CDA)，并与根瘤菌结节蛋白(Nod)具有显著的相似性。除此之外，一些 CDA 还可能具有几丁质结合结构域(chitin binding domain,ChBD)和低密度脂蛋白受体结构域(low density lipoprotein receptor domain,LDLa)。基于系统发育分析和结构域的存在将昆虫的 CDAs 分为 5 类：第 1 类和第 2类含有以上 3 种结构域；第 3 类和第 4 类有 CDA和 ChBD 结构域，但没有 LDLa 结构域；而第 5类只含有 CDA 结构域10-11。近年来，在许多昆虫中发现了 CDA 的存在，包括冈比亚按蚊(Anopheles gambiae)10、意 蜂(Apis mellifera)10、赤 拟 谷 盗(Tribolium castaneum)10、黑腹果蝇(Drosophila melanogaste)12-13等。不同的 CDA 在不同的组织中行使着不同的功能：在表皮中 CDA 通过修饰表皮几丁质纤维束，来维持表皮结构的完整，从而维持了昆虫的正常生长和发育14-15。与中肠围食膜相关的CDA 只在摄食的幼虫中肠组织中被检测到，当幼虫在后期停止摄食时，这种蛋白质在中肠组织中消失16；推测该蛋白可能参与了消化酶的固定化，从而保护肠道免受寄生虫的侵袭，并拦截凝集素等毒素对昆虫的伤害16-17。家蚕中一共鉴定到 8 个 CDA 基因：BmCDA1BmCDA8。之前报道仅对 BmCDA7 进行了研究18，发现该酶在中肠的围食膜中表达，可能会引起围食膜通透性的改变。在前期研究中，我们发现 BmCDA2 基因特异地在表皮中表达，同时受到蜕皮激素(20-hydroxyecdysone,20E)的诱导19，推测 BmCDA2 与家蚕蜕皮、变态 的 生 物 学 过 程 有 关。为 了 更 好 地 揭 示BmCDAs 在家蚕变态发育中起到的作用，本研究以 BmCDA2 为切入点，研究 BmCDA2 序列特征，并对 BmCDA2 蛋白进行原核表达纯化以及免疫荧光定位，探索 BmCDA2 的生物学功能，该结果为家蚕变态发育机制研究提供了新思路，为其他昆虫CDA的研究提供一些有价值的参考。1 材料与方法 1.1 材料 1.1.1 实验昆虫 本实验的家蚕品种大造(Dazao)由西南大学前沿交叉学科研究院生物学研究中心提供。幼蚕孵化后在温度为(251)C 的培养箱中生长发育，并采用新鲜的桑叶饲喂。取家蚕 5 龄第 3 天幼虫各组织和 4 龄起至蛾期的表皮作为材料，保存在80 C 冰箱待用。1.1.2 试剂耗材 总 RNA 提取用 MiniBEST Universal RNA 提取试剂盒，反转录 cDNA 采用 PrimeScript RT reagent Kit with gDNA Eraser 试剂盒，PCR体系所用 DNA 聚合酶为 PrimeSTAR Max DNA Polymerase，以上试剂均购自 TaKaRa 公司。pMD19-T 载体与原核表达载体 pET-28a为西南大学前沿交叉学科研究院生物学研究中心保存。胶回收试剂盒 Gel Extraction Kit购自 Omega Bio-Tek 公司，卡纳青霉素购自生工生物工程(上海)股份有限公司，大肠杆菌(Escherichia coli)BL21(DE3)和 Trans1-T1 感受态菌株均购自北京全式金生物技术股份有限公司。T4 DNA 连接酶与限制性内切酶 Xho I 和Hind 均购自 NEB，IPTG 购自 BBI，考马斯亮蓝 R-250 购自北京索莱宝科技有限公司，Bradford 蛋白浓度测定试剂盒(去垢剂兼容型)与 DAPI 染色液购自上海碧云天生物技术有限公司，封闭用羊血清购自北京中杉金桥生物技术有限公司，FITC 标记 WGA(几丁质染色液)ISSN 1000-3061 CN 11-1998/Q 生物工程学报 Chin J Biotech http:/ 1658 购自 Sigma，引物合成和测序均由华大基因科技有限公司完成，抗体由武汉金开瑞生物工程有限公司制备。