基于气相离子迁移谱技术的五...花中蜂蜜成熟度模型鉴别研究_刘振平.pdf

分析与检测 年第 卷第 期（总第 期）：引用格式：刘振平，甘芳瑗，刘国政，等 基于气相离子迁移谱技术的五倍子花中蜂蜜成熟度模型鉴别研究 食品与发酵工业，（）：，（）：基于气相离子迁移谱技术的五倍子花中蜂蜜成熟度模型鉴别研究刘振平，甘芳瑗，刘国政，庞钶靖，姜容，聂青玉，张艳（重庆安全技术职业学院，重庆，）（重庆三峡职业学院，重庆，）摘 要 采用气相离子迁移谱（，）技术对重庆三峡库区 个不同成熟度的五倍子花中华蜜蜂蜂蜜（五倍子蜂蜜）的挥发性有机化合物（，）进行测定和分析。利用二维差谱法从广泛的 信号数据中筛选出 个有效表征五倍子蜂蜜成熟度差异的特征变量，从差异化的 分布轮廓的非靶向角度对 个不同成熟度的五倍子蜂蜜进行了偏最小二乘判别分析（，），并构建了五倍子蜂蜜成熟度鉴别模型。鉴别模型的拟合优度参数（）和预测能力参数（）均较好，分别为 和 。交叉验证和置换模拟验证结果表明所构建模型未发生过拟合情况，模型稳健有效，可实现对 个不同成熟度的五倍子蜂蜜进行有效鉴别。同时，通过变量投影重要性（，）值进一步筛选出了 个对有效区分五倍子蜂蜜成熟度发挥关键作用的特征标志物。该研究引入 技术和 的理论与方法实现了不同成熟度五倍子蜂蜜样品的准确鉴别，为蜂蜜质量控制提供了新的技术参考。关键词 气相离子迁移谱；中华蜜蜂；蜂蜜成熟度；模型鉴别；五倍子蜂蜜第一作者：博士，副教授（刘振平副教授和聂青玉教授为共同通信作者，：；）基金项目：重庆市教育委员会科学技术研究计划青年项目（）；重庆市教育委员会高校创新研究群体项目（）收稿日期：，改回日期：蜂蜜是蜜蜂采集植物的花蜜、分泌物或蜜露，与自身分泌物混合后，经充分酿造而成的天然甜物质（）。蜂蜜的酿造是水分含量不断降低、多糖不断分解且营养物质不断积累直至蜂巢封盖成熟的过程。成熟蜂蜜是指蜜蜂将采回蜂巢中的花蜜经酿造、脱水，多糖和双糖充分酶解为单糖，葡萄糖和果糖的总含量达到 以上，含水量降至 以下，来自蜜蜂分泌物的活性成分充分积累，不能添加或移除任何物质。蜂蜜的成熟度是表征蜂蜜质量的重要指标，不同成熟度蜂蜜的色泽、口感和营养价值都存在显著差异。非成熟蜂蜜水分含量大多高于 ，在适宜温度下，极易发酵产酸产气。为满足标准要求，工业生产中多对蜂蜜采取加热浓缩途径降低水分，但此过程会由于美拉德反应和氧化反应而生成大量的脂肪醛类、糠醛类和酮类等对人体健康有潜在危害的化合物，因此，加热浓缩降低了蜂蜜品质，增加了安全风险。具有较高成熟度的蜂蜜水分含量更低，香味更浓，营养物质更丰富，活性成分含量更高、保健功效更强，通过简单的过滤加工后即可上市销售，避免了因加工浓缩等工艺造成的有害物质积累和营养、风味成分的流失。因此，成熟蜂蜜具有更高的营养价值和更全面的生物学功能，成熟度是蜂蜜质量评价的重要参考，成熟蜂蜜将成为市场的主流，而非成熟蜂蜜或经加热浓缩的蜂蜜必将被市场淘汰。但由于利益驱使，不法分子常用非成熟蜂蜜冒充成熟蜂蜜，以次充好，扰乱蜂蜜市场，损害消费者利益。因此，对蜂蜜成熟度进行有效鉴别并由此评价蜂蜜的质量具有重要意义。蜂蜜成分复杂，与蜂蜜成熟度相关的研究大多集中在不同成熟度蜂蜜的简单成分差异上，关于不同成熟度蜂蜜鉴别的研究较少。郭娜娜研究发现未成熟油菜蜂蜜中有机酸、糖苷、植物碱等物质含量较多，而酚类物质更多地存在于成熟油菜蜂蜜中。马天琛通过洋槐蜜的 个理化指标和电化学指纹图谱结合正交偏最小二乘判别分析建立了成熟蜂蜜、非成熟蜂蜜和浓缩洋槐蜜判别模型，验证识别正确率为。