DB15∕T 1517-2018 从红豆草中提取纯化缩合单宁的方法(内蒙古自治区).pdf

ICS 65.020.01 B 04 备案号：61229-2019 DB15 内蒙古自治区地方标准 DB15/T 15172018 从红豆草中提取纯化缩合单宁的方法 Method for Extraction and Purification of Condensed Tannins from Sainfoin(Onobrychis viciifolia Scop.) 2018-12-20 发布 2019-03-20 实施 内蒙古自治区市场监督管理局 发 布 DB15/T 15172018 I 目 次 前言 . II 1 范围 . 1 2 规范性引用文件 . 1 3 术语和定义 . 1 4 材料与试剂 . 2 5 仪器与设备 . 2 6 材料的准备 . 3 7 溶液的配制 . 3 8 缩合单宁的提取 . 3 9 缩合单宁的纯化 . 3 10 注意事项 . 4 DB15/T 15172018 II 前 言 本标准按照GB/T 1.1-2009 给出的规则起草。 本标准由内蒙古自治区农牧业科学院提出。 本标准由内蒙古自治区畜牧业标准化技术委员会（SAM/TC19）归口。 本标准起草单位：内蒙古自治区农牧业科学院兽医研究所、中国农业科学院草原研究所。 本标准起草人：刘秀丽、侯勇跃、李锋、裴乐、李元恒、卢岩、阿木古楞。 DB15/T 15172018 1 从红豆草中提取纯化缩合单宁的方法 1 范围 本标准规定了红豆草中缩合单宁提取和纯化的方法。 本标准适用于实验室研究和提取阶段的中型试验。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。 凡是注日期的引用文件， 仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 GB/T 15686 高粱 单宁含量的测定 3 术语和定义 下列术语定义适用于本文件。 3.1 单宁 tannins 又称单宁酸、鞣酸，是植物以碳为基础的复杂酚类次生代谢产物，分子量在5003000 Da。普遍存在于植物茎，叶，树皮，花和种子的细胞壁和液泡之中。 3.2 缩合单宁 condensed tannin，CT 又称原花青素，是由黄烷-3-醇通过碳-碳双键连接构成的缩合物。 3.3 提取 extraction 选择适当的溶剂和方法将所要的目标成分溶解出来， 并同原材料分离的过程。 本方法是利用相似相溶原理通过有机溶液浸提法将红豆草中缩合单宁分离出来。 3.4 纯化 purification 利用凝聚过滤法根据分子筛原理按分子物质大小进行分离。 DB15/T 15172018 2 3.5 凝胶活化 gel activation 干燥的商品凝胶颗粒，使用前在欲使用的洗脱液中进行浸泡溶胀。 3.6 凝胶过滤 gel filtration 利用凝胶的三维网状结构分子筛的过滤作用，将化合物按分子量大小不同进行分离。 4 材料与试剂 4.1 材料 红豆草（Onobrychis viciifolia Scop.）：红豆草所含缩合单宁主要集中于叶片内且随着红豆草物候期的成熟缩合单宁含量逐渐下降，建议采集孕蕾期的红豆草材料，人工齐地刈割，适量置于保温箱内。 4.2 试剂 4.2.1 除非另有说明，在方法中使用的试剂均为分析纯，实验室用水应符合 GB/T 6682 中三级水的要求。 4.2.2 丙酮。 4.2.3 无水乙醇。 4.2.4 抗坏血酸。 4.2.5 乙醚。 4.2.6 葡聚糖凝胶 Sephadex LH-20（吸水率为 2.5 mL/g）。 