DB15∕T 1588-2019 元宝枫组织培养育苗技术规程(内蒙古自治区).pdf

ICS 65.020.20 B 05 DB15 内蒙古自治区地方标准 DB15/T 15882019 元宝枫组织培养育苗技术规程 Technical Regulation for Tissue Culture of Acer Truncatum Bunge 2019-01-18 发布 2019-04-18 实施 内蒙古自治区市场监督管理局 发 布 DB15/T 15882019 I 目 次 前言 . II 1 范围 . 1 2 规范性引用文件 . 1 3 术语和定义 . 1 4 环境及器具灭菌 . 1 5 培养基配制 . 2 6 外植体及其灭菌 . 3 7 初代培养 . 4 8 增殖继代培养 . 4 9 生根培养 . 4 10 炼苗移栽 . 5 附录 A（资料性附录） MS 培养基母液配制表 . 7 表 A.1 MS 培养基母液配制表 . 7 附录 B（资料性附录） 常用植物生长物质的母液配置 . 8 表 B.1 常用植物生长物质的母液配置 . 8 DB15/T 15882019 II 前 言 本标准按照GB/T1.1-2009给出的规则起草。 本标准由内蒙古自治区林业和草原局提出并归口。 本标准起草单位：内蒙古和盛生态科技研究院有限公司、内蒙古农业大学、内蒙古和盛生态育林有限公司、北京蒙树生态环境工程有限公司、赤峰市园林管理局。 本标准主要起草人：赵泉胜、赵鹏武、铁英、封卫平、斯琴毕力格、王娟、田菊、王淑杰。 DB15/T 15882019 1 元宝枫组织培养育苗技术规程 1 范围 本标准规定了元宝枫组织培养的术语和定义、环境及器具灭菌、培养基配制、外植体及其灭菌、初代培养、增殖继代培养、生根培养、组培苗炼苗移栽等基本内容及技术要求。 本标准适用于元宝枫组织培养技术生产。 2 规范性引用文件 下列文件对本文的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版（包括所有的修改单）适用于本文件。 LY/T 1882 林木组织培养育苗技术规程 3 术语和定义 LY/T 1882-2010界定的及下列术语和定义适用于本文件。 3.1 组培瓶苗 tissue-culture container seedling 经组织培养形成、尚未出瓶（试管）的完整植株。 3.2 过滤灭菌 filter sterilization 对不耐高温的植物生长调节物质，采用孔径小于0.45 m 的滤网膜过滤消除杂菌的方法。 4 环境及器具灭菌 4.1 准备室消毒灭菌 经常用消毒液消毒，保持室内清洁。 4.2 接种室消毒灭菌 保持室内清洁。接种前用紫外灯照射30 min40 min，关闭紫外灯20 min后方可进入。 4.3 培养室消毒灭菌 经常用消毒液对地面、组培架等设施进行消毒。 DB15/T 15882019 2 4.4 超净工作台消毒灭菌 接种前应用紫外灯照射30 min40 min，无菌风吹40 min以上。然后用70%酒精喷洒台面及操作台内部空间。 定期清洗超净工作台的过滤膜以确保过滤膜清洁， 具体方法： 摘下滤膜， 使用流水冲洗干净，晾干，安装，紫外灯照射灭菌。 4.5 器具消毒灭菌 4.5.1 接种器具消毒灭菌 接种前，将接种工具用滤纸包好，置于高压灭菌锅灭菌，要求温度121 、时间30 min。使用前用酒精灯外焰灼烧20 s以上，或用接种工具灭菌器直接灭菌。 4.5.2 污染瓶消毒灭菌 用高压灭菌锅消毒，然后再清洗培养瓶。或者用75%乙醇灭菌后再清洗培养瓶。 5 培养基配制 5.1 基本培养基的选择 选择MS培养基为基本培养基。 5.2 母液的配制和保存 5.2.1 母液的配制 母液中的大量元素、铁盐、微量元素及有机成分（甘氨酸、叶酸）混合配制，肌醇单一配制，具体参数见附录A；植物生长调节物质单一配制，见附录B。 5.2.2 母液的保存 母液配制完成后，贴上标签、注明日期，并置于4 冰箱存放，在有效期内使用。使用前观察无结晶无异色。 5.3 培养基的配制 5.3.1 准备 根据培养基成分准备好蒸馏水、蔗糖、琼脂和各类母液等试剂，同时准备好移液枪、量筒、量杯、天平、药匙、磁力搅拌器、pH计等工具。 