DB37∕T 2970-2017 驴胚胎移植技术规范(山东省).pdf

ICS 65.020.30 B 44 DB37 山东省地方标准 DB 37/T 29702017 驴胚胎移植技术规范 Technical Specifications of Donkey Embryo Transfer 2017-06-23 发布 2017-07-23 实施 山东省质量技术监督局 发 布 DB37/T 29702017 I 前 言 本标准按照GB/T 1.12009给出的规则起草。 本标准由山东省畜牧兽医局提出。 本标准由山东省畜牧业标准化技术委员会归口。 本标准起草单位：青岛农业大学、东阿阿胶股份有限公司、山东省农业科学院奶牛研究中心、聊城大学、聊城市畜牧站。 本标准主要起草人：孙玉江、嵇传良、王长法、刘桂芹、潘庆杰、李桢、于杰、姜永红、王俊海、王涛、静柏青、姜桂苗、曲洪磊、李海静、马运峰、杨阳。 DB37/T 29702017 1 驴胚胎移植技术规范 1 范围 本标准规定了驴胚胎移植技术的方法和规范。 本标准适用于驴保种场、良种繁育场、规模化驴场、动物园等应用胚胎移植技术进行优秀驴种的繁育。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。 凡是注日期的引用文件， 仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 NY/T 1335 牛人工授精技术规程 DB37/T 2309 德州驴冷冻精液生产技术规程 DB37/T 2961 驴冷冻精液人工授精技术规范 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 3.1 发情 estrus 性成熟的驴在特定季节表现的周期性行为现象，在生殖生理上表现为阴道红肿、有粘液流出、子宫颈口开张、排卵、准备受精和怀孕等，在行为上表现吧嗒嘴、兴奋不安、敏感、抿耳、塌腰、叉腿、运动增加和食欲减退，愿意接受驴的爬跨等。 3.2 发情期 estrus period 母驴出现发情行为和生殖生理变化持续的时间，一般为5 d8 d。 3.3 发情周期 estrus cycle 通常指这次发情开始至下次发情开始或这次发情结束至下次发情结束所间隔的时期， 母驴发情周期一般为22 d（18 d25 d）。 3.4 供体 donor 指提供胚胎的母驴。 3.5 DB37/T 29702017 2 受体 receptor 指接受胚胎，并代为完成妊娠和分娩的母驴。 3.6 胚胎移植 embryo transfer 将母驴的早期胚胎， 或者通过体外受精等其他方式得到的胚胎， 移植到同种的生理状态相同的母驴子宫内，使之继续发育成正常个体的技术。 3.7 同期发情 synchronization of estrus 利用某些激素制剂人为地控制并调整母驴的发情周期进程，使之在预定时间内集中发情。 4 前期准备 4.1 供体与受体的选择 4.1.1 供体驴的选择 4.1.1.1 品种优良，生产性能好。 4.1.1.2 遗传性稳定、谱系清楚、没有流产史。 4.1.1.3 体质健壮、繁殖机能正常、无遗传和传染性疾病、年龄在 2.5 岁12 岁之间为宜。 4.1.1.4 生殖器官正常，无阴道炎、子宫内膜炎、卵巢囊肿等疾病。 4.1.1.5 胚胎移植前 8 周加强饲养管理。 4.1.2 受体驴的选择 4.1.2.1 有正常的发情周期，无繁殖机能疾病，经检疫无传染疾病，健康、营养状况良好。 4.1.2.2 年龄在 3 岁8 岁，母性良好，哺乳能力良好，无流产史,分娩 45 d 以后的经产驴。 4.1.2.3 配种两个发情周期以上不孕的母驴不选作受体。 4.1.2.4 受体驴的体型大小应接近或者大于供体驴的体型大小。 4.1.2.5 胚胎移植前 8 周加强饲养管理。 4.1.3 供体与受体的比例 供体驴和受体驴的比例为1:34。 4.2 同期发情 药品规格及使用剂量参见附录A。 4.2.1 供体驴同期发情 4.2.1.1 肌注氯前列醇钠（PG）法 第一次注射：在黄体期中期和末期。 第二次注射：在第一次注射后第15 d进行第二次注射，注射后72 h96 h观察发情。 4.2.1.2 孕激素阴道栓塞（CIDR）法 DB37/T 29702017 3 在任意一天放入含孕激素阴道栓塞（CIDR），12 d后撤掉，注射PG，注射后72 h96 h观察发情。 