蜂蜜中含有大量的挥发性有机化合物（，），如醛类、酮类、烯烃、醇类和酯类等，每一种蜂蜜都具有自己独特的 食品与发酵工业 （）轮廓，这个轮廓能够较全面地揭示蜂蜜成分的复杂性和相关性，反映蜂蜜样品差异信息。蜂蜜的独特香气与其成熟度密切相关，因此，测定与分析是鉴别蜂蜜成熟度的有效途径。气相离子迁移谱（，）是近年来发展起来的基于测定样品非靶向 特征轮廓的新技术，兼具了气相色谱的高效分离性能和离子迁移谱灵敏度高、响应速度快的优势，不需要对样品进行预处理，可对样品中实现高效的二次分离，形成的三维图谱具有较强的可视化效果等优点。本文研究团队基于 技术通过 的分析在蜂蜜植物来源鉴别及产地溯源的研究中均得到了较好的结果。基于成熟度在蜂蜜质量评价中的重要性和五倍子蜂蜜作为三峡库区重要特色商品蜂蜜的市场需求，本研究采用 技术对采自重庆三峡库区由中华蜜蜂（中蜂）分别酿造、（成熟）共 个不同成熟度的五倍子蜂蜜进行 测定，并对提取的差异信息建立偏最小二乘判别分析（，）鉴别模型，为蜂蜜的成熟度鉴别提供新的技术参考。材料与方法 实验材料由中华蜜蜂分别酿造、（成熟）的五倍子蜂蜜样品各 个，共 个，样品采自重庆市万州区七和中蜂养殖合作社、重庆市万州区马槽寨农业专业合作社及养蜂个体户，蜂蜜采集地点位于重庆三峡库区的万州区、奉节县、云阳县、忠县、开州区、巫山县（每个区县均选取 个采样点，每个采样点均同时采集了 个不同成熟度的样品），测试前对所有样品进行了真实性验证，在 条件下保存。仪器与设备 型气相色谱离子迁移谱，德国 公司；自动进样装置，瑞士 公司；，（膜厚）毛细色谱柱，美国 公司。检测条件顶空进样条件：将 蜂蜜样品置于 顶空进样瓶中，将进样瓶在 条件下孵育 后，以高纯 为载气进样 ，进样针温度 。气相色谱条件：色谱柱工作温度设定为，载气高纯 流速前 内为 ，线性上升至 。离子迁移谱条件：采用（）离子源的正离子模式，漂移气体在长度为 的漂移管（温度为）中以 的流速流动；平均次数为；电场强度：，网格脉冲宽度为，触发延迟时间为，采样频率为 ，重复率为 。数据处理采用 分析软件（）对样品中的 进行定性分析。采用 对所测多维数据进行可视化分析处理，应用 评价 与蜂蜜成熟度的相关性，建立鉴别模型。在 三维图谱数据中，每一个特征峰代表一种，采用 软件对不同样品中有明显差异的特征峰进行筛选标记，并以该特征区域离子强度的最大值作为特征变量，进行数据分析。结果与分析 图谱分析 的检测结果以三维地图的形式呈现，显示了 保 留 时 间、迁 移 时 间 和 信 号 强 度 等 信 息。图可以对不同样品之间的 组成进行直观比较和初步判断，尤其是在二维俯视图中，不同样品中的 种类及浓度差异比较直观，如图 所示，轴表示归一化迁移时间，轴表示保留时间，离子信号强度用不同的颜色来表示，比如，当以酿造 的五倍子蜂蜜为参照进行差异对比时，其他 组样品对应的 的浓度高低一目了然，红色越深，说明对应 浓度比酿造 的蜂蜜样品中浓度高的越多；蓝色越深则反之。如图 所示，在不同成熟度的五倍子蜂蜜中，随着酿造时间的延长，有的成分减少了，有的成分消失了，同时也增加了一些成分，这种现象可以归因于蜂蜜在酿造过程中的物质转化。在 分析中，是一个稳定的色谱定性参数，反映了化合物与固定相的相互作用，具有良好的准确性和重现性。它是一个标准化的值，减少或消除特定实验条件如色谱柱、柱温、温度程序和压力等的因素影响，通过将实验计算的 值与 数据库或文献中的 值比对可以有效地鉴别出化合物。