GB 5009.245-2016 食品安全国家标准 食品中聚葡萄糖的测定.pdf

中 华 人 民 共 和 国 国 家 标 准G B5 0 0 9.2 4 52 0 1 6食品安全国家标准食品中聚葡萄糖的测定2 0 1 6 - 0 8 - 3 1发布2 0 1 6 - 0 9 - 2 0实施中华人民共和国国家卫生和计划生育委员会发 布G B5 0 0 9.2 4 52 0 1 61 食品安全国家标准食品中聚葡萄糖的测定1 范围本标准规定了食品中聚葡萄糖的测定方法。本标准适用于食品中添加的聚葡萄糖的测定。2 术语和定义下列术语和定义适用于本文件。2.1 聚葡萄糖 (C6H1 0O5)n由葡萄糖、 山梨糖醇和柠檬酸( 或磷酸) 按一定比例混合, 在高温下加热聚合并精制、 干燥而成的多聚体, 平均聚合度1 2。属于可溶性膳食纤维。3 原理食品中聚葡萄糖经热水浸提、 超滤离心后, 滤液经酶解去除淀粉、 果聚糖等干扰物后, 再用离子色谱-脉冲安培检测器定量测定聚葡萄糖含量。4 试剂和材料除非另有说明, 本方法所用试剂均为分析纯, 水为G B/T6 6 8 2规定的一级水。4.1 试剂4.1.1 氢氧化钠溶液(5 0%) : 色谱纯, 离子色谱专用。4.1.2 冰乙酸(CH3C OOH) 。4.1.3 三水合乙酸钠(CH3C OON a3 H2O) 。4.1.4 无水乙酸钠(CH3C OON a) 。4.1.5 果聚糖酶(f r u c t a n a s e) :20 0 0U/m L。4.1.6 淀粉葡糖苷酶(Am y l o g l u c o s i d a s e) :32 6 0U/m L( 可溶性淀粉) ;2 0 0U/m L( 对硝基酚-麦芽糖苷,p - N P -m a l t o s i d e) 。4.1.7 异淀粉酶(I s o a m y l a s e) :10 0 0U/m L。4.2 试剂配制4.2.1 乙酸溶液(0.2m o l/L) : 准确吸取1.2m L冰乙酸, 用水稀释至1 0 0m L。4.2.2 乙酸钠溶液(0.2m o l/L) : 准确称取2.7 2g三水合乙酸钠, 用水溶解并稀释至1 0 0m L。4.2.3 乙酸盐缓冲液(p H为4.5) : 将2 8m L乙酸溶液(0.2m o l/L) 与2 2m L乙酸钠溶液(0.2m o l/L) 混G B5 0 0 9.2 4 52 0 1 62 合, 用水稀释至1 0 0m L。4.2.4 混合酶液: 分别吸取6 8 0L果聚糖酶、8 4L淀粉葡糖苷酶、1 7L异淀粉酶混合, 加乙酸盐缓冲液稀释至2 0m L。混合酶液临用现配。4.3 流动相4.3.1 流动相A( 含0.1 5m o l/L氢氧化钠) :准确吸取1 5.7m L氢氧化钠溶液(5 0%) , 用预先脱气的水稀释2L, 惰性气体保护。4.3.2 流动相B( 含0.1 5m o l/L氢氧化钠,0.5 0m o l/L乙酸钠) : 准确称量4 1g无水乙酸钠( 或6 8g三水合乙酸钠) , 用流动相A溶解定容至1L, 混匀, 过0.4 5m膜, 脱气。注:配制流动相时, 去离子水需预先脱气0.5h, 定容后的流动相混匀时倒置混匀56次, 不可剧烈振摇。配好的流动相沿储液瓶壁缓缓倒入, 脱气0.5h后惰性气体保护。4.4 参考物质聚葡萄糖 (C6H1 0O5)n : 纯度大于9 0%,C A S:6 8 4 2 4 - 0 4 - 4。注:为保证结果的准确性, 如能确定添加的聚葡萄糖来源, 应选用食品中添加的聚葡聚糖同源的参考物质, 并达到F C C级。4.5 参考物质溶液的配制4.5.1 参考物质储备液(2.0 0m g/g) : 准确称取0.2 0g聚葡萄糖参考物质( 精确至0.0 0 01g) 至已预先称重的1 0 0m L具螺口塞的试样瓶中( 精确至0.0 0 1g) 。加入约1 0 0g预热至8 0的去离子水, 拧紧螺口塞, 涡旋振荡3 0s, 将试样瓶置于8 0水浴1 0m i n, 每隔5m i n振荡一次, 以使聚葡萄糖充分溶解, 取出试样瓶, 冷却至室温, 称重( 精确至0.0 0 1g) 。