4.2.2 受体驴同期发情 4.2.2.1 同期处理之前对受体驴进行直肠触摸或超声波检查，检查卵巢是否有周期性黄体。 4.2.2.2 操作步骤同 4.2.1。 4.2.2.3 同期发情处理后，密切观察，通过直肠检查、超声波检查卵泡发育状态以及外部观察判断并记录受体驴发情的准确时间。 4.3 供体驴人工促排卵及授精 药品规格及使用剂量参见附录A。 4.3.1 人工促排卵 4.3.1.1 以母驴发情或放 CIDR 之日作为发情周期的第 0 d，从母驴发情期或放 CIDR 的第 9 d 开始，每天注射两次垂体促卵泡素（FSH），连续注射 4 d（其中 CIDR 法应在第 3 d 注射 PG 用以溶解黄体）；当卵泡发育至30 mm 时，间歇 24 h，注射人绒毛膜促性腺激素（hCG）诱导供体排卵。 4.3.1.2 在注射 hCG 之后，每隔 6 h 观察一次促排供体驴的发情情况，通过直肠检查、超声波检查卵泡发育状态以及外部观察判断发情的准确时间。 4.3.2 人工授精 4.3.2.1 精液品质检测 人工授精前要对精液品质进行检测，用精子密度仪检查精液密度，在显微镜下判定精子活力，人工授精时应确保有效精子数不少于3108/次。 4.3.2.2 鲜精人工授精的操作步骤 鲜精人工授精的操作步骤： a) 确认母驴发情接受爬跨后，进行第一次输精，若 36 h 后未排卵，则进行第二次输精； b) 保定母驴，直检掏粪，清洗外阴； c) 把精液装入无胶塞注射器，并连接输精管，排出空气； d) 涂抹无菌润滑剂，手持输精管缓慢插入母驴阴道内，把输精管小心地通过子宫颈插入子宫体，推入精液，将输精管缓慢退出，完成输精。 4.3.2.3 冻精人工授精的操作步骤 操作步骤参见DB37/T 2961。 5 胚胎移植 5.1 冲胚 5.1.1 器材 冲胚管、子宫颈扩张棒、硅胶管、二通管或三通管、50 mL注射器、20 mL注射器、10 mL注射器、5 mL注射器、集胚漏斗、100 mm培养皿(培养皿外底部划间距为0.5 cm的横线)、35 mm培养皿、500 mL量杯、高压灭菌锅、镊子、胶布、毛巾和棉球等。 DB37/T 29702017 4 5.1.2 药品 酒精、碘伏、新洁尔灭、2 %利多卡因、0.9 %生理盐水、胚胎保护液、青霉素、链霉素等预防子宫炎药物。 5.1.3 冲胚液的配制 杜氏磷酸盐缓冲液（PBS）或者使用商品冲胚液。 5.1.4 步骤 5.1.4.1 供体驴排卵后 7 d0.5 d 冲胚，冲胚之前，所用的仪器、器皿等必须经过严格的消毒灭菌处理。使用冲胚管时必须检查气囊是否漏气。 5.1.4.2 将供体驴保定在六柱栏中， 在其荐椎和第一尾椎结合处或第一尾椎和第二尾椎结合处， 用 2 %利多卡因实行尾椎硬膜外麻醉，直至尾部无知觉。 5.1.4.3 麻醉后将驴尾固定，清除直肠后段粪便，用清水冲洗会阴部及外阴，用灭菌卫生纸擦干，碘伏棉球消毒外阴，最后用灭菌的生理盐水棉球擦拭。 5.1.4.4 用扩张棒打开子宫颈前端，随后把冲胚管缓慢插入子宫体适当部位，冲胚管气囊充气并缓慢回抽卡在子宫颈口处。 5.1.4.5 连接冲胚管和二通管或三通管。 5.1.4.6 每次灌入温度为 37的冲胚液 500 mL，然后钳住输入管，使回收液从输出管流到集胚杯中，连续冲洗子宫 3 次4 次。 5.1.4.7 在室温下用集胚漏斗过滤集胚杯内的回收液，最后保留 10 mL 左右液体，倒入100 mm 培养皿中，进行镜检。 5.1.4.8 冲胚完成后，将气囊空气放出，抽出冲胚管，向子宫内灌注青霉素、链霉素等预防子宫炎的药物。 5.1.4.9 肌注 PG。 5.2 胚胎的质量鉴定 5.2.1 检胚 把盛有冲胚回收液的培养皿放在体视显微镜下，划分区域检查，避免遗漏。发现胚胎后，将胚胎放入盛有胚胎保护液的35 mm培养皿中。 5.2.2 胚胎的发育期鉴定 5.2.2.1 排卵后第 7 d0.5 d 的供体驴胚胎，此时处于以下发育期：桑椹胚（M）、致密桑椹胚（CM）、早期囊胚（EB）、囊胚（B）或扩张囊胚（EXB）。 5.2.2.2 采胚记录参见附录 B。 5.2.3 胚胎质量鉴定 用形态学方法进行胚胎质量鉴定，将胚胎依次分为1、2、3、4等四个等级。胚胎形态学等级划分标准参见附录C。 