5 仪器与设备 5.1 旋转蒸发仪（转速范围 20280 rpm，温度范围室温5 180 ）。 5.2 真空冷冻干燥机（冷阱温度能达到-50 左右，建设采用仪器 FreeZone 2.5 liter freeze dry systems, LABCONCO）。 5.3 氮气吹干仪（水浴式，温度范围室温5 100 ）。 5.4 磁力搅拌器（转速范围在 01000 rpm）。 5.5 天平（精度为 0.01 g，0.0001 g）。 5.6 旋涡混浊仪。 5.7 高速冷冻离心机（温度4 ）。 5.8 水浴锅（温度范围室温5 100 ）。 5.9 粉碎机（筛子孔径 1 mm）。 5.10 可调移液器（0.5 mL5 mL，1 mL10 mL）。 5.11 真空泵。 5.12 布氏漏斗（200 mL，直径 90 mm，带磨口三角瓶，且带真空泵接口）。 5.13 聚乙烯离心管（5 mL、50 mL）。 DB15/T 15172018 3 6 材料的准备 将采集的红豆草样品，用剪刀剪碎约15 cm长的小段，放于带孔的保鲜袋内，置于-50 的真空冷冻干燥机内冻干，取出后再用可控孔径（1 mm）粉碎机粉碎成粉末，置于避光处，备用。 7 溶液的配制 7.1 70 %丙酮溶液 准确量取丙酮700 mL加水定容到1000 mL，摇匀，即为1 L 70%丙酮溶液。 7.2 50 %丙酮溶液 准确量取丙酮500 mL加水定容到1000 mL，摇匀，即为1 L 50%丙酮溶液。 7.3 提取溶液 称取1 g抗坏血酸，加入到1 L 70%丙酮溶液内，溶解后的终浓度为0.1%，即为提取溶液。 7.4 80 %乙醇溶液 准确量取无水乙醇800 mL加水定容到1000 mL，摇匀，即为1L 80%乙醇溶液。 8 缩合单宁的提取 称取50 g红豆草样品置于1 L提取溶液（见7.3）中，置于避光处，放在磁力搅拌器上搅拌抽提1 h后，将抽提物于4 下以1000 g离心15 min，倒出上清液，沉淀再重复提取一次，合并两次上清液，加入等量（约1500 mL）乙醚，混合均匀，于室温（20 25 ）静置5 min；待分层（若不出现分层，再加乙醚直到分层）后，弃去上层有机溶液，保存下层水相溶液。将水相部分经旋转蒸发仪（120 rpm，40 ）减压蒸发浓缩。若减压蒸发不能完全去除丙酮，可再经氮气吹干仪（40 ）吹扫，充分去除液相中的丙酮后，置真空冷冻干燥机冻干，冻干粉即为红豆草缩合单宁的粗提物，颜色为淡棕黄色，置棕色瓶中，于-20 下保存。 9 缩合单宁的纯化 9.1 凝胶活化 称取200 g葡聚糖凝胶Sephadex LH-20干粉用700 mL 80%乙醇浸泡，用玻璃搅拌棒充分缓慢搅拌，用封口膜密封，室温放置24 h或过夜后，倾倒掉80%乙醇，再用80%乙醇浸泡12 h进行平衡后，再转移到布氏漏斗里，待用。 9.2 凝胶过滤 取上述8中所得缩合单宁提取物冻干粉末，加入200 mL 80%乙醇溶解，并用滤纸过滤。将滤过液转移到装有活化凝胶的布氏漏斗里，真空缓慢抽滤。待全部溶液滤完，用80%乙醇反复冲洗柱子除去杂质，待到滤液颜色逐渐变浅到无色，弃去所有滤液。再用50%丙酮水溶液进行洗脱，反复操作直到滤液颜色为无色，合并所有的滤液，将滤液经旋转蒸发仪（120 rpm，40 ）浓缩，再经氮气吹干仪（40 ）DB15/T 15172018 4 充分去除液相中的丙酮后，置真空冷冻干燥机冻干，冻干粉即为红豆草缩合单宁纯品，颜色为淡黄色，置棕色瓶中，于-20 下保存。 10 注意事项 葡聚糖凝胶LH-20可反复使用。每次用完，应用80%的乙醇洗35遍，并用80%的乙醇浸泡在烧杯或广口瓶中，溶胀凝胶占到总体积的75%为宜，封好口，4 贮存，备用；在纯化过程中，柱子不能抽干，始终保持湿润。 _