血浆miRNAs作为胃癌早期生物标志物的临床流行病学研究.pdf

一、中劝要.1二、英翊要.5三、论文正文前言.1。材料与方法.15结果.24讨论.35总结.39参考文献.40(11五、附录附录一、论文缩略词表.63附录二、已发表论文.64六、飒.66南京医科大学硕士学位论文血浆miRNAs作为胃癌早期生物标志物的临床流行病学研究中文摘要胃癌是我国最常见的恶性肿瘤之一，其发病率和死亡率分别居恶性肿瘤第2 位和第3位，严重威胁我国居民的生命健康，是肿瘤预防及控制的重点之一。早期发现和早期诊断是早期治疗的基础，是提高胃癌患者生存期的关键环节。以胃镜为基础的筛查计划使得日本早期胃癌的诊断率提高了 3倍，胃癌患者的 预后得到有效改善。然而考虑到经济成本效益和人群接受程度，这种筛查方案 并未在其他国家推广。近年来，血清胃蛋白酶原、胃泌素17以及其他蛋白类生 物标志物备受关注，但其灵敏度和特异度有限，未能得到推广应用。因此，鉴 定微创、高效、廉价、易测的新型生物标志物，仍将是提高胃癌防治水平的一 个重要研究方向。微小RNAs(microRNAs,miRNAs)作为一类新型的癌基因和抑癌基因在 肿瘤的发生、发展以及转移等方面扮演重要作用，是肿瘤研究领域的热点之一。成熟miRNAs通过与目标mRNA序列结合,导致mRNA的降解或者翻译的抑制，从而调控目标基因的生物学功能。单个miRNA分子能够调控数以百计功能各异 的目标基因，因而miRNAs可在生理病理的各个过程中发挥重要的调节作用。靶组织来源的miRNAs在肿瘤临床诊断和预后预测中具有重要的指导意义，成 为重要的候选标志物。但是，由于靶组织取样困难，对病人生理和心理创伤较 大，在肿瘤的早期筛查中难以应用，旦对于晚期非手术患者也不易检测。2008年，国内外研究团队同步发现血浆/血清中广泛存在miRNAs,并且具 有含量丰富、性质稳定、易于精确定量检测等诸多特质。近年来，研究结果显 示循环miRNAs作为肿瘤生物标志物具有巨大应用前景。胃癌的研究已经报道 了其特异表达的循环miRNAs,但是不同研究结果缺乏一致性。例如有研究报南京医科大学硕士学位论文道通过Solexa测序技术筛选出一组胃癌血清差异表达的miRNAs：miR-l miR20a、miR-27a、miR-34和m很423.5p；另有研究利用miRNA微阵列芯片 筛选发现胃癌患者血清中miR-187*、miR-371-5p和miR-378的表达水平显著高 于对照组。这些不一致的研究结果可能与检测平台、样本收集和处理流程以及 数据标化方法等有一定的关系，但研究对象的差异，特别是胃癌部位（贲门癌 和非贲门胃癌）以及肿瘤分期的差异可能也是产生循环miRNAs研究结果异质 性的重要来源。鉴于非贲门胃癌与贲门癌发生机制的差异，以及不同肿瘤分期可能存在循 环miRNAs表达差异，本研究以早期非贲门胃癌为切入点，采用四阶段的病例-对照研究设计，筛选并验证了胃癌差异表达的血浆miRNAso第一阶段，利用 TaqMan低密度表达芯片（TaqMan Low Density Array,TLDA）比较40例早期非 贲门胃癌患者和40例健康对照混合血浆样本的miRNA表达谱，筛选差异表达 的miRNAs；第二阶段，通过单个样本反转录实时荧光定量PCR（Quantitative Reverse T ranscriptase-PC R.qRT-PC R）检测验证第一阶段筛选的差异表达 miRNAs；第三阶段，应用qRT-PCR在独立血浆样本中（包括48例早期非贲门 胃癌患者、54例胃部良性病变患者和48例健康对照）验证差异表达的miRNAs；第四阶段，应用qRT-PCR检测上述差异表达的miRNAs在不同胃癌部位和不同 肿瘤分期血浆样本中（包括早期非贲门胃癌、晚期非贲门胃癌、早期贲门癌、晚期贲门癌和健康对照各18例）的表达情况。在四个阶段的研究设计中，对照 均与病例按照年龄和性别进行频数匹配，累计包括124例非贲门胃癌患者、36 例贲门癌患者、54例胃部良性病变患者以及106例健康对照。采用Mann-Whitney 秩和检验比较对照组与病例组之间血浆miRNAs表达水平的差异。本研究通过TLDA芯片筛选发现了一组早期非贲门胃癌差异表达的血浆 miRNAs,并选择了 5个表达稳定（在病例或对照中表达Ct值低于30）且表达 差异4倍以上的候选miRNAs进行后续验证，包括miR-16、miR-25、miR-92a、miR-451和miR4865p；经过第二和第三阶段验证，我们发现这5个miRNAs 南京医科大学硕士学位论文在早期非贲门胃癌患者血浆中的表达水平均显著高于对照组（所有尸 miR-25 miR-92a、miR-451和miR-486-5p）单独诊断早期非贲门胃癌的ROC曲线下面 积（Area under the ROC Curve,AUC）分另ij为 0.768、0.694、0.732、0.790 和 0.779,miRNAs组合的AUC为0.812（灵敏度68.8%,特异度90.2%）。第三阶段与第 四阶段合并后的结果显示,5个miRNAs单独诊断胃癌的AUC分别为0.733、0.871、0.817.0.850 和 0.771,miRNAs 组合的 AUC 为 0.909（灵敏度 84.2%,特异度 91.7%）o为了进一步评价上述5个胃癌差异表达的血浆miRNAs的来源，本研究分 别采集了 BGC823和MGC803两种胃癌细胞株在不同浓度和不同培养时间点的 细胞培养液，应用qRT-PCR检测了 5个miRNAs的表达情况。分析结果显示，miR-16 miR-25和miR92a在两种细胞培养液中的表达水平均随细胞数量和培 养时间的增加而升高，而miR-451和miR-486-5p的表达水平均无明显改变，提 示胃癌患者血浆中高表达的miR-16、miR-25和miR-92a可能来源于胃癌肿瘤组 织，而血浆中高表达的miR-451和miR-486-5p可能并不直接来源于胃癌组织。