SC∕T 7228-2019 传染性肌坏死病诊断规程.pdf
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1、ICS 65.020.30 B 50:才叫中华人民共和国水产行业标准SC/T 7228一2019传染性肌坏死病诊断规程Code of diagnosis for infectious myonecrosis(IMN)2019-08-01发布2019-11-01实施古中华人民共和国农业农村部发布.u.j/1吨、肉、,.,/斗斗以r哈I、J号/f 目剧IJf、唁吾昌、爪h I JC1&_、Ahy 本标准按照GB/Tl.1-2009给出的规则起前飞飞SC/T 7228-2019 请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件、的发珩机构不承担识别这些专利的责任。本标准由农业农村部渔业渔政管理局提出。飞J
2、本标准由全国水产标准化技术委员会CSAC/TC156)归口。本标准起草单位:中国水产科学研究院黄海水产研究所、全国水产技术推广总站、深圳海关。本标准主要起草人:万晓援、杨冰、于力、黄健、余卫忠、史成银、张锋、宋晓玲、李清、张庆利、许华、李晨、刘莉。SC/T 7228-2019 传染性肌坏死病诊断规程1 范围本标准给出了传染性JIJl坏死病 O.3L 1.5U 注:25L体系的模板为1L逆转录cDNA,9.2.4 将上述加有逆转录cDNA的PCR管按以下程序进行第一步PCR扩增:95.C预变性2min;95.C 变性30s、60.C退火30s、720C延伸30s.39个循环;720C延伸7min
3、;40C保温。9.2.5 按照表2的要求,配制除TaqDNA聚合酶以外的大体积预棍物。第二步PCR反应模板为第一步反应产物,扩增程序:95.C预变性2min;95.C变性30s、65.C退火30s、72.C延伸30s.39个循环;720C 延伸2min片。C保温。表2套式RT-PCR的第二步PCR反应预混物所需试剂和组成试剂25L体系试剂终浓度10X PCR缓冲液(元Mi)2.5L IX PCR缓冲液MgClz(25 mmol!U 2L 2 mmol!L dNTPs(各2.5mmol!U 2L 200mol!L 内侧引物4725NF(lOmol!U1.16L O.464mol!L 内侧引物48
4、63NROOmol!L1.16L 0.464mol!L 灭茵双蒸水14.88L Taq DNA聚合酶(5UIu O.3L 1.5 U 注:25L体系的模板为1L第一步PCR反应产物。9.2.6 可以使用同等逆转录或一步法RT-PCR效果的商品化试剂盒进行操作。RT-PCR前,须将RNA模板g5.C100.C预变性3min后,迅速冰浴。9.3 琼脂糖i疑胶电泳及测序9.3.1 配制1.5%的琼脂精凝胶,加人10mg/mL EB至终浓度O.5g/mL.摇匀。制备琼脂糖凝胶。9.3.2 将5LPCR反应产物与lL6X载样缓冲被温匀后加入加样孔巾。同时设立DNA分子量标准对照。9.3.3 在1V/cm
5、-5 V/cm的电压下电泳,使DNA由负极向正极移动。当载样缓冲液中澳酣蓝指示剂的包带迁移至琼脂糖凝胶的1/2-2/3处时停止电滩,将凝胶置于紫外观察仪或凝胶成像仪下观察或SC/T 7228一2019拍照。9.3.4 如果观察到预期大小条带,对PCR扩增产物进行测序。9.4 结果判定9.4.1 阳性对照第一步PCR后在328bp和/或第二步PCR后在139bp处有特定条带、阴性对照在328bp和139bp处均无条带且空白对照不出现任何条带,实验有效。9.4.2 检测样品第一步PCR后在328bp处有条带和/或第二步PCR后在139bp处有条带,且PCR产物测序结果同参考序列(参见附录D)进行比
6、对,结果符合的可判断为套式RT-PCR结果阳性;检测样品第一步PCR后在328bp处无条带且第二步PCR后在139bp处无条带,可判为套式RT-PCR结果阴性。10 综合判定1 Q.1 疑似病例的判定易感对虾在发病条件下出现典型的临床症状,或具有典型的病理学特征,或套式RT-PCR结果显示阳性,判定为疑似病例。10.2 确诊病例的判定易感对虾具有典型的病理学特征且套式RT-PCR结果显示阳性,判定为确诊病例。6 SC/T 7228-2019 附录A(规范性附录)试剂配方A.1 戴维森民AFA(DavidsonsAFA)固定渡95%乙醇330 mL 甲醒(37%)220 mL 冰醋酸115 mL
7、 过滤海水335 mL?昆匀,室温密封储存。A.2 苏木精染色班温水(50.C-60.C)1000 mL 苏木素1.0g 确酸$内0.2 g 何明矶90.0 g 拧攘酸1.0g 水合三氯乙醒50.0 g 按上述顺序混合,榕解后即可使用,室温储存。A.3 1%伊红储存液伊红Y71.榕性)5g 71.500 mL 榕解后置于棕色瓶中,室?且储存。A.4 1%焰红储存班焰红B(水榕性)1 g 水100 mL 榕解后置于棕色瓶中,室温储存。A.5 伊红焰红染色擅1%伊红储存液100 mL 1%焰红储存液10 mL 95%乙醇780 mL 冰醋酸4日1L?昆匀后即可使用,室温储存。A.6 锚片荆明股1
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