高效液相色谱-质谱联用法在头孢唑肟钠中基因毒性杂质控制的应用.pdf

（）基金项目 山东省市场监督管理局 年科研项目（项目编号：；项目名称：活性酯合成的头孢类抗生素中基因毒性杂质的研究与控制）作者简介 亓恒芹，女，主管药师，研究方向：药品检测及质量标准。：通讯作者 韩勇，男，主任药师，研究方向：药品检测及质量标准。：检验检测高效液相色谱 质谱联用法在头孢唑肟钠中基因毒性杂质控制的应用亓恒芹，吕远，孟龙，韩勇，孔令洋，王冉（济宁市皮肤病防治院药剂科，山东 济宁 ；济宁市食品药品检验检测研究院，山东 济宁 ；中国中医科学院中药研究所，北京 ）摘要 目的：建立高效液相色谱 质谱联用法（）测定头孢唑肟钠中基因毒性杂质 巯基苯并噻唑（）的含量。方法：采用 色谱柱（，），以 乙酸铵溶液 乙腈为流动相，梯度洗脱，流速为 ，柱温为 ，自动进样器温度，进样体积为 。质谱检测器采用电喷雾离子源（），在正离子多反应监测（）模式下通过对定量子离子（质荷比 ）扫描测定 。结果：在浓度 范围呈良好的线性关系（）；平均回收率为 ，为 （）。结论：本方法专属性强、准确、灵敏且耐用性良好，适用于测定头孢唑肟钠中 含量，为该产品临床应用安全提供保障。关键词 头孢唑肟钠；巯基苯并噻唑；基因毒性杂质；高效液相色谱 质谱联用法 中图分类号 文献标志码 文章编号 （），（，；，；，）：（）（）：（，），（）（），：（）（），（）：，；年第 卷第 期（总第 期）头孢唑肟钠是 年由日本藤泽药品公司开发的半合成第三代头孢菌素，具广谱抗菌作用，对革兰阳性菌的作用活性弱于第一代头孢菌素，但对革兰阴性菌的作用活性较强，对肾基本无毒 。国内头孢唑肟钠原料合成工艺路线普遍采用以 （氨基 噻唑基）甲氧亚胺 乙酰 苯并噻唑硫酯（活性酯）作为起始原料，与 氨基 去甲基 头孢烷酸（）反应制得头孢唑肟酸 此过程会产生副产物 巯基苯并噻唑（），再与无水碳酸钠等钠盐反应制得头孢唑肟钠 。在 年世界卫生组织国际癌症研究机构（）公布的致癌物清单中，被确定为 类致癌物 。美国国家毒理学计划（）技术报告 和 关于“鉴定对人类致癌危害”的专著 表明 具有基因毒性。另外 的部分结构式具备警示结构特征，属于一类基因毒性物质 。目前该品种在 中国药典 版、美国药典（）版、日本药典（）版也有收载。在各国药典标准的有关物质检查项均没有针对该基因毒性杂质进行控制，截至目前，尚未查询到 测 定 头 孢 唑 肟 钠 中 含 量 的 文 献 报道 。本研究通过固相萃取柱净化供试品溶液、富集 杂质，采用高效液相色谱 质谱联用法（）测定头孢唑肟钠中 杂质的含量，方法的专属性强、灵敏度度高，适用于头孢唑肟钠质量安全性控制。仪器与试药 仪器 液质联用仪（美国沃特世公司）；型电子天平 赛多利斯科学仪器（北京）有限公司；超声波清洗机（山东悦弘自动化科技有限公司，功率：，频率：）；酸度计（梅特勒 托利多公司）；固相萃取仪（赛默飞世尔科技有限公司）。试药甲醇、乙腈（德国默克公司，色谱纯）；乙酸铵（国药集团化学试剂有限公司，色谱纯）；纯化水（自制）；固相萃取柱（美国沃特世公司）；巯基苯并噻唑对照品（，含量为 ）；批次注射用头孢唑肟钠（以上样品均来源于 年山东省药品抽检，涵盖国内 家生产企业）。方法与结果 色谱（质谱）条件 色谱条件 色 谱 柱（，），柱温：，以 乙酸铵溶液（）乙腈（）为流动相进行梯度洗脱（，；，；，；，；，），流速：，进样量：。质谱条件 色谱柱（，），柱温：，电离方式：电喷雾离子源（），温度：，脱气溶剂温度：，脱气溶剂流量：，锥孔气流：，离子源毛细管电压：，碰撞气流速：，锥孔电压：，多反应监测（）模式。的定量子离子质荷比为 （碰撞电压 ），个定性子离子质荷比为 、和 （碰撞电压 ）。溶液的配制 对照品溶液精密称取 对照品（含量为 ），至 量瓶，加 甲醇溶解并稀释至刻度，作为对照品贮备液。分别精密量取对照品贮备液 置 、量瓶中，加 甲醇制成浓度为 、的对照品溶液。精密量取浓度为 的对照品溶液 、分别置 量瓶中，加 甲醇制成浓度为 、的对照品溶液。