5.3 移植 5.3.1 器械及药品 DB37/T 29702017 5 移植枪、塑料硬外套管、隔离无菌外套、碘伏棉球、无菌润滑剂、2 %利多卡因、70 %酒精棉球、5 ML一次性注射器、无菌纸、生理盐水棉球等。 5.3.2 操作步骤 5.3.2.1 受体驴在排卵后 6 d8 d 均可进行移植（将排卵当天定为第 0 d)，对照供体驴采胚记录表和合格受体驴的发情记录，选择排卵时间和胚胎胚龄相吻合的受体驴。 5.3.2.2 移植前对合格受体驴进行直肠检查或超声波检查，检查黄体，选择黄体发育良好的母驴作为受体。 5.3.2.3 受体驴实行第一尾椎和第二尾椎间硬膜外麻醉，清洗消毒外阴部。 5.3.2.4 将胚胎装入 0.25 mL 移胚管。 5.3.2.5 将移胚管装入移植枪（注意：移植枪的前端要保持无菌）。 5.3.2.6 将装有移胚管的移植枪套上移植硬外套，再套上无菌隔离外套。 5.3.2.7 涂抹无菌润滑剂，将移植枪小心的送入受体驴的子宫，推动移植枪活塞将胚胎送到受体驴子宫中。 5.3.2.8 移植记录参见附录 D。 6 妊娠检查 6.1 方法 6.1.1 采用超声波或直肠检查法，在胚胎发育的第 15 d、30 d、60 d 和 90 d 时各检查一次，确认母驴是否怀孕以及胎儿发育是否正常。 6.1.2 直肠检查判断的依据：在怀孕初期，要以卵巢、子宫角的形状、质地的变化为主；当胚胎下沉不易触摸时，以卵巢位置及子宫中动脉的妊娠脉搏为主。 6.2 步骤 先摸到子宫颈，再将手指向前滑动，寻找角间沟，然后将手向前、向下、再向后，分别触摸两个子宫角及卵巢。 6.3 怀孕症状 母驴怀孕后不同时期生殖器官会有不同的变化。怀孕20 d25 d时，空角弯曲增大，孕角弯曲由胚泡上方开始，子宫底凹沟明显，可触到小而柔软的胚泡，其直径为2.4 cm3.4 cm；怀孕60 d时，孕角大小为空角时期的2倍左右,波动感明显，角间沟变得宽平，子宫向腹腔下垂，但依然能摸到整个子宫；怀孕90 d以后，胚泡渐沉入腹腔，卵巢进一步靠近，可以同时触摸到两个卵巢。 6.4 数据记录 从输精开始，应做好繁殖及育种等相关数据记录，记录内容及格式参见附录E。 DB37/T 29702017 6 A A 附 录 A （资料性附录） 药品规格及使用剂量 A.1 规定了药品的规格和使用剂量 表A.1 药品规格及使用剂量 药品 规格 注射方式 使用剂量 注射用垂体促卵泡素（FSH） 100 IU/支 肌肉注射 300 IU/次 氯前列醇钠（PG） 2 mL:0.2 mg 肌肉注射 4-6 mL/次 人绒毛膜促性腺激素(hCG) 1000 IU/支 肌肉注射 1000-3000 IU/次 DB37/T 29702017 7 B B 附 录 B （资料性附录） 供体驴采胚记录 B.1 提供了供体驴采胚记录表的模式 表B.1 供体驴采胚记录表 序号 驴号 营养补充日期 同期发情日期 发情日期 输精日期 配种公驴 排卵日期 冲胚日期 胚胎数量 胚胎质量 受体驴号 技术员 备注 DB37/T 29702017 8 C C 附 录 C （资料性附录） 胚胎形态学等级划分标准 C.1 规定了胚胎形态学等级划分的标准 表C.1 胚胎形态学等级划分标准 胚胎等级 胚胎形态学标准 1 级 发育正常，胚龄与发育期吻合，胚胎细胞团呈均匀对称的球形，卵裂球均匀，大小、颜色、密度一致，轮廓清楚，透明带光滑平坦 2 级 发育阶段基本符合预定胚龄，轮廓清楚，明暗度适中或稍暗或稍浅，细胞密度较小或小型卵裂球过多，有小部分突出的细胞和水泡样的细胞，细胞变性率为 10 %20 % 3 级 轮廓不清楚，色泽过暗或过淡，细胞密度小，突出细胞占一多半，细胞变性率为 30 %40 % 4 级 变性胚、退化胚 DB37/T 29702017 9 D D 附 录 D （资料性附录） 受体驴胚胎移植记录 D.1 提供了受体驴胚胎移植记录表的模式 表D.1 受体驴胚胎移植记录表 序号 驴号 胎次 产驹日期 营养补充日期 同期发情日期 发情日期 移植日期 黄体状况 （左）（右） 胚胎数量 胚胎质量 胚胎系谱 技术员 妊娠检查日期 备注 DB37/T 29702017 10 E E 附 录 E （资料性附录） 繁殖育种记录 E.1 提供了繁殖育种记录表的模式 表E.1 繁殖育种记录表 序号 供体驴号 种公驴号 受体驴号 移胚日期 胚胎等级 妊娠检查I 妊娠检查II 妊娠检查III 妊娠检查IV 生产日期 产驹难易度 驴驹性别 驴驹出生重 技术员 备注 _