1.2 方法 1.2.1 基因 qRT-PCR 检测和克隆鉴定 利用报道过的 BmCDA2 基因序列在 NCBI(http:/www.ncbi.nlm.nih.gov/)以 及SilkBase(http:/silkbase.ab.a.u-tokyo.ac.jp/cgi-bin/)进 行 检索，检索之后用引物设计软件 Primer Premier 5.0设计 BmCDA2a 和 BmCDA2b 荧光定量 PCR 引物、BmCDA2a 添加限制性内切酶位点 Xho、Hind 的克隆引物和内参引物 sw2293420(表 1)。以家蚕 4 龄第 1 天、4 龄第 2 天、4 龄第 3 天、4 龄眠、5 龄起蚕、5 龄第 1 天、5 龄第 3 天、5龄第 5 天、5 龄第 7 天、预蛹、化蛹后第 1 天、蛹3 天、蛹 5 天的表皮的 cDNA 为模板开展荧光定量 PCR(qRT-PCR)分析。qRT-PCR 反应程序设定：95 C 预变性 30 s；95 C 变性 3 s，60 C 延伸 30 s，40 个循环。反应结束后，对数据进行收集和分析。在 BmCDA2a 表达载体构建实验中，以家蚕 4 龄表皮 cDNA 为模板进行 PCR 扩增。循环参数为：98 C 预变性 2 min；98 C 变性 15 s，55 C 退火 15 s，72 C 延伸 1 min，30 个循环；72 C 延伸 5 min。然后产物经 1.2%琼脂糖电泳后检测产物大小。对目的 DNA 片段切胶回收，再与 pMD19-T 载体连接，将连接产物转化到E.coli Trans1-T1 感受态细胞中，通过菌液 PCR筛选阳性克隆并进行测序鉴定。1.2.2 蛋白的生物信息学分析 利用 SignalP 5.0(https:/services.healthtech.dtu.dk/service.php?SignalP-5.0)预测 BmCDA2a和 BmCDA2b 蛋白质的信号肽区域，PROSITE(https:/prosite.expasy.org/)预测磷酸化位点和糖基化位点，蛋白质保守结构域数据库(conserved domain database,CDD)(https:/www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/)预测结构域，ProtScale(https:/web.expasy.org/protscale/)对蛋白亲疏水性进行预测。以 BmCDA2 为检索序列，采用 NCBI BLAST 工具收集部分真菌、细菌、家蚕和其他节肢动物中的 CDA 序列，在 DNAMAN 中进行氨基酸多序列比对，在 TBtools 软件中进行建树，建树方法为最大似然法，检验 5 000 次。利用在线网站 Robetta(https:/robetta.bakerlab.org/)对蛋白质 BmCDA2a 和 BmCDA2b 的三维结构进行预测，并用 PyMOLWin 软件作图并导出。1.2.3 原核表达载体构建 将测序正确的重组载体和 pET-28a 原核表达载体用限制性内切酶 Xho I 和 Hind 双酶切 表 1 本文所用引物 Table 1 Primers used in this study Primer name Primer sequence(53)Use BmCDA2a-F GAGAACAGCGTCACCAGGCTC qRT-PCR BmCDA2a-R TTGTCAACATTCACAGCACCG BmCDA2b-F AGATAACTTGCCCGTCTGGATT qRT-PCR BmCDA2b-R AGGTAGGACGCACTGGTTAGGA sw22934-F TTCGTACTGGCTCTTCTCGT qRT-PCR sw22934-R CAAAGTTGATAGCAATTCCCT BmCDA2a-F CCGCTCGAGTCTCGTGTGAAGCGACAAGATG ORF cloning and vector construction BmCDA2a-R CCCAAGCTTTCACTTCTTAACGTTGTATCCTT Restriction sites are highlighted with underline.何允 等/家蚕几丁质去乙酰化酶 BmCDA2 的基因表达和免疫定位 ：010-64807509： 1659 后，酶切产物经 1%琼脂糖凝胶电泳后，分别切胶回收 BmCDA2a 和 pET-28a 目的 DNA 片段。回收产物用 T4 DNA 连接酶连接过夜，后转化至E.coli Trans1-T1 感受态细胞，采用菌液 PCR 和双酶切验证，将阳性克隆送到华大基因科技有限公司测序。