家蚕几丁质去乙酰化酶BmCDA2的基因表达和免疫定位_何允.pdf
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1、 何允 等/家蚕几丁质去乙酰化酶 BmCDA2 的基因表达和免疫定位 Chinese Journal of Biotechnology http:/ Apr.25,2023,39(4):1655-1669 DOI:10.13345/j.cjb.220472 2023 Chin J Biotech,All rights reserved 资助项目:国家自然科学基金(31872429);重庆市自然科学基金(cstc2021jcyj-msxmX1166)This work was supported by the National Natural Science Foundation of Chin
2、a(31872429)and the Natural Science Foundation of Chongqing(cstc2021jcyj-msxmX1166).*Corresponding author.E-mail: Received:2022-06-14;Accepted:2022-07-28;Published online:2022-08-03 1655 生物工程学报 家蚕几丁质去乙酰化酶 BmCDA2 的基因表达和 免疫定位 何允1,3,陈怡菲1,3,王清浪1,3,张自钰1,3,董浩南1,3,申太霞1,3,侯勇1,3,龚竞1,2*1 西南大学 家蚕基因组生物学国家重点实验室,重
3、庆 400715 2 西南大学 蚕桑纺织与生物质科学学院,重庆 400715 3 西南大学 前沿交叉学科研究院生物学研究中心,重庆 400715 何允,陈怡菲,王清浪,张自钰,董浩南,申太霞,侯勇,龚竞.家蚕几丁质去乙酰化酶 BmCDA2 的基因表达和免疫定位J.生物工程学报,2023,39(4):1655-1669.HE Yun,CHEN Yifei,WANG Qinglang,ZHANG Ziyu,DONG Haonan,SHEN Taixia,HOU Yong,GONG Jing.Gene expression and immunolocalization of chitin deace
4、tylase BmCDA2 in silkwormJ.Chinese Journal of Biotechnology,2023,39(4):1655-1669.摘 要:几丁质的去乙酰化修饰与昆虫的发育变态密切相关,几丁质去乙酰化酶(chitin deacetylase,CDA)是这个过程中的关键酶。家蚕(Bombyx mori)是鳞翅目昆虫的代表性昆虫,目前对家蚕 CDAs的研究较少。为了更好地揭示 BmCDAs 对家蚕变态发育的作用,本研究采用生物信息学分析、蛋白表达纯化以及免疫荧光定位等方法对表皮中高量表达的 BmCDA2 进行了研究。结果发现,BmCDA2有两种 mRNA拼接形式 Bm
5、CDA2a和 BmCDA2b,分别在幼虫眠期和化蛹期表皮高量表达,两个基因均有几丁质去乙酰化酶催化结构域(catalytic domain)、几丁质结合结构域(chitin binding domain)和低密度脂蛋白受体结构域(low density lipoprotein receptor domain);Western blotting 结果显示,该蛋白在表皮存在,荧光免疫定位发现 BmCDA2 蛋白随着幼虫新表皮的生成而逐渐增多,推测 BmCDA2 可能参与了幼虫新表皮的形成。该结果丰富了家蚕 CDAs 的生物学功能信息,也为其他昆虫 CDA 的研究提供一些有价值的参考。关键词:家蚕;
6、几丁质去乙酰化酶 2;原核表达;免疫荧光定位 动物及兽医生物技术 ISSN 1000-3061 CN 11-1998/Q 生物工程学报 Chin J Biotech http:/ 1656 Gene expression and immunolocalization of chitin deacetylase BmCDA2 in silkworm HE Yun1,3,CHEN Yifei1,3,WANG Qinglang1,3,ZHANG Ziyu1,3,DONG Haonan1,3,SHEN Taixia1,3,HOU Yong1,3,GONG Jing1,2*1 State Key Lab
7、oratory of Silkworm Genome Biology,Southwest University,Chongqing 400715,China 2 College of Sericulture,Textile and Biomass Sciences,Southwest University,Chongqing 400715,China 3 Biological Science Research Center,Academy for Advanced Interdisciplinary Studies,Southwest University,Chongqing 400715,C
8、hina Abstract:Deacetylation of chitin is closely related to insect development and metamorphosis.Chitin deacetylase(CDA)is a key enzyme in the process.However,to date,the CDAs of Bombyx mori(BmCDAs),which is a model Lepidopteran insect,were not well studied.In order to better understand the role of
