高产酸性蛋白酶白曲霉培养条件的优化研究_曹润洁.pdf

酿酒科技2023年第4期（总第346期）LIQUOR-MAKING SCIENCE&TECHNOLOGY2023 No.4(Tol.346)DOI：10.13746/j.njkj.2022318作者简介：曹润洁。高产酸性蛋白酶白曲霉培养条件的优化研究曹润洁1，杜成龙2，何宏魁1，2，马金同1，王冕1，袁志强2，周鹏磊1，马叶胜2（1.安徽瑞思威尔科技有限公司，安徽 亳州 236800；2.安徽古井贡酒股份有限公司，安徽 亳州 236800）摘要：以实验室保藏的白曲霉菌株为目标菌株，从生长条件、产酶活力的关键工艺因素进行研究分析，以提高白曲霉菌株酸性蛋白酶活力为目的，探究高产酸性蛋白酶白曲霉的实验室最佳培养条件。研究结果表明，以麸皮为主要原料，培养基水分添加量为100%，培养基pH值为5，培养温度38，培养时间72 h，为该实验菌株的实验室最佳培养条件。关键词：白曲霉；酸性蛋白酶活力；最佳培养条件中图分类号：TS262.3；TS261.1文献标识码：A文章编号：1001-9286（2023）04-0028-04Optimization of Cultivation Conditions of Aspergillus albicanswith High Yield of Acid ProteaseCAO Runjie1,DU Chenglong2,HE Hongkui1,2,MA Jintong1,WANG Mian1,YUAN Zhiqiang2,ZHOU Penglei1and MAYesheng2(1.Riswell Technology Co.Ltd.,Bozhou,Anhui 236800;2.Gujing Gongjiu Co.Ltd.,Bozhou,Anhui 236800,China)Abstract:In order to improve the acid protease activity of Aspergillus albicans,the key technological factors influencing the growthconditions and enzyme activity of Aspergillus albicans were studied,and the best laboratory cultivation conditions of Aspergillus albi-cans with high yield of acid protease was explored.The best laboratory cultivation conditions were determined as follows:the mainraw material was bran,the water content of the medium was 100%,the pH value of the medium was 5,the cultivation temperaturewas 38,and the cultivation time was 72 h.Key words:Aspergillus albicans;acid protease activity;optimum cultivation conditions酸性蛋白酶可应用于不同工艺、不同香型白酒的生产，能在酸性环境下水解蛋白质，可以促进微生物生长及酶的形成，可形成白酒风味物质，使酒体丰满醇厚，适合在酿酒的环境中发挥作用，有改善白酒风味的作用，并能提高原酒品质1。白曲霉具有蛋白酶活性强、耐酸度高、培养条件粗放等特点2。本研究以实验室保藏的白曲霉菌株为目标菌株，从生长条件、产酶活力的关键工艺因素进行研究分析，以提高白曲霉菌株的酸性蛋白酶活力为目的，探究高产酸性蛋白酶白曲霉实验室最佳培养条件，对其应用于酿酒生产具有指导意义3。1材料与方法1.1材料、试剂及仪器1.1.1试验原料及耗材试验菌株：本公司选育、保藏的白曲霉（Asper-gillus albicans）菌株M047，该菌株保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏编号是CCTCC M2022054。菌种保藏（斜面）培养基：麦芽粉130.0 g/L，氯霉素0.1 g/L，琼脂15.0 g/L，蒸馏水1000 mL，pH值6.00.2(25 下)，121 灭菌20 min。种子（平板）培养基：马铃薯浸出粉6.0 g/L，葡萄糖 20.0 g/L，氯霉素 0.1 g/L，琼脂 15.0 g，蒸馏2828水 1000 mL，pH 值 5.45.8(25 下)，115 灭菌20 min。