结果正确后菌液扩大培养提取质粒，质粒命名为：pET-28a-BmCDA2a，保存在20 C备用。1.2.4 蛋白表达纯化及抗体制备 将测序正确的重组质粒 pET-28a-BmCDA2a和空载质粒分别转化至原核表达菌株 E.coli BL21(DE3)中，涂板挑取单克隆菌落到 2YT 液体培养基(kana 抗性)，37 C、220 r/min 扩大培养，至OD600为0.61.0之间，加入终浓度为0.1 mmol/L的 IPTG 进行诱导；以 pET-28a 空载作为对照。室温下 8 000 r/min 离心 10 min，弃上清留菌体，沉淀用 Binding Buffer 1(20 mmol/L Tris-HCl,200 mmol/L NaCl,pH 8.0)重悬。液氮冻融冰上超声破碎离心，分别收集上清和沉淀，沉淀用等体积 Binding Buffer 1 重悬。利用浓度为 12%的十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶(SDS-PAGE)对上清组分和沉淀组分进行电泳分析，电泳结束后进行考马斯亮蓝染色分析。对包涵体蛋白进行纯化。取含有 8 mol/L 尿素的 Binding buffer 2(8 mol/L 尿素,20 mmol/L Tris-HCl,200 mmol/L NaCl,pH 8.0)，加入到收集的沉淀中，用磁力搅拌器低速搅拌过夜，使沉淀充分溶解。12 000 r/min 室温离心 20 min，收集上清。采用镍柱亲和层析进行蛋白纯化，采用含有 20、50、100、200、500 mmol/L 和 1 mol/L浓度的咪唑溶液进行洗脱。将收集到的原液、流穿液、梯度洗脱的收集液进行 SDS-PAGE 分析。将收集到的重组蛋白样品进行浓缩，并采用制备型电泳及切胶电洗脱的方法回收蛋白：SDS-PAGE 电泳结束后，用考马斯亮蓝染色切胶置于 PBS 缓冲液中，利用磁力搅拌器低速搅拌，每 8 h 更换一次缓冲液，更换 3 次，透析袋内溶液即为重组蛋白，收集袋内溶液，蛋白电泳检测纯度，并测定蛋白浓度；浓度纯度达到要求后，送公司制备抗体：选用无特定病原体(specific pathogen free,SPF)级健康雌性 4 月龄的日本大耳兔，经过免疫 34 次，每次免疫时间 23 周，制备抗血清，用亲和层析柱进行抗体纯化。1.2.5 家蚕组织 Western blotting 检测及免疫荧光定位 取家蚕 5 龄第 3 天各组织提取蛋白，并用 Bradford 法测定总蛋白浓度。将各组织蛋白样品按 20 g/孔上样进行 SDS-PAGE，电泳结束后转膜，回收滤纸并将 PVDF 膜轻轻放入封闭液中，60 r/min、37 C 孵育 1 h 封闭。加入一抗封闭液(含 1:20 000 体积比的BmCDA2 一抗)，37 C 低速旋转孵育 1 h，结束后，TBST 洗膜 3 次，每次 10 min；加入二抗封闭液(含 1:40 000 体积比的山羊抗兔二抗)，37 C 低速旋转孵育 1 h，结束后，TBST 洗膜 3 次，每次 10 min。进行化学发光显影。在免疫荧光定位实验中，将家蚕 4 龄幼虫蜕皮各时期的表皮进行组织切片，置于免疫组化孵育盒中，室温下晾干 20 min，滴加 PBST浸润组织 510 min。向组织切片表面滴加封闭液(1PBS+1%BSA+1/10 体积羊血清)，使其完全浸没组织，室温封闭 2 h。分别用一抗稀释液(含 1:1 000 体积比的 BmCDA2 一抗)和二抗稀释液(含 1:500 体积比的 Cy3 标记的山羊抗兔二抗)对其进行孵育。然后在避光条件下进行几丁质染色液与 DAPI 染色液染色，封片后在荧光显微镜下观察拍照。ISSN 1000-3061 CN 11-1998/Q 生物工程学报 Chin J Biotech http:/ 1660 2 结果与分析 2.1 BmCDA2a 和 BmCDA2b 的时期表达特征分析 基于已知昆虫的 CDA2 序列信息，通过同源比对在 NCBI 中获得家蚕 CDA2 的两个不同转录本，分析发现与其他昆虫中类似，这两个转录本也是可变剪切体，将其分别命名为BmCDA2a 和 BmCDA2b。