SC∕T 7228-2019 传染性肌坏死病诊断规程.pdf

ICS 65.020.30 B 50:才叫中华人民共和国水产行业标准SC/T 7228一2019传染性肌坏死病诊断规程Code of diagnosis for infectious myonecrosis(IMN)2019-08-01发布2019-11-01实施古中华人民共和国农业农村部发布.u.j/1吨、肉、，.,/斗斗以r哈I、J号/f 目剧IJf、唁吾昌、爪h I JC1&_、Ahy 本标准按照GB/Tl.1-2009给出的规则起前飞飞SC/T 7228-2019 请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件、的发珩机构不承担识别这些专利的责任。本标准由农业农村部渔业渔政管理局提出。飞J本标准由全国水产标准化技术委员会CSAC/TC156)归口。本标准起草单位:中国水产科学研究院黄海水产研究所、全国水产技术推广总站、深圳海关。本标准主要起草人:万晓援、杨冰、于力、黄健、余卫忠、史成银、张锋、宋晓玲、李清、张庆利、许华、李晨、刘莉。SC/T 7228-2019 传染性肌坏死病诊断规程1 范围本标准给出了传染性JIJl坏死病 O.3L 1.5U 注:25L体系的模板为1L逆转录cDNA，9.2.4 将上述加有逆转录cDNA的PCR管按以下程序进行第一步PCR扩增:95.C预变性2min;95.C 变性30s、60.C退火30s、720C延伸30s.39个循环;720C延伸7min;40C保温。9.2.5 按照表2的要求，配制除TaqDNA聚合酶以外的大体积预棍物。第二步PCR反应模板为第一步反应产物，扩增程序:95.C预变性2min;95.C变性30s、65.C退火30s、72.C延伸30s.39个循环;720C 延伸2min片。C保温。表2套式RT-PCR的第二步PCR反应预混物所需试剂和组成试剂25L体系试剂终浓度10X PCR缓冲液(元Mi)2.5L IX PCR缓冲液MgClz(25 mmol!U 2L 2 mmol!L dNTPs(各2.5mmol!U 2L 200mol!L 内侧引物4725NF(lOmol!U1.16L O.464mol!L 内侧引物4863NROOmol!L1.16L 0.464mol!L 灭茵双蒸水14.88L Taq DNA聚合酶(5UIu O.3L 1.5 U 注:25L体系的模板为1L第一步PCR反应产物。9.2.6 可以使用同等逆转录或一步法RT-PCR效果的商品化试剂盒进行操作。RT-PCR前，须将RNA模板g5.C100.C预变性3min后，迅速冰浴。9.3 琼脂糖i疑胶电泳及测序9.3.1 配制1.5%的琼脂精凝胶，加人10mg/mL EB至终浓度O.5g/mL.摇匀。制备琼脂糖凝胶。9.3.2 将5LPCR反应产物与lL6X载样缓冲被温匀后加入加样孔巾。同时设立DNA分子量标准对照。9.3.3 在1V/cm-5 V/cm的电压下电泳，使DNA由负极向正极移动。当载样缓冲液中澳酣蓝指示剂的包带迁移至琼脂糖凝胶的1/2-2/3处时停止电滩，将凝胶置于紫外观察仪或凝胶成像仪下观察或SC/T 7228一2019拍照。9.3.4 如果观察到预期大小条带，对PCR扩增产物进行测序。9.4 结果判定9.4.1 阳性对照第一步PCR后在328bp和/或第二步PCR后在139bp处有特定条带、阴性对照在328bp和139bp处均无条带且空白对照不出现任何条带，实验有效。9.4.2 检测样品第一步PCR后在328bp处有条带和/或第二步PCR后在139bp处有条带，且PCR产物测序结果同参考序列(参见附录D)进行比对，结果符合的可判断为套式RT-PCR结果阳性;检测样品第一步PCR后在328bp处无条带且第二步PCR后在139bp处无条带，可判为套式RT-PCR结果阴性。10 综合判定1 Q.1 疑似病例的判定易感对虾在发病条件下出现典型的临床症状，或具有典型的病理学特征，或套式RT-PCR结果显示阳性，判定为疑似病例。10.2 确诊病例的判定易感对虾具有典型的病理学特征且套式RT-PCR结果显示阳性，判定为确诊病例。6 SC/T 7228-2019 附录A(规范性附录)试剂配方A.1 戴维森民AFA(DavidsonsAFA)固定渡95%乙醇330 mL 甲醒(37%)220 mL 冰醋酸115 mL 过滤海水335 mL?昆匀，室温密封储存。A.2 苏木精染色班温水(50.C-60.C)1000 mL 苏木素1.0g 确酸$内0.2 g 何明矶90.0 g 拧攘酸1.0g 水合三氯乙醒50.0 g 按上述顺序混合，榕解后即可使用，室温储存。A.3 1%伊红储存液伊红Y71.榕性)5g 71.500 mL 榕解后置于棕色瓶中，室?且储存。A.4 1%焰红储存班焰红B(水榕性)1 g 水100 mL 榕解后置于棕色瓶中，室温储存。A.5 伊红焰红染色擅1%伊红储存液100 mL 1%焰红储存液10 mL 95%乙醇780 mL 冰醋酸4日1L?昆匀后即可使用，室温储存。