软件对标记成分 进行检索，五倍子蜂蜜成熟度鉴别的部分特征峰对应的物质化学信息如表 所示。分析与检测 年第 卷第 期（总第 期）；图 不同酿造时间的五倍子蜂蜜 谱图 表 五倍子蜂蜜成熟度鉴别部分特征峰对应的 名称 编号保留时间 相对迁移时间羟基丁酮 壬醇（）壬醇（）辛醇（）辛醇（）正己醇（）正己醇（）甲基丁醇 甲基丁酸乙酯 乙酸异丁酯 异丁酸乙酯 乙酸乙酯 壬醛（）壬醛（）庚醛 苯乙醛 己醛（）己醛（）糠醛（）糠醛（）异戊醇 水杨酸甲酯 苯甲醛（）苯甲醛（）庚酮（）庚酮（）乙酸苯乙酯（）乙酸苯乙酯（）正辛醛 戊醇，丁二酮 丙酸乙酯 丙醇 注：表示单体，表示二聚体依据不同成熟度五倍子蜂蜜中 对应特征峰的差异，按照二维差谱原则，选取了 个特征峰进行排序对比，用以表征对应不同样品之间的差异信息。如图 所示，每种蜂蜜各取 个样品谱图以示意，横排为标记的特征成分对应的特征点，纵列为样品编号。在五倍子蜂蜜的酿造过程中，随着时间的延长，标记为 、和 的特征 明显减少，甚至消失；而标记为、和 的特征物质浓度明显增加，有的是从无到有，此结果进一步说明了蜂蜜的酿造过程是一个物质转化过程，在此过程中除了浓度明显变化的物质外还有些仅凭肉眼无法判断的变化。因此，为了更深入分析寻找规律，需引入统计分析方法。热图是一种用颜色变化来反映数据信息的方式，可直观地将数据值的大小通过颜色深浅表示出来。如图 所示，在不同成熟度五倍子蜂蜜的特征 数据热图中，每一列代表一个样品，每一排代表一种 成分，每个小格代表某个样品中的某种 成分，红色越深代表对应样品中的对应成分含量越高，蓝色越深则含量越低。因此，由图 可知，分别酿造、的五倍子蜂蜜中特征 成分呈现明显的相似性，且与酿造 和 的有明显不同，但酿造 和 的五倍子蜂蜜中特征 成分分布有较大程度的交叉，这说明了随着蜂蜜酿造时间的延长 在不断发生着转化，酿造 的五倍子蜂蜜趋于成熟，同时也说明了成熟与不成熟的五倍子蜂蜜在 特征成分上存在明显差异，这些差异是建立有效的蜂蜜成熟度鉴别模型的重要基础。食品与发酵工业 （）图 不同成熟度五倍子蜂蜜 特征峰的对比库 图 不同成熟度五倍子蜂蜜 数据热图 成熟度鉴别模型的构建本研究采用 方法对 测得并筛选出来的差异化 分布进行分析，构建五倍子蜂蜜成熟度鉴别模型。图 为 模型的二维得分图，由图 可知，酿造时间不同的 种五倍子蜂蜜分布在不同区域，酿造、的蜂蜜所在区域有部分重叠，但与酿造 和 即趋于成熟和成熟的五倍子蜂蜜所在区域无重叠，虽然酿造 和 所在区域距离较近，但也能较明显的将彼此分开，说明随着酿造时间的延长，蜂蜜中的 在不断的变化，成熟蜂蜜或趋于成熟蜂蜜中的特征 与非成熟蜂蜜有明显差异。因此，从上述结果可以明确，基于 分析的 可用于蜂蜜成熟度的有效鉴别。图 不同成熟度五倍子蜂蜜鉴别 得分图 一般来说，模型是否发生过拟合可由内部交叉验证（，）判定。常被用作小样本模型的验证，一般分为留一法和留 法，分析与检测 年第 卷第 期（总第 期）留一法是指在构建模型时每次从总体样本中移出一个样本作为验证集，剩余的所有样本作为训练集，记录所有样本的预测残差平方和，留 法是将样本分成若干组，每次训练时删除一组作为验证集。本研究采用 次交叉验证，将样品分成 组进行实验。在交叉验证中，预测能力参数（）和拟合优度值（）是评价模型性能的主要指标，和 分别代表模型的预测能力和解释效果，可通过交叉验证计算出来，是 经交叉验证前的值，它表示模型预测值与实际值的适应度，随着潜在变量的增加，逐渐接近。