液体培养基：1份高粱粉，加水4份蒸煮0.51 h，按淀粉酶使用说明加入淀粉酶进行液化，液化后补加5575 温水1份，搅拌均匀，在5575 糖化 0.51 h，稀碘液试之不显蓝色，用细纱布过滤，测量溶液的糖度并调整为810波美度，自然pH值，115 灭菌20 min后使用。三角瓶菌种培养基：250 mL 三角瓶装入 20 g麸皮和20 mL水，搅拌均匀后封口膜封口，自然pH值，121 灭菌20 min。1.1.2试剂及耗材磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、硫酸亚铁、硫酸镁、氯化钠、氢氧化钠、三氯乙酸、乳酸、甘油（均为分析纯），国药集团；琼脂（BR），国药集团；干酪素（BR），AOBOX；福林酚试剂（BR），罗恩试剂。1.1.3仪器设备ME204E型电子天平，梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司；一列八孔型电热恒温水浴锅，龙口市先科仪器有限公司；SX-700型高压灭菌锅，TOMYKOGYO公司；BSC-1300A2型生物安全柜，苏净集团苏州安泰空气技术有限公司；MHP-100智能霉菌培养箱，上海三发科学仪器有限公司；UV9000型紫外可见光分光光度计，上海元析仪器有限公司；PhS3C/0-14 型 pH 计，上海仪电科学仪器有限公司。1.2试验方法1.2.1菌种活化将本公司选育、保藏的白曲霉菌株M047制成孢子菌悬液，进行平板涂布，置于3032 恒温培养48 h，做平板划线培养4。1.2.2平板菌种的制备将活化后的白曲霉菌株点接于种子（平板）培养基上，置于 3032 智能霉菌培养箱中，培养3648 h，白曲霉成熟后即可使用。1.2.3三角瓶菌种制备250 mL三角瓶装入20 g麸皮和20 mL水，搅拌均匀后封口膜或者棉塞进行封口，每个三角瓶物料厚度在2 cm左右，于121 灭菌30 min，灭菌后趁热将曲料摇松，冷却至 40 左右接种，置于 3032 智能霉菌培养箱中，培养24 h后摇瓶1次，再培养1224 h即可完成培养。1.2.4福林酚法检测菌株产酸性蛋白酶的能力三角瓶试验种曲制备：根据单因素试验或者正交试验设计试验样本需求，将上述三角瓶菌种按照一定的接种量接入三角瓶培养基中，按照设计的培养温度和培养时间进行培养，培养过程操作参照“1.2.3三角瓶菌种制备”方法。根据上述制备种曲的方法制备试验菌株的试验种曲，利用国标 GB/T 235272009 福林酚法测酸性蛋白酶活力的方法测算试验菌株试验种曲的酸性蛋白酶活力值。1.2.5培养条件的优化从生长条件、产酶活力的关键工艺因素进行研究分析，以提高菌株白曲霉的酸性蛋白酶活力为目的，探究高产酸性蛋白酶白曲霉最适培养条件。以麸皮为主要原料，将培养基水分、培养基pH值、培养温度、培养时间等作为影响因素进行单因素试验，找出影响菌株生长的显著性因素并进行正交试验对其实验室培养条件进行优化。2结果与分析2.1单因素试验2.1.1培养基水分的选择培养基以麸皮为主要原料，对培养基水分设定6个梯度进行试验，加水量分别为原料量的 60%、80%、100%、120%、140%和160%。121 灭菌30 min后，冷却至 40 左右，在无菌条件下接种白曲霉三角瓶菌种，置于 32 智能霉菌培养箱中培养 48 h，检测其酸性蛋白酶活力。由图1可知，当加水量为60%100%时，菌体酸性蛋白酶活力随着培养基加水量的增加而增加；当加水量为100%160%时，菌体酸性蛋白酶活力随着培养基加水量的增加而减少。加水量为100%时，菌体酸性蛋白酶活力最高。2.1.2培养基pH值的选择微生物的生长需要在适宜的酸碱环境下，保持培养基水分添加量为100%，调节培养基的pH值曹润洁，杜成龙，何宏魁，马金同，王冕，袁志强，周鹏磊，马叶胜 高产酸性蛋白酶白曲霉培养条件的优化研究2929酿酒科技2023年第4期（总第346期）LIQUOR-MAKING SCIENCE&TECHNOLOGY2023 No.4(Tol.346)为2、3、4、5、6、7，其他条件保持不变，培养完成后，检测其酸性蛋白酶活力。从图2可以看出，在培养基pH值为4时菌体酸性蛋白酶的活力最高，故选择培养基的pH值为4。2.1.3培养温度的选择保持培养基水分添加量为100%，调节培养基的pH值为4，其他条件保持不变，对培养温度设定6 个梯度进行试验，温度分别为 26、30、34、38、42 和46，培养 48 h后，检测其酸性蛋白酶活力。由图3可知，菌体培养时的培养温度对菌体的酸性蛋白酶活力影响较大。当培养温度低于38 时，菌体的酸性蛋白酶活力随着温度的升高呈递增趋势，当温度高于38 时，菌体的酸性蛋白酶活力随着温度的升高呈递减趋势，当培养温度为38 时，菌体的酸性蛋白酶活力表现最优。