参考物质储备液于4保存, 有效期1个月。4.5.2 参考物质中间液: 分别精确称量1 0.0g、7.5 0g、5.0 0g、3.7 5g、2.5 0g、1.5 0g参考物质储备液( 精确至0.0 0 01g) 加水至2 0.0g( 精确至0.0 0 01g) , 得到浓度为1.0 0 0m g/g、0.7 5 0m g/g、0.5 0 0m g/g、0.3 7 5m g/g、0.2 5 0m g/g、0.1 5 0m g/g的参考物质中间液。4.5.3 参考物质工作液: 取2m L离心管, 称量( 精确至0.0 0 01g) , 精确称量参考物质中间液0.2 0g( 精确至0.0 0 01g) 转移至已称重的离心管中, 加入酶混合液0.8m L, 称量( 精确至0.0 0 01g) , 振荡混合均匀, 于5 0水浴6 0m i n, 沸水浴1 0m i n, 取出, 冰浴5m i n, 于1 00 0 0r/m i n离心1 0m i n。上清液过0.2 2m滤膜, 进样分析, 得到 浓度分别为2 0 0g/g、1 5 0g/g、1 0 0g/g、7 5. 0g/g、5 0. 0g/g、3 0.0g/g的参考物质工作液系列, 进样分析。以此6点参考物质工作液上机获得工作曲线, 其回归方程的决定系数(R2值) 应不小于0.9 9 5。5 仪器与设备5.1 分析天平: 感量分别为1m g,0.1m g。5.2 恒温水浴箱: 控温精度1。5.3 高速离心机: 转速1 00 0 0r/m i n。5.4 涡旋振荡器。5.5 微量可调移液器:2 0L2 0 0L、2 0 0L10 0 0L。5.6 针筒式过滤器: 孔径0.2 2m。5.7 超滤离心设备:1 0 00 0 0D a分子截留, 聚醚砜膜,0.5m L容积。5.8 磁力搅拌器: 带搅拌子。5.9 离子色谱仪:配备脉冲安培检测器、 梯度泵。G B5 0 0 9.2 4 52 0 1 63 6 操作步骤6.1 试样处理6.1.1 固体试样: 研磨、 粉碎, 分析前密闭保存, 避免水分变化。6.1.2 液体试样: 测定前需混合摇匀。6.2 聚葡萄糖提取6.2.1 固体试样: 取1 0 0m L具塞试样瓶, 加入1粒磁力搅拌子, 盖上螺口塞, 称量( 精确至0.0 0 1g) , 记为m1。准确称取一定量试样( 约含聚葡萄糖0.0 5g, 精确至0.0 0 01g, 记为m2) 至试样瓶中, 加1 0 0m L预热至8 0的水, 磁力搅拌3 0s,8 0水浴1 0m i n, 每5m i n磁力搅拌3 0s。取出试样瓶冷却至室温后称量( 精确至0.0 0 1g) , 记为m3。6.2.2 液体试样( 饮料、 液态奶等) : 取1 0 0m L具塞试样瓶, 称量( 精确至0.0 0 1g) , 记为m1。准确吸取一定量试样( 约含聚葡萄糖0.0 5g, 精确至0.0 0 01g, 记为m2) 至试样瓶中, 加1 0 0m L水, 振荡混合均匀, 称量( 精确至0.0 0 1g) , 记为m3。6.2.3 适量吸取样液至2.0m L的离心管中,1 00 0 0r/m i n离心1 5m i n, 取上清液过0.2 2m滤膜, 取0.4 5m L滤液加入1.5m L带有分子截留膜的离心管中, 于1 00 0 0r/m i n超滤离心3 0m i n。注意观察是否离心完全及离心液的澄清度, 如截留膜上方留有样液或离心液混浊, 可加大转速、 延长离心时间, 或增加稀释倍数(F) 。6.3 酶解6.3.1 取2m L离心管, 称量( 精确至0.0 0 01g) , 记为m4。6.3.2 吸取0.2 m L超滤离心液加入离心管中, 称量( 精确至0.0 0 01g) , 记为m5; 加入酶混合液0.8m L,称量( 精确至0.0 0 01g) , 记为m6; 振荡混合均匀, 于5 0水浴6 0m i n, 沸水浴1 0m i n, 取出,冰浴5m i n, 于1 00 0 0r/m i n离心1 0m i n。