9、BmCDAs in the metamorphosis and development of silkworm,the BmCDA2 which is highly expressed in epidermis was selected to study by bioinformatics methods,protein expression purification and immunofluorescence localization.The results showed that the two mRNA splicing forms of BmCDA2,namely BmCDA2a a
10、nd BmCDA2b,were highly expressed in the larval and pupal epidermis,respectively.Both genes had chitin deacetylase catalytic domain,chitin binding domain and low density lipoprotein receptor domain.Western blot showed that the BmCDA2 protein was mainly expressed in the epidermis.Moreover,fluorescence
11、 immunolocalization showed that BmCDA2 protein gradually increased and accumulated with the formation of larval new epidermis,suggesting that BmCDA2 may be involved in the formation or assembly of larval new epidermis.The results increased our understandings to the biological functions of BmCDAs,and
12、 may facilitate the CDA study of other insects.Keywords:Bombyx mori;chitin deacetylase 2;prokaryotic expression;immunofluorescence localization 家蚕是鳞翅目蚕蛾科的代表性昆虫,由野蚕驯化而来,作为一种重要的经济昆虫在我国已经有 5 000 年的饲养历史。同时,家蚕是一种完全变态昆虫,一生会经历卵、幼虫、蛹和成虫 4 个阶段,不同发育阶段昆虫外部形态和内部器官结构功能都会发生极大的变化1。蜕皮是昆虫一个关键的发育过程2-3。昆虫身体的外表皮是一种细胞分泌
13、物,它不会随虫体的增长而增长4。家蚕幼虫阶段分为 5 个龄期,每次在新旧龄期交替的时候旧表皮蜕去,新表皮生成;末龄幼虫上簇结茧后将完成从幼虫到蛹的变态发育,如果不能正常蜕皮,轻则影响生长发育进程,严重的情况将直接导致蚕体死亡。家蚕表皮主要是由角质层蛋白和几丁质微纤维组成5。几丁质广泛存在于甲壳类动物、昆虫和真菌中6。对昆虫而言,几丁质是其表皮、中肠围食膜、脂肪体基底膜、翅原基基底膜、丝腺基底膜等的主要结构成分,在昆虫的外骨骼系统和营养基质中扮演重要的角色7。而几丁质微纤维是由几丁质前体经过去乙酰化修饰而形成8,去乙酰化 何允 等/家蚕几丁质去乙酰化酶 BmCDA2 的基因表达和免疫定位 :01
14、0-64807509: 1657 程度的差异将决定昆虫表皮的溶解性和软硬程度。这个过程受到几丁质去乙酰化酶(chitin deacetylase,CDA)的作用9。该酶具有一个保守的结构区域几丁质去乙酰化酶催化结构域(catalytic domain,CDA),并与根瘤菌结节蛋白(Nod)具有显著的相似性。除此之外,一些 CDA 还可能具有几丁质结合结构域(chitin binding domain,ChBD)和低密度脂蛋白受体结构域(low density lipoprotein receptor domain,LDLa)。基于系统发育分析和结构域的存在将昆虫的 CDAs 分为 5 类:第
15、1 类和第 2类含有以上 3 种结构域;第 3 类和第 4 类有 CDA和 ChBD 结构域,但没有 LDLa 结构域;而第 5类只含有 CDA 结构域10-11。近年来,在许多昆虫中发现了 CDA 的存在,包括冈比亚按蚊(Anopheles gambiae)10、意 蜂(Apis mellifera)10、赤 拟 谷 盗(Tribolium castaneum)10、黑腹果蝇(Drosophila melanogaste)12-13等。不同的 CDA 在不同的组织中行使着不同的功能:在表皮中 CDA 通过修饰表皮几丁质纤维束,来维持表皮结构的完整,从而维持了昆虫的正常生长和发育14-15。与
16、中肠围食膜相关的CDA 只在摄食的幼虫中肠组织中被检测到,当幼虫在后期停止摄食时,这种蛋白质在中肠组织中消失16;推测该蛋白可能参与了消化酶的固定化,从而保护肠道免受寄生虫的侵袭,并拦截凝集素等毒素对昆虫的伤害16-17。家蚕中一共鉴定到 8 个 CDA 基因:BmCDA1BmCDA8。之前报道仅对 BmCDA7 进行了研究18,发现该酶在中肠的围食膜中表达,可能会引起围食膜通透性的改变。在前期研究中,我们发现 BmCDA2 基因特异地在表皮中表达,同时受到蜕皮激素(20-hydroxyecdysone,20E)的诱导19,推测 BmCDA2 与家蚕蜕皮、变态 的 生 物 学 过 程 有 关。
17、为 了 更 好 地 揭 示BmCDAs 在家蚕变态发育中起到的作用,本研究以 BmCDA2 为切入点,研究 BmCDA2 序列特征,并对 BmCDA2 蛋白进行原核表达纯化以及免疫荧光定位,探索 BmCDA2 的生物学功能,该结果为家蚕变态发育机制研究提供了新思路,为其他昆虫CDA的研究提供一些有价值的参考。1 材料与方法 1.1 材料 1.1.1 实验昆虫 本实验的家蚕品种大造(Dazao)由西南大学前沿交叉学科研究院生物学研究中心提供。幼蚕孵化后在温度为(251)C 的培养箱中生长发育,并采用新鲜的桑叶饲喂。取家蚕 5 龄第 3 天幼虫各组织和 4 龄起至蛾期的表皮作为材料,保存在80 C