A.6 锚片荆明股1 g 热水100 mL 溶解后，加入:苯酣2 g 7 SC/T 7228-2019 甘油混匀，在棕色瓶中室温储存。A.7 85%乙醇95%乙醇加水定容至?昆匀，室温储存。A.8 80%Z醇95%乙醇加水定容至混匀，室温储存。A.9 75%乙醇95%乙醇加水定容至混匀，室温储存。A.10 50%乙醇95%乙醇加水定容至?昆匀，室温储存。A.11 DEPC水灭菌双蒸水15 mL 850 mL 950 mL 800 mL 950 mL 750 mL 950 mL 500 mL 950 mL 1 000 mL DEPC 1 mL 盖上瓶塞，用磁力搅拌器于37C剧烈搅拌12h.按50mL/瓶-200mL/瓶分装于元RNA酶的试剂瓶内.103.4kPa 121.C高压蒸汽灭菌15min.冷却后密封保存。注意:DEPC有莓，应避免吸入、吞食和沾着皮肤，操作在通风榻中进行。A.12 无RNA酶的75%Z醇元水乙醇(新开瓶75mL 加人无RNA酶的水25 mL 在无RNA酶的玻璃量筒中配制，混匀，按lmL/支.1.2 mL/支分装于无RNA酶的1.5 mL离心管中，保存于一20.C待用。A.13 50 x电球缓冲液Tris 冰乙酸57.1mL 0.5 mol/L EDTA(pH 8.0)加水定容至室温储存。A.14 lx电泳缓冲液50X电泳缓冲液8 242 g 100 mL 1000 mL 20 mL 加水定容至室温储存。A.15 10 mg/mL EB储存擅1000 mL EB 10 mg 水1mL 磁力搅拌数小时以确保其完全榕解回室温保存于棕色瓶或用铝铀包裹的瓶中。SC/T 7228-2019 9 SC/T 7228-2019 附录B(资料性附录)传染性肌坏死病(IMN)B.1 传染性肌坏死病的发生与流行传染性肌坏死病Onfectiousmyonecrosis,IMN)是由传染性肌坏死病毒(1nfectiousmyonecrosis vi-rus,IMNV)感染所引起的一种对虾急性传染性疾病。急性感染期，对虾横纹肌会出现局部至弥漫的白色坏死区域，通常最早出现在末端腹节及尾扇，有些对虾会出现末端腹节坏死发红。严重感染的对虾出现濒死症状，应激后突发高死亡率，并持续数日。IMNV对凡纳滨对虾的致死率介于40%70%.感染虾群的饲料转化率比正常值高1.5倍4.0倍，甚至更高。B.2 病原和病理学特征IMNV是一种单分病毒，病毒粒子呈二十面体结构，无囊膜，直径40nm，氧化饱浮力密度1.366 g/mLo基因组为8226 bp-8 230 怜的单片段双链RNAo包含2个开放阅读框(Openreading frame.ORF),ORFH470 nt5 596 nt)编码一个可能的RNA结合蛋白和一个衣壳蛋白，ORF2(5884 nt-8 133 nt)编码一个可能的RNA依赖的RNA聚合酶。IMNV地理分布主要位于巴西东北部至印度尼西亚等东南亚周边，在养殖和野生对虾中都有检出，巴西与印度尼西亚分离株序列同源性极高。IMN急性和慢性感染能出现横纹肌及淋巴器官组织病变，由凡纳滨对虾野田村病毒(Penaeusvan-namei nodavirus.PvNV)引起凡纳滨对虾的自尾病具有类似的病变。B.3 宿主易感宿主种类:食用对虾(P.esculentus)、墨吉明对虾(F.merguiensis)和凡纳滨对虾(L.vannmei)。非完全确认易感性的宿主种类:斑节对虾(P.monodon)和细角读对虾(L.tylirostri仆。另外，有报道在南方揭对虾(P.subtilis)PCR结果显示IMNV阳性，但其感染活性尚未明确。10 SC/T 7228-2019 附录C(资料性附录)传染性肌坏死病组组病理学固曹IJIMNV感染凡纳由对虾的组织病理变化见图巳L注1.围巳1a)中，H-E染色，横纹肌(骨锵肌)纤维特征性的凝固性坏死伴之血细胞中度渗出及堆职。作为参照，可见右上角正常的肌肉组织。注2.图C.1 b)中，H-E染色，可见肌肉细胞细胞核周围明显的出嗜碱性到深嗜碱性包捅体(苗头指向)。圄巳1IMNV感染凡纳读对虾的组织病理变化11 SCjT 7228-2019 附录D(资料性附录)传染性肌坏死病毒(IMNV)套式RT-PCR检测产物序列1 CGACGCIGCT AACCATACAA AACCTTTGCTA1寸GAAGGAGGAAGACTCG TATATTGGG 4587F 61 TGGAACAATT GCAAATACAA CCAATG下GGTAAACGCAATG CAGAGGAAAC AAAGGCTTC 121 AAAA刀GCATTCAAGTGGG CAC.丁rGCTCAGAGACAACGT GTAT.口ACAGCAGTCGCC 4725NF 181 AGGG.口GACGCAATCACAA AGTGTGTGC ACGAAAG飞rCGGGTI寸TATGA.GCCCGTTC 241 CACAGCAATG ATGGCACCCA AGACTGGACT CAG:;crGTT ATAGATCAAG CACCAAATAC 4863NR 301 ATCTCAAG AC TTG.巳AACAG.工:GAGT4914R 注:下划线为IMNV套式RT-PCR检测外侧及内侧引物序列。12