上清液过0.2m滤膜, 进样分析。上清液需在7 2h内检测。6.4 色谱参考条件检测条件见附录B。6.5 分析结果的表述试样中聚葡萄糖含量按式(1) 计算:X=Fcm6-m4m5-m4m3-m1m21 0 01 06(1) 式中:X 试样中聚葡萄糖的含量, 单位为克每百克(g/1 0 0g) ; 由标准曲线计算得到的聚葡萄糖的浓度, 单位为微克每克(g/g) ;F 稀释倍数;c 聚葡萄糖参考物质的纯度,%;m6 离心管、 酶解样液、 混合酶液的总质量, 单位为克(g) ;m4 空离心管质量, 单位为克(g) ;m5 离心管、 用于酶解样液总质量, 单位为克(g) ;m3 加水后试样瓶总质量, 单位为克(g) ;m1 试样瓶总质量, 单位为克(g) ;G B5 0 0 9.2 4 52 0 1 64 m2 试样质量, 单位为克(g) ;1 0 0 将结果表示为百分含量的系数;1 06 微克(g) 与克(g) 的转换系数。以重复性条件下获得的两次独立测定结果的算术平均值表示, 结果保留三位有效数字。7 精密度在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的1 0%。8 其他最小称样量为5g时, 固体试样检出限为0.2m g/1 0 0g, 定量限为0.5m g/1 0 0g; 液体试样为检出限为0.1 5m g/1 0 0g, 定量限为0.5m g/1 0 0g。G B5 0 0 9.2 4 52 0 1 65 附 录 A酶活性测定A.1 果聚糖酶酶活力测定方法A.1.1 原理在p H4.5, 温度4 0, 底物( 蔗果三糖) 浓度为1 0mm o l/L的标准条件下,1m i n释放1m o l果糖所需的酶量为1U。A.1.2 试剂和溶剂A.1.2.1 乙酸(0.2m o l/L) : 准确吸取1 2m L冰乙酸, 用水稀释至10 0 0m L。A.1.2.2 乙酸钠溶液(0.2m o l/L) : 准确称取2 7.2g三水合乙酸钠, 用水溶解并稀释至10 0 0m L。A.1.2.3 乙酸盐缓冲液(p H为4 .5) : 将2 8 0m L乙酸溶液(0 .2m o l/L) 与2 2 0m L乙酸钠溶液(0.2m o l/L)混合, 用水稀释至10 0 0m L。A.1.2.4 氢氧化钠溶液(2m o l/L) : 准确称取8 0g氢氧化钠, 用水溶解并稀释至10 0 0m L。A.1.2.5 3,5 -二硝基水杨酸试剂(D N S) : 将6.3g3,5 -二硝基水杨酸试剂和2 6 2m L2m o l/LN a OH溶液, 加到5 0 0m L含有1 8 5g酒石酸钾钠的热水溶液中, 再加5g苯酚和5g亚硫酸钠, 搅拌溶解, 冷却后加蒸馏水定容至10 0 0m L, 贮于棕色瓶中备用。A.1.2.6 果糖标准液(1m g/m L) : 准确称取8 0烘至恒重的分析纯果糖1 0 0m g, 置于小烧杯中, 加少量乙酸盐缓冲液溶解后, 转移到1 0 0m L容量瓶中, 用乙酸盐缓冲液定容至1 0 0m L, 混匀,4冰箱中保存备用。A.1.2.7 蔗果三糖溶液(1 0 mm o l/L) : 精确称取5.0 4g蔗果三糖, 用乙酸盐缓冲液溶解并稀释至10 0 0m L。A.1.3 仪器A.1.3.1 分析天平。A.1.3.2 电热恒温水浴锅。A.1.3.3 可见光分光光度计。A.1.3.4 计时器。A.1.4 分析步骤A.1.4.1 果糖标准曲线的绘制吸取乙酸盐缓冲液4.0m L至2 5m L刻度试管中, 加入D N S试剂5.0m L, 沸水浴加入5m i n, 冷却至室温, 用水定容至2 5m L, 制成标准空白样。分别吸取果糖标准液1.0 0m L、2.0 0m L、3.0 0m L、4.0 0m L、5.0 0m L、6.0 0m L、7.0 0m L于1 0 0m L容量瓶中, 用乙酸盐缓冲液定容至1 0 0 m L, 配制成浓度0.1 0 m g/m L、0.2 0 m g/m L、0.3 0 m g/m L、0.4 0m g/m L、0.5 0 m g/m L、0.6 0 m g/m L、0.7 0 m g/m L果糖标准使用液, 吸取果糖标准使用液各2.0m L,分别加入到2 5m L刻度试管中, 再分别加入2.0m L乙酸盐缓冲液和5.0m LD N S试剂。