本研究发现 miR-16、miR-25、miR92a、miR-451 和 miR-486-5p 在外周血 循环中的表达水平可用于早期胃癌的检测，具有较高的灵敏度与特异度，可作 为胃癌早期筛查和诊断的一类新型生物标志物。循环中高表达的miR-16、miR-25 3南京医科大学硕士学位论文和miR-92a可能来源于胃癌组织，而循环miR-451和miR-486-5p的来源有待进 一步阐明。本研究的发现有望为胃癌的早期筛查和诊断提供新手段，同时为揭 示相关循环miRNAs的分泌机制，以及实现胃癌的早诊早治、促进胃癌的防治 奠定基础。关罐词：胃癌；miRNA；血浆；生物标志物4南京医科大学硕士学位论文A Clinical Epidemiological Study of Plasma miRNAs as Biomark ers for Early Detection of Gastric CancerAbstractGastric cancer(GC)is currently the third most common malignancy and the second leading cause of cancer death in China.Early GC is typically small and asymptomatic,and the high mortality from GC is mainly due to late presentation.Therefore,early detection and treatment is an important way to reduce death from GC.Several tests have been applied in population screening,such as barium meal and endoscopy,especially in Japan,with an ultimate goal of reducing mortality associated with GC.However,these approaches may be not eligible for mass screening and early detection of GC in most countries including China for the reasons such as acceptance,availability and cost.I n addition,non-invasive serological tests,such as serum pepsinogen and gastrin-17,however,have no sufficient sensitivity and specificity to facilitate the early detection.Therefore,efforts should be invested in the discovery of novel,reliable and non-invasive biomarkers for mass screening and early detection of GC.MicroRNAs(miRNAs)are a class of small non-coding RNAs that can repress translation or promote degradation of target mRNAs of complementary sequences.A single miRNA can influence the expression of hundreds of target genes,and considerable researches consistently establish their central nodal roles in cancer development pathways.Although the molecular mechanisms of miRNAs are incompletely understood in the process of carcinogenesis,specific patterns of miRNA expression have been associated with almost every type of tumour,suggesting 5南京医科大学硕士学位论文diagnostic and prognostic potentials for miRNAs.Since the identification of circulating miRNAs in 2008,considerable researches consistently found that circulating miRNAs are not only stable but degradation-resistant which laid the foundation fbr ideal biomarkers.We and other groups have demonstrated that circulating miRNAs had the potential to be new biomarkers in patients with solid tumours fbr either early detection or evaluation of therapeutic efficiency.I n recent years,several studies have reported a series of circulating miRNAs