DB61∕T 1001.3-2015 保健用品微生物限度检查 第3部分：铜绿假单胞菌检验.pdf

ICS 11.020 C 50 DB61 陕西省地方标准 DB 61/T 1001.32015 保健用品微生物限度检查 第 3 部分：铜绿假单胞菌检验 Microbial limit examination for healthcare supplies Part 3:Tests for pseudomonas aeruginosa 2015-12-29 发布2016-03-01 实施陕西省质量技术监督局 发 布 DB61/T 1001.32015 I 目 次 前言.II1 范围.12 规范性引用文件.13 术语和定义.14 设备和材料.15 培养基和试剂.26 操作步骤.47 判定和报告.5 表 1 铜绿假单胞菌菌落形态特征.4 DB61/T 1001.32015 前 言 DB61/T 1001保健用品微生物限度检查分为以下5个部分：第1部分：总则；第2部分：菌落总数测定；第3部分：铜绿假单胞菌检验；第4部分：金黄色葡萄球菌检验；第5部分：霉菌和酵母菌数测定。本部分为DB61/T 1001的第3部分。DB61/T 998保健用品安全性评价指导原则及试验方法与DB61/T 999保健用品功能学评价指导原则及试验要求、DB61/T 1000保健用品产品标准编写规范、DB61/T 1001保健用品微生物限度检查共同构成了陕西省保健用品系列地方标准。下面列出了这些地方标准的结构：a)DB61/T 998保健用品安全性评价指导原则及试验方法分为以下 6 个部分：1)第 1 部分：安全性评价指导原则；2)第 2 部分：皮肤急性毒性试验；3)第 3 部分：皮肤长期毒性试验；4)第 4 部分：皮肤刺激性试验；5)第 5 部分：皮肤过敏性试验；6)第 6 部分：眼部刺激性试验。b)DB61/T 999保健用品功能学评价指导原则及试验要求分为以下 16 个部分：1)第 1 部分：总则；2)第 2 部分：改善微循环类功能学评价动物试验；3)第 3 部分：改善微循环类功能学评价人体试验；4)第 4 部分：乳房保健类功能学评价动物试验；5)第 5 部分：乳房保健类功能学评价人体试验；6)第 6 部分：胃肠功能保健-助消化类功能学评价动物试验；7)第 7 部分：胃肠功能保健-助消化类功能学评价人体试验；8)第 8 部分：胃肠功能保健-通便类功能学评价动物试验；9)第 9 部分：胃肠功能保健-通便类功能学评价人体试验；10)第 10 部分：皮肤瘙痒类功能学评价动物试验；11)第 11 部分：皮肤瘙痒类功能学评价人体试验；12)第 12 部分：妇女卫生保健类功能学评价动物试验；13)第 13 部分：妇女卫生保健类功能学评价人体试验；14)第 14 部分：眼部保健类功能学评价人体试验；15)第 15 部分：改善睡眠、醒脑通窍保健类功能学评价动物试验；16)第 16 部分：改善睡眠、醒脑通窍保健类功能学评价人体试验。c)DB61/T 1000保健用品产品标准编写规范分为以下 8 个部分：1)第 1 部分：总则；2)第 2 部分：保健贴类产品标准编写规范；DB61/T 1001.32015 III 3)第 3 部分：眼贴类产品标准编写规范；4)第 4 部分：含药芯类产品标准编写规范；5)第 5 部分：喷涂类产品标准编写规范；6)第 6 部分：清洗液类产品标准编写规范；7)第 7 部分：器具类产品标准编写规范；8)第 8 部分：功能服装类产品标准编写规范。本部分根据GB/T 1.1-2009给出的规则起草。本部分由陕西省食品药品监督管理局提出并归口。本部分起草单位：陕西省食品药品监督管理局、陕西省质量技术监督局。本部分主要起草人：杨晓莉、乔蓉霞、李伟、张扬。本部分由陕西省食品药品监督管理局负责解释。本部分首次发布。联系信息如下：单位：陕西省食品药品监督管理局 电话：[phone] 地址：西安市高新六路56号 邮编：710065DB61/T 1001.32015 1 保健用品微生物限度检查 第 3 部分：铜绿假单胞菌检验 1 范围 DB61/T 1001的本部分规定了保健用品中铜绿假单胞菌的检验方法。