分析发现，BmCDA2a mRNA 由 exon 1、exon 2、exon 3、exon 5 和 exon 6，5 个外显子剪接形成，缺少 exon 4(图 1A)；BmCDA2b mRNA 由 exon 1、exon 2、exon 4、exon 5 和 exon 6，5 个外显子剪接形成，缺少exon 3。两个转录本均为外显子遗漏类型，在 5端和 3端完全相同，差异仅表现在序列中间的第 3 个外显子不同。利用 qRT-PCR 技术，对家蚕不同时期BmCDA2a、BmCDA2b 在表皮的表达情况进行检测，结果显示：在 4 龄与 5 龄的幼虫期，BmCDA2a 的表达水平较高，且眠期蜕皮时的表达水平为最高表达之后逐渐回落(图 1B)；而 BmCDA2b 表达量在幼虫的眠期和蛹期较高，其中蛹期 BmCDA2b 的表达水平高于BmCDA2a，且在化蛹后有下降趋势。推测BmCDA2a 在家蚕幼虫和蛹期的表皮中发挥作用，而 BmCDA2b 主要在眠期和蛹期的表皮中发挥作用。2.2 BmCDA2 蛋白聚类进化分析 为了研究 BmCDA2 与其他物种中 CDA 的进化关系，选取真菌、细菌、家蚕和其他节肢动物中的 CDA 序列进行多序列比对。结果显示，BmCDA2a 和 BmCDA2b 都包含 ChBD、LDLa 和 CDA 这 3 个结构域(图 2)，它们之间的区别仅在于由第 3 外显子和第 4 外显子构成的ChBD 的 20 个氨基酸残基不同，推测 BmCDA2a和 BmCDA2b 在与几丁质结合时可能存在差 图 1 BmCDA2a 和 BmCDA2b 基因结构和时期表达分析 Figure 1 Analysis of gene structure and expression pattern of BmCDA2a and BmCDA2b.4L1:Day 1 of 4th instar larvae;4L2:Day 2 of 4th instar larvae;4L3:Day 3 of 4th instar larvae;4M:4th molt;5L0:Newly molted 5th instar larvae;5L1:Day 1 of 5th instar larvae;5L3:Day 3 of 5th instar larvae;5L5:Day 5 of 5th instar larvae;5L7:Day 7 of 5th instar larvae;PP:Pre-pupa;P1:Day 1 of pupa;P3:Day 3 of pupa;P5:Day 5 of pupa.何允 等/家蚕几丁质去乙酰化酶 BmCDA2 的基因表达和免疫定位 ：010-64807509： 1661 图 2 不同生物 CDA2 氨基酸序列的多重序列比对 Figure 2 Multiple alignment of CDA2 amino acid sequences in different organisms.The chitin binding domain was highlighted in asterisk,low density lipoprotein receptor domain was highlighted in line,and catalytic domain was highlighted in double lines;The 3rd exon was highlighted in green box,the 4th exon was highlighted in red box,and the motifs were highlighted in black boxes;Bm:Bombyx mori;Lm:Locusta migratoria;Se:Spodoptera exigua;Ms:Manduca sexta;Nl:Nilaparvata lugens;Sl:Spodoptera litura;Tc:Tribolium castaneum;Kp:Klebsiella pneumoniae;Rm:Rhizopus microsporus.异，从而导致二者发挥功能的差异；BmCDA2a、BmCDA2b 与其他节肢动物的 CDA 相比较，CDA 结构域的 motif 15 区域相对保守，而对于细菌和真菌来讲，motif 13 区域保守，motif 45 区域不保守。