differentially expressed in patients with GC,and most of these studies focussed on individual miRNAs selected from previous analyses on tissue samples and few with systematic miRNA profiling.However,the reported circulating miRNAs are not consistent among studies.Liu et al performed serum miRNA profiling in 20 GC patients and 20 normal controls using Solexa sequencing and identified a five-miRNA signature(miR-1,miR-20a,miR-27a,miR-34 and miR-423-5p)for GC diagnosis with the area under the receiver operating characteristic(ROC)curve(AUC)of 0.800.Thereafter,another group analysed genome-wide serum miRNAs by miRNA microarray,and reported three miRNAs(miR-187*,miR-371-5p and miR-378)significantly elevated in GC patients with the best AUC of 0.861 for miR-378.These two studies reported distinct serum miRNA profiles of GC.The inconsistency may be resulted from inclusion of different gastric tumour subtypes.For example,gastric non-cardia adenocarcinoma(GNCA)and cardia adenocarcinoma(GCA)have distinct clinical and epidemiologic features and each form might be characterized by a distinct expression profile of miRNA.I n addition,identifying differential circulating miRNAs by contrasting controls with GC 6南京医科大学硕士学位论文patients of all tumour stages as a whole might lead to the risk of overrepresenting the aberrant miRNAs from the early-stage GC patients.Therefore,large-scale,well-designed studies are needed to verify the clinical utility of circulating miRNAs for early detection of GC.Herein,we stringently designed a four-phase study to identify a panel of circulating miRNAs as early diagnostic biomarkers of GC and evaluated their clinical usefulness in independent samples.I n the discovery phase,we systematically screened the miRNA expression profile in plasma of 40 GNCA patients(stage I)and 40 matched controls by TaqMan low density array(TLDA)chips.Differentially expressed miRNAs were further validated in individual sample in the training phase using qRT-PCR assay.Subsequently,in an independent validation phase,the identified miRNAs were evaluated in additional samples,including 48 GNCA patients(stage I),54 subjects with precancerous lesions of GC(PLGC)and 48 healthy subjects.Finally,the expression levels of the identified miRNAs were assessed in an external validation phase,including 18 stage I and 18 stage I I I/I V GNCA patients,and 18 stage I and 18 stage I I I/I V GCA patients.The differences of miRNAs among groups were tested using the Mann-Whitney unpaired test.With an