供试品溶液临用现配。取样品约，精密称定，至 量瓶，加 甲醇适量，超声 溶解，稀释至刻度，作为供试品贮备液。精密量取供试品贮备液 置 固相萃取柱中，分别用 甲醇 淋洗，淋洗速 度 ，用 甲 醇 洗 脱，速 度 ，洗脱液收集于 量瓶中，定容，摇匀，作为供试品溶液。方法学考察 专属性试验分别取溶剂、“”项下的对照品溶液和供试品溶液，按“”项下的色谱条件，对 母离子进行扫描。结果表明对照品溶液中 保留时间为 左右，且 峰附近无干扰，说明该方法专 （）属性良好。结果见图 、图 。m/z8090100110120130140150160%0100135.0124.092.0109.0注：定量离子：；定性离子：、图 巯基苯并噻唑棒状图1234%01001234%01002.64t(min)t(min)t(min)1234%01002.6611ABC注：溶剂；：巯基苯并噻唑对照品；：头孢唑肟钠样品；峰 ：巯基苯并噻唑图 巯基苯并噻唑总离子流图 线性关系考察精密量取“”项下的对照品溶液，按照“”项下方法分别进样。以 峰面积为纵坐标，以 浓度（）为横坐标，绘制标准曲线，回归方程 （，），线性范围：。结果显示，该方法线性关系良好。检出限与定量限用 甲醇逐级稀释“”项下的对照品溶液，按照“”项下色谱条件检测，记录质谱图。当信噪比约为 时的浓度即为定量限，当信噪比约为 时的浓度即为检测限。试验表明 检测限为 ，定量限为 。精密度试验取浓度为 对照品溶液，连续 进 样 针，峰 面 积 分 别 为 、和 ，为 。稳定性试验取供试品溶液，分别间隔 、进样 针，峰面积分别为 、，为 。结果表明在 内 溶液稳定。重复性试验精密称定头孢唑 肟 钠 粉 末（样 品），按 照“”项下方法制备供试品溶液，平行制备 份，按照“”项下条件进样测定，记录质谱图。按外标法计算，含量分别为 、，为 （），表明方法的重复性良好。准确度考察取 样品 份，分成 组，每份约 ，置 量瓶中，分别加入浓度为 的 对照品溶液 、，再加 甲醇适量，超声 后，加 甲醇稀释至刻度，摇匀，按“”项下方法制备高、中、低 种浓度的供试品溶液，按照“”项下条件进样测定，平均回收率为 ，为 ，表明方法准确。结果见表 。含量测定精密称定头孢唑肟钠粉末约 ，按照“”项下方法制备供试品溶液，按照“”项下条件进样测定，按外标法计算，结果见表 。通过对 年山东省药品评价性抽检的 个厂家的 批次样 年第 卷第 期（总第 期）品进行测定，发现家企业的 批注射用头孢唑肟钠中全部检测出 杂质，含量范围在 ，低于拟定的限度值 ，说明头孢唑肟钠质量整体上风险可控。表 加样回收率结果（）序号取样量（）样品含量（）加入量（）测得量（）回收率（）平均回收率（）（）表 头孢唑肟钠中 的含量（）样品编号取样量（）浓度（）含量（）讨论 杂质 阈值的设定从致癌效力数据库（）中查到，的 ，注射用头孢唑肟钠一日最高剂量不超过 ，经计算终身摄入限度为 。为防控药品质量风险，建议国内的仿制药（做一致性评价时）最高限度不能超过 。提取方法的选择 在甲醇、丙酮、乙腈和三氯甲烷等有机溶剂中易溶，在水中不溶，在苯中微溶，而头孢唑肟钠又易溶于水，两者之间化学性质差异较大，经过尝试用 甲醇溶解头孢唑肟钠和 ；由于头孢唑肟钠中的 含量较少，为防止污染质谱的离子源、提高检测方法的灵敏度，本方法使用 固相萃取柱，先用 甲醇淋洗，再用 甲醇洗脱 ，洗液收集于 量瓶中，用 甲醇定容，此法回收率为 。方法条件优化在室温下对头孢唑肟钠检测时发现供试品溶液中的 含量随着放置时间延长而逐步增加，大约 后趋于稳定，分析原因可能是 活性酯降解所致 。制备供试品溶液时必须临用现配，并放入自动进样器样品盘中（温度设定为），从而有效抑制 活性酯降解。本方法具有准确度好、灵敏度高、专属性强的特点，可作为头孢唑肟钠质量控制及监督检验的补充检测方法，为药品的安全性控制提供了可靠的技术支撑。