进化分析表明，家蚕BmCDA2a、BmCDA2b 蛋白与鳞翅目昆虫几丁质去乙酰酶亲缘关系最近，首先与甜菜夜蛾聚在了一起，然后与其他节肢动物聚为一支，几丁质去乙酰酶在细菌真菌各聚为一支(图 3)。2.3 BmCDA2 蛋白序列分析 BmCDA2a 蛋白预测的分子量为 61.54 kDa，等电点 pI 为 5.04，具有 8 个潜在磷酸化修饰位点，一个潜在的糖基化修饰位点；BmCDA2b蛋白预测的分子量为 60.86 kDa，等电点 pI ISSN 1000-3061 CN 11-1998/Q 生物工程学报 Chin J Biotech http:/ 1662 为 5.27，磷酸化修饰位点和糖基化修饰位点跟 BmCDA2a 蛋白一致(表 2)。亲疏水性分析发现，BmCDA2a 蛋白和 BmCDA2b 蛋白亲水氨基酸在整个肽链中的分布占比较多，疏水氨基酸相对较少，分别占总氨基酸的 70.65%和 29.35%，在第 10 位氨基酸分值最高为3.167，在第 440 位氨基酸分值最低为3.200(图 4A、4B)。而两者在 6587 区域亲/疏水性有较大差异，此区域其氨基酸亲/疏水分值最低 峰 都 在 第 68 位 氨 基 酸，BmCDA2a 为1.489，BmCDA2b 则为1.333；最高峰都在第85 位 氨 基 酸，BmCDA2a 为1.056，BmCDA2b 为 1.322；并且从 6885 位两者氨基 酸 亲/疏 水 分 值 都 呈 上 升 趋 势，但BmCDA2b 的上升趋势更剧烈，这些差异可能导致两种蛋白的功能产生差异。图 3 节肢动物、真菌和细菌的 CDA 系统进化树 Figure 3 Phylogenetic trees of CDA from arthropods,fungi and bacteria.Rm:Rhizopus microsporus;Rma:Rhizopus microsporus ATCC 52813;Bd:Batrachochytrium dendrobatidis;Ab:Acinetobacter baumannii;Ec:Escherichia coli;Eh:Enterobacter hormaechei;Se:Spodoptera exigua;Tc:Tribolium castaneum;Lm:Locusta migratoria;Nl:Nilaparvata lugens;Aa:Aedes albopictus;Bm:Bombyx mori.表 2 BmCDA2a、BmCDA2b 的蛋白性质 Table 2 Comparison of basic information of BmCDA2a and BmCDA2b Protein property Protein name BmCDA2a BmCDA2b Protein serial No.(NCBI)NP_001103795.1 NP_001103796.1 mRNA length(nt)2 153 2 135 Amino acid length(aa)543 537 Molecular weight(kDa)61.54 60.86 Theoretical pI 5.04 5.27 Phosphorylation modification site T55,T265,S277,T384,S437,S478,T507,T520 T55,T259,S271,T378,S431,S472,T501,T514 Glycosylation modification site N297 N291 何允 等/家蚕几丁质去乙酰化酶 BmCDA2 的基因表达和免疫定位 ：010-64807509： 1663 图 4 BmCDA2a(A、C)和 BmCDA2b(B、D)蛋白亲/疏水性分析和预测蛋白三维结构 Figure 4 Hydrophilic/hydrophobic analysis and three-dimensional structure of BmCDA2a(A,C)and BmCDA2b(B,D)proteins.The abscissa is the sequence position and the ordinate is the scale value of the amino acid(0 means hydrophobicity,0 means hydrophilicity).