effort to identify stably,differentially expressed miRNAs in plasma,we screened a total of 667 human miRNAs by TLDA chips in pooled samples between the GNCA patients and healthy controls(40 subjects for each pool).We further selected candidate miRNAs that had a CT value of o30 in at least one pool and showed more than four-fold altered expression between the two pooled samples.As a result,five upregulated plasma miRNAs,including miR-16,miR-25,miR-92a,7南京医科大学硕士学位论文miR-451 and miR-486-5p,were subjected to individual qRT-PCR confirmation in the training and validation phase.Consistent with the results of the discovery phase,all of the five miRNAs had a significantly higher expression level in the GNCA patients as compared with controls.I n the external validation,all of the five miRNAs were consistently overexpressed in the advanced GNCA patients and GCA patients.To evaluate the performance of the miRNAs in discriminating the GC patients from cancer-free subjects,the discriminatory parameters were first developed in the training phase and were further independently assessed in the validation phase.The optimal cutoff value for individual miRNA was determined according to the ROC curve for each miRNA in the training phase.Based on the cutoff values developed in the training phase,the value of AUCs in the independent validation phase varied from 0.694 to 0.790,and value of AUCs in both of the independent and external validation phase varied from 0.733 to 0.871.To assess the diagnostic utility of this five-miRNA panel,a linear combination of the risk score of the five miRNAs weighted by the regression coefficient was used to calculate an RSF of the five-miRNA panel for each subject.The RSF was calculated as follows:RSF=(5.142 x risk score of miR-16)+(5.609 x risk score of miR-25)+(5.398 x risk score of miR-92a)+(4.043 x risk score of miR-451)+(4.181 x risk score of miR-486-5p),where the regression coefficients were derived from subjects in the training phase.Similar to but better than the individual miRNA,in the independent phase,the AUC of the five-miRNA panel was 0.812 and the diagnostic sensitivity and specificity were 68.8%and 90.2%,respectively.I n both of the independent and external validation phase,the miRNA panel also showed relatively high ability in discriminating the GC patients from the 8南京医科大学硕士学位论文cancer-free controls with an AUC of 0.909(sensitivity=84.2%and specificity=91.7%).I n addition,we determined whether the identified miRNAs(miR-16,miR-25,miR-92a,miR-451 