参考文献 农莉，莫凯，梁颖娥，等 基于中国医院药物警戒系统评价儿童应用头孢唑肟的安全性 儿科药学杂志，（）：孔海欣 头孢唑肟钠生产工艺的分析 生物技术世界，（）：黄美英，夏星，罗凯，等 头孢唑肟钠生产工艺及条件的研究 中国药房，（）：李航，于奕峰 头孢唑肟钠合成工艺研究 河北工业科技，（）：朱小芝，张爱荣，张海燕，等 头孢唑肟钠合成工艺研究 山西医科大学学报，（）：李德谦 抗生素头孢唑肟合成工艺的探究 科技创新导报，（）（）：（）（）：（）（）（），：，：马磊，马玉楠，陈震，等 遗传毒性杂质的警示结构 中国新药杂志，（）：王维剑，刘斐，牛冲，等 药品杂质控制与评价研究进展 药学研究，（）：张霁，张英俊，聂飚 药物研发中基因毒性杂质的控制策略与方法探索进展 中国医药工业杂志，（）：袁林，王丽，邱海强 高效分子排阻色谱法测定头孢唑肟钠中聚合物的含量 中国抗生素杂志，（）：符雅楠，李进，尹利辉，等 头孢菌素类抗生素聚合物杂质研究进展 中国抗生素杂志，（）：李进，姚尚辰，宁保明，等 注射用头孢唑肟钠的聚合物杂质分析 中国新药杂志，（）：孟君，林顺权，蒲含林，等 头孢唑肟钠有关物质的研究 中国抗生素杂志，（）：肖慧，王婷婷，吴文获，等 法测定注射用盐酸头孢吡肟中 巯基苯并噻唑 中国抗生素杂志，（）：王喃喃，许鑫，刘姣，等 高效液相色谱法测定头孢曲松钠中 巯基苯并噻唑含量 中国抗生素杂志，（）：孙健 活性酯的合成研究 中国抗生素杂志，（）：（收稿日期：）新药获益 风险评估技术指导原则（摘录二）二、获益 风险评估总体考虑 当药物带来具有临床意义的获益，并且该药物的安全性特征良好，且未发现严重的安全性风险时，新药的获益 风险评估较为直接明确。若新药存在已识别或潜在的严重安全性风险，如风险危及生命或有较高发生率，获益 风险评估具有挑战性。这种情况下，对药物获益 风险特征做出合理的判断，需要确认药物的获益和风险被充分描述，该药物对适应证人群的获益应超过风险，才可能获得批准。因此需要对现有证据进行全面评估，综合考虑一系列复杂因素，包括疾病严重程度、患者人群和现有治疗选择等。当预期存在严重风险时，某些研究结果可能仍支持药物具有有利的获益 风险特征，但可能还需要证明，在上市后采取适当措施可以将风险控制在可接受的水平，以支持其批准。例如，如果药物对严重或危及生命疾病的最重要临床结局，存在直接和有意义的获益，该药可能具有有利的获益 风险特征。或确定该药物相对于现有治疗具有特定的重要优势（例如，对现有治疗无效的患者有效，或治疗当前疗法未解决的重要临床结局）。适应证的治疗背景包括药物所预防、治疗或诊断疾病的性质和严重程度，以及患者目前的临床需求。治疗背景是评估药物获益是否大于相关严重风险时重要的信息，如新药拟申请适应证无可用治疗选择，或新药较现有治疗有明显优势时，可能能接受更大的风险。当新药拟申请适应证有其他风险更小的治疗选择，或用于健康人群的预防性药物，对潜在严重风险或毒性的接受程度可能较低。上市申请提交的证据，即支持提供药物的获益和风险评估的信息，主要来源包括临床数据、非临床数据、患者体验数据、产品质量信息和流行病学数据等。通过良好的临床试验设计和实施，可减少药物获益和风险中的不确定性，但监管决策时，现有证据中的一些不确定性是不可避免的，例如，罕见严重不良事件的发生频率或药物的长期疗效。对于这种不确定性，将综合考虑，科学评估药物的获益是否超过风险，以及是否需要进一步的处理措施。例如上市前或上市后进行额外的临床试验，进一步明确药物的安全性、有效性和剂量反应特征；开展上市后观察性研究；在说明书中规定使用限制条件；实施风险控制措施；加强药物警戒；或完善药学信息。用于治疗严重疾病且存在未满足临床需求的药物，批准时可能会接受获益或风险更大的不确定性。而用于治疗非严重疾病的药物，已有其他治疗选择时，则难以接受同样大的获益或风险的不确定性。收集患者体验数据有助于确定未满足的患者需求，确定目标患者群体，同时可为研究终点的临床相关性评估提供信息等，具体评估请参考 以患者为中心的临床试验获益 风险评估技术指导原则。（来源：国家药品监督管理局药品审评中心网站）