18、 冰箱待用。1.1.2 试剂耗材 总 RNA 提取用 MiniBEST Universal RNA 提取试剂盒,反转录 cDNA 采用 PrimeScript RT reagent Kit with gDNA Eraser 试剂盒,PCR体系所用 DNA 聚合酶为 PrimeSTAR Max DNA Polymerase,以上试剂均购自 TaKaRa 公司。pMD19-T 载体与原核表达载体 pET-28a为西南大学前沿交叉学科研究院生物学研究中心保存。胶回收试剂盒 Gel Extraction Kit购自 Omega Bio-Tek 公司,卡纳青霉素购自生工生物工程(上海)股份有限公司,大肠
19、杆菌(Escherichia coli)BL21(DE3)和 Trans1-T1 感受态菌株均购自北京全式金生物技术股份有限公司。T4 DNA 连接酶与限制性内切酶 Xho I 和Hind 均购自 NEB,IPTG 购自 BBI,考马斯亮蓝 R-250 购自北京索莱宝科技有限公司,Bradford 蛋白浓度测定试剂盒(去垢剂兼容型)与 DAPI 染色液购自上海碧云天生物技术有限公司,封闭用羊血清购自北京中杉金桥生物技术有限公司,FITC 标记 WGA(几丁质染色液)ISSN 1000-3061 CN 11-1998/Q 生物工程学报 Chin J Biotech http:/ 1658 购自
20、Sigma,引物合成和测序均由华大基因科技有限公司完成,抗体由武汉金开瑞生物工程有限公司制备。1.2 方法 1.2.1 基因 qRT-PCR 检测和克隆鉴定 利用报道过的 BmCDA2 基因序列在 NCBI(http:/www.ncbi.nlm.nih.gov/)以 及SilkBase(http:/silkbase.ab.a.u-tokyo.ac.jp/cgi-bin/)进 行 检索,检索之后用引物设计软件 Primer Premier 5.0设计 BmCDA2a 和 BmCDA2b 荧光定量 PCR 引物、BmCDA2a 添加限制性内切酶位点 Xho、Hind 的克隆引物和内参引物 sw22
21、93420(表 1)。以家蚕 4 龄第 1 天、4 龄第 2 天、4 龄第 3 天、4 龄眠、5 龄起蚕、5 龄第 1 天、5 龄第 3 天、5龄第 5 天、5 龄第 7 天、预蛹、化蛹后第 1 天、蛹3 天、蛹 5 天的表皮的 cDNA 为模板开展荧光定量 PCR(qRT-PCR)分析。qRT-PCR 反应程序设定:95 C 预变性 30 s;95 C 变性 3 s,60 C 延伸 30 s,40 个循环。反应结束后,对数据进行收集和分析。在 BmCDA2a 表达载体构建实验中,以家蚕 4 龄表皮 cDNA 为模板进行 PCR 扩增。循环参数为:98 C 预变性 2 min;98 C 变性
22、15 s,55 C 退火 15 s,72 C 延伸 1 min,30 个循环;72 C 延伸 5 min。然后产物经 1.2%琼脂糖电泳后检测产物大小。对目的 DNA 片段切胶回收,再与 pMD19-T 载体连接,将连接产物转化到E.coli Trans1-T1 感受态细胞中,通过菌液 PCR筛选阳性克隆并进行测序鉴定。1.2.2 蛋白的生物信息学分析 利用 SignalP 5.0(https:/services.healthtech.dtu.dk/service.php?SignalP-5.0)预测 BmCDA2a和 BmCDA2b 蛋白质的信号肽区域,PROSITE(https:/pros
23、ite.expasy.org/)预测磷酸化位点和糖基化位点,蛋白质保守结构域数据库(conserved domain database,CDD)(https:/www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/)预测结构域,ProtScale(https:/web.expasy.org/protscale/)对蛋白亲疏水性进行预测。以 BmCDA2 为检索序列,采用 NCBI BLAST 工具收集部分真菌、细菌、家蚕和其他节肢动物中的 CDA 序列,在 DNAMAN 中进行氨基酸多序列比对,在 TBtools 软件中进行建树,建树方法为最大似然法,检验 5 000 次。利用
24、在线网站 Robetta(https:/robetta.bakerlab.org/)对蛋白质 BmCDA2a 和 BmCDA2b 的三维结构进行预测,并用 PyMOLWin 软件作图并导出。1.2.3 原核表达载体构建 将测序正确的重组载体和 pET-28a 原核表达载体用限制性内切酶 Xho I 和 Hind 双酶切 表 1 本文所用引物 Table 1 Primers used in this study Primer name Primer sequence(53)Use BmCDA2a-F GAGAACAGCGTCACCAGGCTC qRT-PCR BmCDA2a-R TTGTCAAC
25、ATTCACAGCACCG BmCDA2b-F AGATAACTTGCCCGTCTGGATT qRT-PCR BmCDA2b-R AGGTAGGACGCACTGGTTAGGA sw22934-F TTCGTACTGGCTCTTCTCGT qRT-PCR sw22934-R CAAAGTTGATAGCAATTCCCT BmCDA2a-F CCGCTCGAGTCTCGTGTGAAGCGACAAGATG ORF cloning and vector construction BmCDA2a-R CCCAAGCTTTCACTTCTTAACGTTGTATCCTT Restriction sites ar
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