5.3.2 琼脂融化 加蒸馏水 700 mL/L左右，再加入5 g/L琼脂，加热搅拌使琼脂融化。 5.3.3 糖溶解 琼脂融化后，加入30 g/L蔗糖，搅拌使糖溶解。 DB15/T 15882019 3 5.3.4 加母液 糖溶解后， 吸取母液， 再根据不同培养基要求加入耐高温激素(不耐高温的激素， 如吲哚丁酸 （IBA） 、细胞分裂素（6-BA）等，应在培养基高压灭菌后再过滤灭菌加入)，充分搅拌。 5.3.5 定容 搅拌均匀后，加蒸馏水定容。 5.3.6 pH 值测定和调节 充分搅拌后，测定pH值，用0.1 mol/L的HCl或0.1 mol/L的NaOH调节至pH 5.8。 5.3.7 分装 使用240 ml规格的培养瓶定量分装，每瓶分装约50 ml。分装培养基时勿将培养基沾在培养瓶瓶口。 5.3.8 封口 盖紧瓶盖，或用封口膜封口。 5.3.9 灭菌 应用高压灭菌锅进行灭菌，温度121 ，时间15 min20 min。 5.3.10 冷却 灭菌后的培养基放在超净工作台冷却，待完全凝固后使用。 5.3.11 贮存 灭菌后的培养基应注明编号。在4 无菌条件下贮藏备用，贮存时间不超过一个月。 6 外植体及其灭菌 6.1 外植体采集 45月份，晴天上午10点至下午4点之间，选采无病虫害、生长健壮幼龄植株，选取1年生枝条截取中上部腋芽饱满的茎段作为外植体。 6.2 外植体灭菌 6.2.1 初步灭菌 将茎段用洗洁精水全面刷洗表面，之后用自来水流水冲洗 30 min，将茎段放在超净工作台上备用。 6.2.2 深度灭菌 将初步灭菌的茎段用70%酒精浸泡30 s，无菌水冲洗3次，再用0.5%2%的次氯酸钠浸泡15 min，用无菌水冲洗3次，用灭菌滤纸吸附残留水分。 6.3 外植体制备 在超净工作台内，将深度灭菌的茎段均匀切分成长度1 cm2 cm的小段，每个小段含1个芽。 DB15/T 15882019 4 7 初代培养 7.1 初代培养基 初代培养选用MS + IBA 0.01 mg /L + 6-BA 1. 5 mg /L。 7.2 外植体接种 在超净工作台内，将外植体接种到预先准备好的初代培养基上，每瓶培养基均匀接种3个小段，下部插入培养基内，芽露出，盖紧瓶盖，注明编号。 7.3 培养 将接种完毕的培养瓶置于组培架上，每30 d更换培养基1次。待无根瓶苗萌发的腋芽生长至5 cm时，切段进行增殖继代培养。 7.4 培养环境 培养室温度在25 2 ，相对湿度70%80%，光照强度1500 lx3000 lx，光照时间16 h/d。 8 增殖继代培养 8.1 增殖培养基 培养基选用MS + IBA 0.1 mg /L +6-BA 1.0 mg /L。 8.2 增殖转接 在超净工作台内，将初代培养的无根瓶苗切成长度2 cm左右的小段，每个小段上保留有1个芽，作为增殖继代培养的材料。每瓶培养基均接种3个小段。小段下部插入培养基内，芽露出，盖紧瓶盖，注明编号。 8.3 培养 将接种完毕的培养瓶置于组培架上，每30 d更换培养基1次。 8.4 培养环境 培养室温度25 2 ，相对湿度70%80%，光照强度1500 lx3000 lx，光照时间16 h/d。 8.5 培养期 增殖培养期为30 d-50 d。 9 生根培养 9.1 生根培养基 选用1/2 MS + IBA 0. 1 mg /L。 DB15/T 15882019 5 9.2 生根转接 当增殖培养的无根瓶苗生长至2. 0 cm3. 0 cm时，在超净工作台内，从培养基上部剪取生长健壮、大小相近的无根瓶苗转接在生根培养基上进行生根培养，每瓶3株，插入深度为1.0 mm1.5 mm，保持直立。 9.3 培养方法 将转接完毕的培养瓶置于组培架上，培养20 d45 d即可生根。尚未生根的每30 d更换培养基1次。 9.4 培养条件 培养室温度25 2 ；相对湿度70%80%；光照强度1500 lx3000 lx；光照时间为16 h/d。 10 炼苗移栽 10.1 瓶苗炼苗 生根培养后，选择有35片正常绿叶、苗高5 cm6 cm、具有2 cm3 cm条白色嫩根的组培瓶苗，保持环境温度25 2 ，光照强度1500 lx2000 lx左右，进行过渡炼苗1周。之后将瓶盖逐步打开进行开瓶炼苗。步骤：首先松盖1 d2 d，然后半开盖1 d2 d，最后完全开盖3 d5 d。 