将各管摇匀, 在沸水浴中准确加热5m i n, 取出, 冷却至室温, 加水定容至2 5m L, 加塞后颠倒混匀, 放置3 0m i n,以标准空白液为对照调零, 在5 4 0n m处测定吸光度值。以吸光度值为纵坐标, 果糖含量(m g)G B5 0 0 9.2 4 52 0 1 66 为横坐标, 绘制标准曲线。A.1.4.2 待测酶溶液的配制称取测试酶样品, 用乙酸盐缓冲液进行稀释、 定容( 稀释后的酶液中果聚糖酶活力在0.0 4U/m L0.0 8U/m L之间) 。A.1.4.3 测定步骤吸取1 0.0m L蔗果三糖溶液,4 0平衡2 0m i n。吸取1 0.0m L待测酶液,4 0平衡2 0m i n。吸取2.0 0m L平衡后待测酶液, 加入到2 5m L刻度试管中, 再加入5.0m LD N S试剂, 混匀, 然后加入2.0m L平衡后的蔗果三糖溶液,4 0 平衡3 0m i n, 沸水浴加热5m i n, 冷却至室温, 加水定容至2 5m L,加塞后颠倒混匀, 放置3 0m i n, 以标准空白液为对照调零, 在5 4 0n m处测定吸光度值AB。吸取2.0m L平衡后的待测酶液, 加入到2 5m L刻度试管中, 加入2.0m L平衡后的蔗果三糖溶液,混匀4 0平衡3 0m i n, 然后再加入5.0m LD N S试剂, 混匀以终止反应, 沸水浴加热5m i n, 冷却至室温, 用水定容至2 5m L, 加塞后颠倒混匀, 放置3 0m i n, 以标准空白液为对照调零, 在5 4 0n m处测定吸光度值AE。A.1.5 酶活力计算果聚糖酶的酶活力按式(A.1) 计算:XD= (AE-AB)K+C0Mt10 0 0(A.1) 式中:XD 待测酶液的果聚糖酶活力, 单位为活力单位每毫升(U/m L) ;AE 酶反应液的吸光度;AB 酶空白液的吸光度;K 标准曲线的斜率;C0 标准曲线的截距;M 果糖的摩尔质量,M(C6H1 2O6)=1 8 0.2g/m o l;t 酶解反应的时间, 单位为分(m i n) ;10 0 0 换算系数。A.2 异淀粉酶酶活力测定方法A.2.1 原理在p H4.0, 温度4 0, 底物( 牡蛎糖,o y s t e rg l y c o g e n) 浓度为1 0m g/m L的标准条件下,1m i n释放出1m o l还原糖当量( 以葡萄糖计) 所需要的酶量为1U。A.2.2 试剂和溶剂A.2.2.1 乙酸盐缓冲液(p H为4.0) : 称取5 4.4g三水和乙酸钠(CH3C OON a3 H2O) , 溶于水, 加9 2m L乙酸( 冰醋酸) , 稀释至10 0 0m L。A.2.2.2 氢氧化钠溶液(2m o l/L) : 准确称取8 0g氢氧化钠, 用水溶解并稀释至10 0 0m L。A.2.2.3 3,5 -二硝基水杨酸试剂(D N S) : 将6.3g3,5 -二硝基水杨酸试剂和2 6 2m L氢氧化钠溶液, 加到5 0 0m L含有1 8 5g酒石酸钾钠的热水溶液中, 再加5g苯酚和5g亚硫酸钠, 搅拌溶解, 冷却后加蒸G B5 0 0 9.2 4 52 0 1 67 馏水定容至10 0 0m L, 贮于棕色瓶中备用。A.2.2.4 葡萄糖标准液(1m g/m L) : 称取无水葡萄糖1 0 0m g, 加乙酸盐缓冲液溶解, 定容至1 0 0m L。A.2.2.5 牡蛎糖溶液(1 0m g/m L) : 精确称取1.0g牡蛎糖, 用乙酸盐缓冲液溶解并稀释至1 0 0m L。A.2.3 仪器A.2.3.1 分析天平。A.2.3.2 电热恒温水浴锅。A.2.3.3 分光光度计。A.2.3.4 计时器。A.2.4 分析步骤A.2.4.1 葡萄糖标准曲线的绘制吸取乙酸盐缓冲液4.0m L至2 5m L刻度试管中, 加入D N S试剂5.0m L, 沸水浴加入5m i n, 冷却至室温, 用水定容至2 5m L, 制成标准空白样。