and miR-486-5p)act as secretory miRNAs and are excreted into the culture media by BGC823 and MGC803 cell lines.We found that miR-16,miR-25 and miR-92a levels in media of BGC823 and MGC8O3 increased with increasing cell counts(0.5-2 x 106 cells/well)and incubation time(24 and 48 hours),whereas miR-451 and miR-486-5p levels did not change in either cell line.These data suggest that miR-16,miR-25 and miR-92a but not miR-451 or miR-486-5p may be secretory miRNAs.I n summary,we conducted a comprehensive assessment of the diagnostic usefulness of a miRNA panel in plasma fbr GC in a tailored investigation with independent validation.The sensitivity and specificity were high and the discriminative accuracy was satisfactory for the diagnosis of the early-stage GC.Our findings highlight that circulating miRNAs may be a class of novel,noninvasive diagnostic biomarkers with sufficient diagnostic accuracy,and a specified miRNA-panel can be of great value in mass screening or early detection of GC.Our work will serve as a basis for further large-scale validation before circulating miRNAs enable their introduction into the clinic setting.Keywords:gastric cancer,miRNA,plasma,biomarker南京医科大学硕士学位论文血浆miRNAs作为胃癌早期生物标志物的临床流行病学 研究 论文正文前言胃癌是人类最常见的恶性肿瘤之一。据世界卫生组织国际癌症研究署（I ARC/WHO）估计，2012年全球有95.2万胃癌新发病例和72.3万胃癌死亡病 例，位居全球恶性肿瘤的第5位和肿瘤相关死因第3位囚。我国是胃癌负担最重 的国家，全球近一半的胃癌新发病例（40.5万，约43%）和死亡病例（32.5万，约45%）发生在中国“】。在我国，胃癌年龄标化发病率男性为254/10万，女性 为10.6/10万，是仅次于肺癌的第二大恶性肿瘤，严重威胁我国居民生命健康，是肿瘤预防和控制的重点。胃癌从解剖学上可分为贲门癌和非贲门癌。据2008年全国27个市（县）胃癌登记数据显示贲门癌占胃癌的21.5%,而非贲门胃癌高达78.5%。随着人 口基数的不断增大和胃痛期望寿命的延长，庞大的胃癌，特别是非贲门胃癌，将在未来相当长一段时期内给我国带来严重的负担。贲门癌具有特殊的解剖学 和组织学特性，且与非贲门胃癌具有不同的流行病学特征、危险因素、临床病 理学特点。例如：我国河北省磁县是贲门癌高发地区，其远端胃癌的发病率却 较低叫 研究发现幽门螺杆菌（Helicobacter pylori,HP”。万）感染是非贲门胃癌 的重要危险因素，但目前的研究结果尚不支持其作为贲门癌的危险因素，且部 分研究认为6/。打感染可能是贲门癌的保护因素45；荟萃分析仅提示超重和 肥胖是费门癌的危险因素叫全基因组关联研究（Genome-Wide Association Study,GWAS）也发现贲门癌与非贲门胃癌拥有不同的遗传易感位点E/典型的贲门 癌临床表现为胸骨后疼痛和进行性吞咽困难，而非贲门胃癌则为上腹不适、进 食后饱胀等表现，幽门处的胃癌往往有幽门梗阻的表现；临床研究表明贲门癌 10南京医科大学硕士学位论文比非贲门胃癌更易于出现胃壁深层浸润和淋巴结转移，且术后更易复发，预后 明显比非贲门胃癌差1%用。以上现象均提示贲门癌有别于非贲门胃癌，两者可能 存在不同的发病机制，把贲门癌与非贲门胃癌作为两种独立的疾病进行研究已 逐渐得到共识。胃癌是一类恶性程度较高的肿瘤，其病程短、进展快、预后较差。随着肿 瘤诊疗水平的提高，以放化疗为基础的综合治疗方案在胃癌等肿瘤治疗中取得 了不错的成效。但在胃癌发生的早期阶段予以确诊，并实施手术切除治疗目前 仍然是胃癌患者最好的选择，是延长患者生存期的最佳治疗手段。然而由于早 期胃癌缺乏典型症状甚至无症状，致使绝大部分患者就诊时已处于胃癌晚期，错过了最佳的治疗时机。为此，日本作为胃癌的高发区，自上世纪60年代初即 己开展政府主导的以硫酸钢筛查与内镜相结合的全国胃癌筛查计划并取得了显 著成效：日本早期胃癌在胃癌病例中所占的比例由筛查前的8%提高至筛查后的 50%,胃癌患者的预后也得到了极大改善，五年生存率从27%提高到64%,远 高于中国及欧美等国家(早期胃癌比例：1020%；五年生存率为20-25%)“工 考虑到经济效益成本和人群接受程度，这种筛查方案并未在其他国家推广，特 别是考虑到我国人口基数庞大、财力有限，现阶段该筛查方案也不适宜在我国 推广应用。