利用 Robetta 在线网站和 PyMOLWin 软件对家蚕两个 CDA2 蛋白的三维结构进行全长预测，结果如图 4 所示，BmCDA2a 与 BmCDA2b的蛋白三维结构中的主要空间结构由-螺旋、旋转角和无规则卷曲构成(图 4C、4D)，整体上较为相似；根据多序列比对结果可知，两个 CDA2蛋白间的差异序列位于 N 端的 ChBD 结构域，三维结构预测显示 BmCDA2a 有 4 个折叠和一个螺旋，BmCDA2b 有 2 个折叠，两者差异较大。蛋白结构的差异可能导致两个蛋白的功能分化，在家蚕不同发育时期发挥的功能有差异。2.4 BmCDA2a 基因的克隆与分析 对 BmCDA2a 进行克隆表达分析。以家蚕品种大造 4 龄表皮的 cDNA 为模板，用带有限制性内切酶位点的引物进行 PCR 扩增，PCR 产物的大小采用 1%琼脂糖凝胶电泳检测。结果显示，在 1 000 bp 和 2 000 bp 之间有一条特异性条带，和预期片段相符(图 5A)。对该 PCR 产物进行切胶回收，连接 pMD19-T 载体后转化 E.coli，筛选出阳性克隆进行测序，得到CDS长度为1 632 bp，编码 543 个氨基酸，具备信号肽区域、磷酸化修饰位点和糖基化修饰位点(图 5B)。比对结果表明，BmCDA2 基因克隆序列和家蚕 SilkDB 数据库预测基因序列一致。2.5 重组质粒 pET-28a-BmCDA2a 的构建和鉴定 将克隆成功的质粒，利用限制性内切酶Xho、Hind 将 BmCDA2a 基因片段重组到 pET-28a 原核表达载体中，筛选重组成功的菌株。对筛选阳性的质粒进行双酶切鉴定，结果显示，阳性质粒酶切后出现目的基因大小的片段，同时双酶切后的载体片段和空质 ISSN 1000-3061 CN 11-1998/Q 生物工程学报 Chin J Biotech http:/ 1664 图 5 家蚕 BmCDA2a 基因的克隆(A)及分析(B)Figure 5 Cloning and analysis of BmCDA2a gene.A:PCR amplification of the BmCDA2a gene.B:The ORF sequence of BmCDA2a gene and its deduced amino acids,the signal peptide region was highlighted in the black box,phosphorylation modification sites were highlighted in grey,and glycosylation modification site was highlighted in dot.粒 pET-28a 的大小一致(图 6)。然后将该阳性质粒进行测序验证，结果表明，序列与克隆序列相同，说明成功构建 pET-28a-BmCDA2a表达载体。2.6 BmCDA2a 蛋白表达、纯化及抗体制备 为了获取 BmCDA2a 蛋白，将表达载体 pET28a-BmCDA2a 转至大肠杆菌 BL21(DE3)中，通过 IPTG 在不同温度下的诱导，使大肠杆菌表达 BmCDA2a 蛋白。结果显示，将获取的蛋白通过超声破碎并通过 SDS-PAGE 分析，检测到 BmCDA2a 蛋白主要在 16 C 和 37 C 沉淀组分中约 64 kDa 处出现特异性的清晰条带(图 7)，而空载对照菌株 16 C 和 37 C 上清组分中均无条带出现，说明诱导的重组 BmCDA2a蛋白主要以包涵体的形式存在。且 37 C 条件下，蛋白表达量更高。在确定最佳诱导条件之后，进行重组表达载体 pET28a-BmCDA2a 表达菌株的扩大培养。将收集到的沉淀溶解后，通过 Ni 柱亲和层析的方法对 pET28a-BmCDA2a 表达菌株表达的蛋白 图 6 BmCDA2a 双酶切检测 Figure 6 BmCDA2a gene detection of restriction enzyme digestion.M:DNA Marker;1:Empty plasmid of pET-28a;2:pET-28a was digested by enzyme(Xho,H