本部分适用于陕西省保健用品中铜绿假单胞菌的检验。2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。DB61/T 1001.1-2015 保健用品微生物限度检查 第1部分：总则 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。3.1 铜绿假单胞菌 pseudomonas aeruginosa 铜绿假单胞菌属于假单胞菌属，为革兰阴性杆菌，氧化酶阳性，能产生绿脓菌素。此外还能液化明胶，还原硝酸盐为亚硝酸盐，在 421条件下能生长。该菌对人有致病力，可使伤处化脓，引起败血症等病变。4 设备和材料 进行铜绿假单胞菌检验应具备以下设备和材料，并应符合其要求：a)恒温培养箱：温度应控制在 421、361；b)冰箱：温度应控制在 04；c)高压灭菌锅；d)显微镜：10100；e)电子天平：感量为 0.1g；f)电磁炉；g)振荡器或均质器；h)灭菌吸管：1mL（具 0.01mL 刻度）、10 mL（具 0.1mL 刻度）；i)试管：10 mm100 mm、18 mm180 mm；j)丝口瓶或锥形瓶：容量为 300mL、500mL；k)培养皿：直径为 90mm；l)接种环和接种针；m)载玻片；n)pH 计或精密 pH 试纸。DB61/T 1001.32015 5 培养基和试剂 5.1 无菌生理盐水 无菌生理盐水应符合DB61/T 1001.1-2015中3.6.3规定的要求。5.2 SCDLP 液体培养基制备 应先将卵磷脂在少量蒸馏水中加温溶解后，再与其他成份混合，加热溶解，冷却至251，调节pH值至7.27.3，121灭菌20min。注意振荡，使沉淀于底层的聚山梨酯80与其他成份充分混合，冷却至25左右使用。各制备材料的种类和量应符合以下规定的要求（其中，无酪蛋白胨和大豆蛋白胨时也可用多胨代替）：a)酪蛋白胨：17g；b)大豆蛋白胨：3g；c)氯化钠：5g；d)磷酸氢二钾：2.5g；e)葡萄糖：2.5g；f)卵磷脂：1g；g)聚山梨酯 80：7g；h)蒸馏水：1000mL。5.3 十六烷基三甲基溴化铵培养基制备 5.3.1 十六烷基三甲基溴化铵培养基制备材料的种类和量应符合以下要求：a)牛肉膏：3g；b)十六烷基三甲基溴化铵：0.3g；c)蛋白胨：10g；d)琼脂：20g；e)氯化钠：5g；f)蒸馏水：1000mL。5.3.2 十六烷基三甲基溴化铵培养基的制备方法应为：将除琼脂以外的上述成份混合加热溶解，冷却至 251，调节 pH 值至 7.47.6，加入琼脂，115灭菌 20min 后，制成平板备用。5.4 乙酰胺培养基制备 5.4.1 乙酰胺培养基制备材料的种类和量应符合以下要求：a)乙酰胺：10.0g；b)硫酸镁（MgSO4.7H2O）：0.5g；c)氯化钠：5.0g；d)酚红：0.012g；e)无水磷酸氢二钾：1.39g；f)琼脂：20g；g)无水磷酸二氢钾：0.73g；h)蒸馏水：1000mL。5.4.2 乙酰胺培养基的制备方法应为：将除琼脂和酚红以外的其他成份加入蒸馏水中，加热溶解，冷却至 251，调节 pH 值至 7.2，加入琼脂、酚红，121灭菌 20min 后，制成平板备用。DB61/T 1001.32015 3 5.5 绿脓菌素测定用培养基制备 5.5.1 绿脓菌素测定用培养基制备材料的种类和量应符合以下要求：a)蛋白胨：20g；b)琼脂：18g；c)氯化镁：1.4g；d)甘油（化学纯）：10g；e)硫酸钾：10g；f)蒸馏水：1000mL。5.5.2 绿脓菌素测定用培养基的制备方法应为：将蛋白胨、氯化镁和硫酸钾加入蒸馏水中，加温使其溶解，冷却至 251，调节 pH 值至 7.4，加入琼脂和甘油，加热溶解，分装于试管内，115灭菌20min 后，制成斜面备用。5.6 明胶培养基制备 5.6.1 明胶培养基制备材料的种类和量应符合以下要求：a)牛肉膏：3g；b)明胶：120g；c)蛋白胨：5g；d)蒸馏水：1000mL。5.6.2 明胶培养基的制备方法应为：取各成份加入蒸馏水中浸泡 20min，随时搅拌加温使其溶解，冷却至 251，调节 pH 值至 7.4，分装于试管内，115灭菌 20min 后，直立制成高层备用。