在模型质量评价中 比 更重要，的极限值为，一般认为 表示所建模型是可接受的有效模型。本研究的交叉验证结果如图 所示，五倍子蜂蜜成熟度鉴别模型中 和 分别为 和 。交叉验证结果；置换验证结果图 不同成熟度五倍子蜂蜜鉴别交叉验证结果和置换验证结果 本研究对所构建的蜂蜜成熟度鉴别模型进行了置换模拟验证。置换验证通过执行随机安排的样本数据，的位置随机移位，以不同的顺序出现，然后统计推断，可增加模型中的样本数量，因此特别适用于样本较少的模型。中的置换模拟验证只要能推测出“只有极少数（）置换模拟的 值比当前的 值大”即可认为是没有出现过拟合。本研究进行 次置换验证的结果如图 所示，置换模拟中值比当前的 值大的概率（）均小于，表明所构建的 模型未出现过拟合，稳健有效。基于变量投影重要性（，）值的蜂蜜成熟度鉴别特征成分分析利用 值进一步寻找能够有效区分五倍子蜂蜜成熟度的特征标志物。一个 变量 值的计算如公式（）所示：（）式中：表示第 个变量的 值；为 变量的数量；是 个潜变量中的第 个潜变量；为第 个潜变量的回归权值；是 变量的权矩阵 的第 列的第 个元素。值是 模型中从不同类群中筛选出潜在标志物的主要参数，代表了特定标志物与蜂蜜聚类的相关性。一般情况下，一种成分被认为是潜在标志物的条件是此成分的 值应大于 。如图 所示，在五倍子蜂蜜成熟度鉴别模型中共筛选出 的特征标志物 个，其中能够被定性识别的包括：壬醇（）、乙酸乙酯、苯甲醛（）、乙酸苯乙酯（）、乙酸苯乙酯（）、辛醇（）、壬醛（）、壬醛（）、苯乙醛，共 个。结合差异 数据热图并对照表 对所筛选出的标志物进行分析得出，五倍子花蜂蜜随着酿造时间的延长，醇类和酯类物质如壬醇、辛醇、己醇、甲基丁醇、甲基丁酸乙酯、乙酸异丁酯、甲基丙酸乙酯、乙酸乙酯等含量逐渐减少，而醛类物质如壬醛、庚醛、苯乙醛、己醛、糠醛等逐渐增多。图 鉴别模型 的特征标志物 食品与发酵工业 （）结论本研究首次将基于 技术的 测定与分析用于蜂蜜成熟度鉴别研究中，同时结合 的理论与方法从整体 分布轮廓的非靶向角度对 个不同成熟度的五倍子中蜂蜜进行了区分并建立稳健有效的 鉴别模型。鉴别模型的拟合优度（）和预测能力（）分别为 和，交叉验证和置换模拟验证结果表明所构建鉴别模型未发生过拟合，稳健有效。另外，通过 值进一步筛选出了不同成熟度五倍子中蜂蜜中具有明显差异（值）的 个的特征标志物，为五倍子蜂蜜成熟度的特征 靶向鉴别研究奠定了基础。本研究从蜂蜜成熟度鉴别角度为蜂蜜的质量控制提供了新的技术参考。参考文献 ，：，（）：，（）：武文洲 国内外蜂蜜加工工艺应用进展 现代食品，（）：，（）：欧爱群，郭娜娜，刘富海，等 蜂蜜成熟过程中主要成分和抑菌特性变化研究 中国农业科技导报，（）：，（）：王桃红，张少博，张会敏，等 荞麦蜜中挥发性成分测定及其与成熟度的相关性分析 食品科学，（）：，（）：郭娜娜 酿造成熟与未成熟油菜蜂蜜成分组成及生物学活性比较研究 北京：中国农业科学院，：，马天琛 成熟洋槐蜜的鉴别方法及其生物活性研究 西安：西北大学，：，：，：，（），（）：，（），（）：刘振平，聂青玉，庞钶靖，等 气相离子迁移谱技术鉴别重庆三峡库区特色中蜂蜜研究 食品与发酵工业，（）：，（）：，：，：，（）：，：，：，：，（）：，（）：，（）：，：，（）：分析与检测 年第 卷第 期（总第 期），（）：，：，（）：，（，）（，）（）（）（），（）（），（），（）；（上接第 页），（，）（，），（），（）（），；