10.2 温室穴盘炼苗 10.2.1 基质 采用体积比为河沙草炭珍珠岩=532混合物为基质。用多菌灵800倍液浸湿基质，用塑料布覆盖灭菌24 h后使用。 10.2.2 穴盘 穴盘容器规格选用孔径8 cm、深度8 cm。 10.2.3 填装基质 用灭菌后的基质填充穴盘容器到饱满位置后，用刮板刮去多余基质，适当喷淋清水保湿，待用。 10.2.4 瓶苗清洗 将组培瓶苗取出，用常温清水洗去基部培养基，避免破坏苗根及幼苗。 10.2.5 穴盘栽植 将清洗完毕的组培苗植入穴盘基质居中位置， 保持组培苗根系舒展， 扶正茎叶， 轻压幼苗周边基质。将植满幼苗的穴盘置于温室苗床上，常温清水饱和喷淋一次。 10.2.6 温湿度管理 每天喷雾，使环境湿度保持在80%90%之间，昼温21 29 ，夜温18 21 。可用薄膜覆盖保持湿度，采取遮阴措施，避免阳光直射。1周以后，逐渐减少喷雾次数。 DB15/T 15882019 6 10.2.7 病害防治 温室使用前要进行1次彻底的消毒灭菌，用百菌清烟雾剂熏蒸34次。穴盘栽植后每隔 7 d喷施1次800倍液多菌灵或 50% 代森锰锌或 70%甲基托布津等杀菌剂。 10.3 温室容器培育 10.3.1 容器移栽 穴盘炼苗后，当苗木叶色深绿、叶片增大、新叶长出且形成根团时，将穴盘中的幼苗连同基质一起移栽到相同基质的直径18 cm、深度20 cm的容器中，置于温室苗床继续培养，培养时间不少于2个月。 10.3.2 水肥管理 移栽后遮阴，4 d5 d内每天向叶面喷水12次，1周后逐渐撤掉遮阴。之后，每隔20 d向苗木喷施0.2%0.3%的尿素1次，用量为3 g/m25 g/m2。 10.3.3 病虫害防治 发现虫害、病害及时药物治疗： 危害元宝枫苗木的害虫主要有京枫多态毛蚜、黄刺蛾、天牛、尺蠖等，应用黄色粘虫板驱避蚜虫，用辛硫磷 800 倍液喷施防治黄刺蛾、天牛、尺蠖。 常见的病害有叶斑病、褐斑病和白粉病，可用 50%的多菌灵可湿性粉剂 800 倍液喷施，每半月喷施 1 次，连续 23 次。 10.3.4 大田培育 春季将容器苗放置在室外遮阴棚内过渡12周， 遮阴棚使用透光率为80%的遮阴网， 移入大田培养。 DB15/T 15882019 7 A A 附 录 A （资料性附录） MS 培养基母液配制表 表 A.1 MS 培养基母液配制表 母液名称 编号 化试名称 mg/L 扩大倍数 扩大后称量 mg 母液定容体积 mL 配制培养基吸取量 mL/L 大量元素 A NH4NO3 1650 20 33000 1000 50 KNO3 1900 20 38000 CaCl22H2O 440 20 8800 MgSO47H2O 370 20 7400 KH2PO4 170 20 3400 铁盐 B FeSO47H2O 27.8 100 2780 1000 10 Na2EDTA2H2O 37.3 100 3730 微量元素 C MnSO44H2O 22.3 100 2230 500 5 ZnSO47H2O 8.6 100 860 H3BO3 6.2 100 620 KI 0.83 100 83 Na2MoO42H2O 0.25 100 25 CuSO45H2O 0.025 100 2.5 CoCl26H2O 0.025 100 2.5 有机成分 D 甘氨酸 2 200 400 1000 5 盐酸硫胺素 B1 0.1 200 20 盐酸吡哆酸 B6 0.5 200 100 烟酸 0.5 200 100 E 肌醇 100 50 5000 500 10 DB15/T 15882019 8 B B 附 录 B （资料性附录） 常用植物生长物质的母液配置 表 B.1 常用植物生长物质的母液配置 类别 种类 配制方法 常用浓度(mg/L) 细胞分裂素 6-BA 先用少量 0.1mol/L 的盐酸(HCl) 溶解，然后加蒸馏水定容。 0.10.2 KT 0.052.0 ZT 0.052.0 2-iP 0.052.0 生长素 IAA 先用少量 0.1mol/L 的 KOH 或 NaOH 溶解，然后加蒸馏水定容。 0.11.0 0.55.0 IBA 0.051.0 0.25.0 NAA 0.010.5 0.22.0 2，4-D 0.012.0 赤霉素 GA3 先用少量酒精溶解，然后加水定 0.010.5 _