5.7 硝酸盐蛋白胨水培养基制备 5.7.1 硝酸盐蛋白胨水培养基制备材料的种类和量应符合以下要求：a)蛋白胨：10g；b)亚硝酸钠：0.5g；c)酵母浸膏：3g；d)硝酸钾：2g；e)蒸馏水：1000mL。5.7.2 硝酸盐蛋白胨水培养基的制备方法应为：将蛋白胨和酵母浸膏加入蒸馏水中，加热使其溶解，冷却至 251，调节 pH 值至 7.2，煮沸过滤后，补足液量，加入硝酸钾和亚硝酸钠，溶解混匀，分装到加有小倒管的试管中，115灭菌 20min 后备用。5.8 普通琼脂斜面培养基制备 5.8.1 普通琼脂斜面培养基制备材料的种类和量应符合以下要求：a)蛋白胨：10g；b)牛肉膏：3g；c)氯化钠：5g；d)琼脂：15g；e)蒸馏水：1000mL。DB61/T 1001.32015 5.8.2 普通琼脂斜面培养基的制备方法应为：将除琼脂以外的其他成份加入蒸馏水中，加热使其溶解，冷却至 251，调节 pH 值至 7.27.4，加入琼脂，加热溶解，分装到试管中，115高压灭菌 20min后，制成斜面备用。6 操作步骤 6.1 样品的处理 应按照DB61/T 1001.1-2015中4.4的规定制备1:10样品匀液。6.2 增菌和分离培养 6.2.1 应取 10mL 的 1:10 样品匀液加到 90mL 的 SCDLP 液体培养基中，在 361条件下培养 18h24h。若有铜绿假单胞菌生长，则培养液表面多有一层薄菌膜，培养液常呈黄绿色或蓝绿色。6.2.2 应从培养液的薄膜处挑取培养物，划线接种于十六烷三甲基溴化铵琼脂平板上，在 361条件下培养 18h24h；在缺乏十六烷三甲基溴化铵琼脂时，也可划线接种于乙酰胺培养基平板上，在 361条件下培养 24h2h。铜绿假单胞菌在不同培养基上的菌落形态特征见表 1：表 1 铜绿假单胞菌菌落形态特征 培养基 菌落形态 十六烷三甲基溴化铵琼脂 菌落扁平无定型，向周边扩散或略有蔓延，表面湿润，菌落呈灰白色，菌落周围培养基常扩散有水溶性色素。乙酰胺培养基 菌落扁平，边缘不整，菌落周围培养基略带粉红色。6.3 染色镜检 应挑取可疑菌落进行革兰氏染色，镜检结果应为革兰氏阴性杆菌。6.4 氧化酶试验 应取一小块洁净的白色滤纸片放在灭菌平皿内，用无菌玻璃棒挑取可疑菌落涂在滤纸片上，然后在其上滴加一滴新配制的1二甲基对苯二胺试液；在15s30s之内，若出现粉红色或紫红色，则为氧化酶试验阳性；若培养物不变色，则为氧化酶试验阴性。6.5 绿脓菌素试验 应挑取可疑菌落2个3个，分别接种在绿脓菌素测定培养基上，置于36 1培养24h2h，加入氯仿3mL5mL，充分振荡使培养物中的绿脓菌素溶解于氯仿液内，待氯仿提取液呈蓝色时，用吸管将氯仿移到另一试管中并加入1mol/L的盐酸1mL左右，振荡后，静置片刻。若上层盐酸液内出现粉红色到紫红色时，则试验结果为阳性；否则为阴性。6.6 硝酸盐还原产气试验 应挑取可疑菌落的纯培养物，接种在硝酸盐胨水培养基中，在361条件下培养24h2h，观察结果。若在硝酸盐胨水培养基内的小倒管中有气体，则试验结果为阳性；若小导管中未产生气体，则试验结果为阴性。DB61/T 1001.32015 5 6.7 明胶液化试验 应挑取可疑菌落的纯培养物，穿刺接种在明胶培养基内，在361条件下培养24h2h，取出放冰箱10min30min。若明胶培养物呈溶解状或表面溶解，则试验结果为阳性；若明胶培养物凝固不溶，则试验结果为阴性。6.8 42生长试验 应挑取可疑菌落的纯培养物，接种在普通琼脂斜面培养基上，在421条件下培养24h48h。若培养基上有菌落生长，则试验结果为阳性；若培养基上无菌落生长，则试验结果为阴性。7 判定和报告 7.1 结果判定 若被检样品经增菌分离培养后，经证实为革兰氏阴性杆菌、氧化酶及绿脓菌素试验皆为阳性，则应判定样品中检出铜绿假单胞菌；若绿脓菌素试验为阴性，而明胶液化、硝酸盐还原产气和42生长试验皆为阳性，则仍应判定样品中检出铜绿假单胞菌。7.2 结果报告 应在报告中指出，在每1g、1mL或10cm2样品中检出或未检出铜绿假单胞菌。_