2.1.4培养时间的选择培养基的水分添加量为 100%，培养基的 pH值为4，培养温度38，选择36 h、48 h、60 h、72 h、84 h和96 h总共6个梯度作为培养时间，检测其酸性蛋白酶活力的大小确定培养时间。通过图4可以看出，随着培养时间的延长，菌体酸性蛋白酶活力逐渐升高，当培养72 h时，曲样的酸性蛋白酶活力最高，但随后随着培养时间的延长，菌体出现老化，菌体的酸性蛋白酶活力逐渐降低，故选择72 h为培养时间。2.2正交试验根据培养基水分添加量、培养基pH值、培养温度和培养时间的单因素试验结果进行L9(34)正交试验分析，正交试验因素选取水平见表1，正交试验数据及结果分析见表2。由正交试验结果可以看出，影响菌株生长的最大因素为培养温度，其次分别为培养基的水分、培养基pH值及培养时间。从方差分析与显著性分析结果可以看出，不同水分添加量、不同培养基 pH图1培养基水分添加量对白曲霉产酸性蛋白酶活力的影响图2培养基pH值对白曲霉产酸性蛋白酶活力的影响图3培养温度对白曲霉产酸性蛋白酶活力的影响图4培养时间对白曲霉产酸性蛋白酶活力的影响3030值、不同培养时间样本对于酸性蛋白酶活力（U/g）均不表现出显著性差异，不同培养温度样本对于酸性蛋白酶活力（U/g）均呈现出显著性差异。4个因素的最佳组合是A2B3C2D2，即培养基水分添加量为 100%，培养基 pH 值为 5，培养温度38，培养时间72 h。按照所得出的最佳培养条件进行白曲霉的培养试验，设置3个水平培养样本，计算其酸性蛋白酶活力的平均值（结果如表4），最后得到菌体酸性蛋白酶的活力为526.09 U/g。3结论通过单因素试验对白曲霉培养条件进行优化，培养基以麸皮作为主要原料，确定培养基水分添加量、培养基pH值、培养温度和培养时间为影响菌株生长的显著因素。对4组显著性因素进行L9(34)正交试验5，得到菌株实验室最佳培养条件为培养基水分添加量为100%，培养基pH值为5，培养温度38，培养时间72 h。在此培养条件下对试验菌株进行培养可以显著提高菌株的酸性蛋白酶活力，酸性蛋白酶活力值可以达到526.09 U/g。酸性蛋白酶能在酿酒的酸性环境中，通过对原料中蛋白质的水解，促进微生物生长及酶的形成产生白酒风味物质，使酒体丰满醇厚6。提高白曲霉的酸性蛋白酶活力，探究高产酸性蛋白酶白曲霉实验室最佳培养条件，对其应用于酿酒生产具有指导意义。参考文献：1阎致远,王祥河,程志娟,等.酸性蛋白酶的性质及在白酒生产中应用的研究J.酿酒科技,1995(6)：16-17.2吴伟伟.酸性蛋白酶在酒精生产的应用D.北京：北京化工大学,2016.3许玲.河内白曲最适培养条件研究J.酿酒科技,2010(2)：80-81.4黄秀梨.微生物学M.北京：高等教育出版社,2003.5高林峰,汤庆莉,吴天祥.白曲霉斜面菌种培养条件的优化J.中国酿造,2010(9)：93-96.6宋宇.酶制剂在白酒生产中的应用J.赤峰学院学报(自然科学版),2006(1)：76-77.表1菌株培养条件正交试验因素水平水平123因素A：水分添加量（%）80100120B：pH值345C：培养温度（）343842D：培养时间（h）607284表2菌株培养条件正交试验数据及结果分析序号123456789均值1均值2均值3极差A111222333300.24376.78339.1676.54B123123123296.44346.83372.9276.48C123231312372.65403.53240163.53D123312231315.37353.83346.9938.46酸性蛋白酶活力(U/g)268.52388.24243.96407.56262.80460.00213.24389.44414.80表3正交试验方差分析结果因素ABCD酸性蛋白酶活力（/g）1.0(n=3)300.2477.19296.44100.12372.6596.84315.3786.152.0(n=3)376.79102.14346.8372.77403.5313.73353.83126.933.0(n=3)339.16109.78372.92113.95240.0025.02346.9989.68F0.4640.4816.6660.120p0.6500.6400.030*0.889注：*p0.05；*p0.01。表4菌株在最佳培养条件下培养后的酸性蛋白酶活力试验样本123酸性蛋白酶活力（U/g）528.08514.46535.72酸性蛋白酶活力均值（U/g）526.09曹润洁，杜成龙，何宏魁，马金同，王冕，袁志强，周鹏磊，马叶胜 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