国内外的研究者已尝试其他的手段进行胃癌早期筛查，其中，以血 清胃蛋白酶原(PG)和胃泌素17(G-17)为代表的生物标志物受到了广泛的关 注，但现有的证据尚不足以支持将它们推向应用蛋白类生物标志物是目前 许多研究者关注的重点，但往往会面临抗体制备和定量检测困难的困境。因此，寻找新型的、更为理想的生物标志物，即微创、高效(灵敏特异且稳定)、价 格低廉、易于推广，是实现胃癌早期筛查的当务之急。微小RNAs(microRNAs,miRNAs)因其在肿瘤的发生、发展、转移等方 面扮演重要角色，是近年来肿瘤分子生物学研究领域的一个热点口52miRNAs 成熟体存在于真核生物中，是一类长约19-23个核昔酸的小单链RNA分子，进 化上具有高度保守性。成熟的miRNAs通过与目标mRNA序列结合,导致mRNA 11南京医科大学硕士学位论文的降解或翻译的抑制，从而调控目标基因的生物学功能12支单个miRNA分子能 够调控数以百计功能各异的目标基因，因而miRNAs可在生理病理的各个过程 中发挥重要的调节作用曲随着研究的深入，越来越多的miRNAs不断被发 现，截至2013年底，miRBase数据库收录的人类miRNAs数量己经超过2000 个，这一数字可能将进一步增加。靶组织来源的miRNAs在肿瘤临床诊断和预后预测中具有重要的指导意义,成为肿瘤发病、治疗和预后的重要候选标志物网-3叫例如，Ueda等应用miRNA 芯片对353例胃癌的研究发现，35个胃癌和癌旁组织差异表达的miRNAs能够 准确区分292例(83%)样本，其中弥漫型胃癌有8个特异性上调的miRNAs,肠型胃癌有4个特异性上调的miRNAs的。第四军医大学樊代明课题组通过对 100例胃癌组织miRNA表达谱的分析发现由7种miRNAs(miR-10b.miR-21、miR-223.miR-338、lct-7a miR-30a 和 miR-126)组成的 miRNAs 表达谱能够 预测胃癌的总生存率和无复发生存率卬但是，由于靶组织取样困难，对病人 生理和心理创伤较大，在肿瘤的早期筛查中难以应用，而对晚期非手术患者也 不易于检测，因此寻找微创的检测方法就显得十分重要了。2008年，国内外课题组同步发现miRNAs广泛存在于血浆/血清中，是循环 非编码RNAs的主要组成部分，并且具有含量丰富、性质稳定、易于精确定量 检测等特质且存在显著的疾病特异性阳3纥 既往研究认为循环miRNAs可能来 源于血小板、网织红细胞、淋巴细胞、上皮细胞、单核-巨噬细胞、干细胞以及 肿瘤细胞等判。细胞内的miRNAs 一方面可以从破裂细胞被动渗漏进入循环，另一方面可以通过源自细胞的微囊泡(Microvesicle)主动分泌叫。微囊泡的 表面带有特异性的受体/配体，可以识别靶细胞并且有选择地输送具有生物活性 的脂质、miRNAs和蛋白质进入靶细胞，从而调控靶细胞内相应基因的表达网到。虽然关于循环miRNAs的来源目前尚无定论，但是现有的成熟的技术，包括定 性和定量miRNA检测技术，表明利用循环miRNAs作为分子生物标志物的方 南京医科大学硕士学位论文法比传统的特异蛋白分子标记方法将更加有效，同时也克服了分子标记在抗 体制备和定量分析发展中遇到的瓶颈，为生物标志物的研究开拓了新境界。近几年来，国内外一些课题组通过测序和芯片技术获得了胃癌患者特异的 循环miRNA表达谱(详见论文综述部分)。例如，南京大学张辰宇课题组通过 Solexa测序技术筛选出一组胃癌血清差异表达的miRNAs(miR-1、miR-20a miR27a、miR_34和miR-4235p),这5个miRNAs的组合用于胃癌诊断的受 试者工作特征曲线下面积(Area under the ROC Curve,AUC)超过0.800网。随 后，Liu H等人通过miRNA微阵列芯片技术在胃癌患者血清中筛选出了三种显 著高表达的 miRNAs：miR-187*、miR371-5p 和 miR-378,其中 miR-378 能够以 88%灵敏度，71%特异度鉴别胃癌患者，AUC达到0.861L然而，既往研究结 果面临的一个突出的问题：不同研究团队发现的差异表达的循环miRNAs并不 一致。研究结果缺乏互相验证的原因可能包括不同的检测平台、不同的样本收 集和处理流程、不同的数据标化方法等，但以下两个因素也可能对研究结果造 成干扰：一是不同类型胃癌的干扰，如贲门癌与非贲门胃癌在流行病学特征、危险因素和临床特征等方面存在明显差异，因此这两种类型的胃癌循环miRNA 表达谱可能也不一致；二是胃癌不同病理分期的干扰，循环miRNAs在不同分 期的胃癌患者中可能存在巨大的差异，因此不同研究中病例的构成不同，所发 现的差异表达的miRNAs也不尽相同。因此，本研究以早期非贲门胃癌为切入点，采用四阶段的病例-对照研究设 计，纳入124例非贲门胃癌患者、36例贲门癌患者以及160例年龄、性别匹配 的对照，通过Taqman低密度表达芯片(TaqMan Low Density Array,TLDA)筛 选胃癌差异表达的血浆miRNAs,并通过反转录实时荧光定量PCR(Quantitative Reverse Transcriptase-PCR,qRT-PCR)进行单样本的独立验证和交叉验证，进一 步优化血浆miRNAs,以期获得一组能稳定用于胃癌早期筛查和诊断的血浆 miRNAs生物标志物。此外，本研究通过采集BGC823和MGC803两种胃癌细 胞株在不同浓度和不同培养时间点的细胞培养液，检测细胞培养液中miRNAs 13南京医科大学硕士学位论文的表达量随胃癌细胞数量和培养时间的增加的变化趋势，初步探讨循环miRNAs 的来源。南京医科大学硕士学位论文材料与方法一、研究设计本研究采用四阶段的病例对照研究设计(见图1),共纳入124例非贲门胃 癌患者、36例贲门癌患者、54例胃部良性病变患者和106