分别吸取葡萄糖标准液1.0 0m L、2.0 0m L、3.0 0m L、4.0 0m L、5.0 0m L、6.0 0m L、7.0 0m L于1 0 0m L容量瓶中, 用乙酸盐缓冲液定容至1 0 0m L, 配制成浓度0 .1 0m g/m L、0 .2 0m g/m L、0 .3 0m g/m L、0 .4 0m g/m L、0.5 0m g/m L、0.6 0m g/m L、0.7 0m g/m L葡萄糖标准使用液, 吸取葡萄糖标准使用液各2.0m L,分别加入到2 5m L刻度试管中, 再分别加入2.0m L乙酸盐缓冲液和5.0m LD N S试剂。将各管摇匀, 在沸水浴中准确加热5m i n, 取出, 冷却至室温, 加水定容至2 5m L, 加塞后颠倒混匀, 放置3 0m i n,以标准空白液为对照调零, 在5 4 0n m处测定吸光度值。以吸光度值为纵坐标, 葡萄糖含量(m g) 为横坐标, 绘制标准曲线。A.2.4.2 待测酶溶液的配制称取测试酶样品, 用乙酸盐缓冲液进行稀释、 定容( 稀释后的酶液中果聚糖酶活力在0.0 4U/m L0.0 8U/m L之间) 。A.2.4.3 测定步骤吸取1 0.0m L牡蛎糖溶液,4 0平衡2 0m i n。吸取1 0.0m L待测酶液,4 0平衡2 0m i n。吸取2.0m L平衡后待测酶液, 加入到2 5m L刻度试管中, 再加入5.0m LD N S试剂, 混匀, 然后加入2.0m L平衡后的牡蛎糖溶液,4 0平衡3 0m i n, 沸水浴加热5m i n, 冷却至室温, 加水定容至2 5m L,加塞后颠倒混匀, 放置3 0m i n, 以标准空白液为对照调零, 在5 4 0n m处测定吸光度值AB。吸取2.0m L平衡后的待测酶液, 加入到2 5m L刻度试管中, 加入2.0m L平衡后的牡蛎糖溶液, 混匀4 0平衡3 0m i n, 然后再加入5.0m LD N S试剂, 混匀以终止反应, 沸水浴加热5m i n, 冷却至室温,加水定容至2 5m L, 加塞后颠倒混匀, 放置3 0m i n, 以标准空白液为对照调零, 在5 4 0n m处测定吸光度值AE。A.2.5 酶活力计算异淀粉酶的酶活力按式(A.2) 计算:XD= (AE-AB)K+C0Mt10 0 0(A.2)G B5 0 0 9.2 4 52 0 1 68 式中:XD 待测酶液的异淀粉酶活力, 单位为活力单位每毫升(U/m L) ;AE 酶反应液的吸光度;AB 酶空白液的吸光度;K 标准曲线的斜率;C0 标准曲线的截距;M 葡萄糖的摩尔质量,M(C6H1 2O6)=1 8 0.2g/m o l;t 酶解反应的时间, 单位为分(m i n) ;10 0 0 换算系数。A.3 淀粉葡糖苷酶酶活力测定方法A.3.1 以可溶性淀粉为底物的酶活力以可溶性淀粉为底物的酶活力测定参照G B8 2 7 52 0 0 9-淀粉酶制剂 中酶活力的测定方法。A.3.2 以对硝基酚-麦芽糖苷为底物的酶活力A.3.2.1 原理在p H4.5, 温度为4 0, 底物( 对硝基酚-麦芽糖苷) 浓度为1 0mm o l/L, 有过量-葡糖苷酶存在的标准条件下, 每分钟从对硝基酚-麦芽糖苷释放出1m o l对硝基酚(p - N P) 所需要的酶量为1U。A.3.2.2 试剂和溶剂A.3.2.2.1 乙酸(0.2m o l/L) : 准确吸取1 2m L冰乙酸, 用水稀释至10 0 0m L。A.3.2.2.2 乙酸钠溶液(0.2m o l/L) : 准确称取2 7.2g三水合乙酸钠, 用水溶解并稀释至10 0 0m L。A.3.2.2.3 乙酸盐缓冲液(p H为4.5) : 将2 8 0 m L乙酸溶液(0.2 m o l/L) 与2 2 0 m L乙酸钠溶液(0.2m o l/L)混合, 用水稀释至10 0 0m L。A.3.2.2.4 碳酸钠溶液(1m o l/L) : 准确称取1 0 5.9g碳酸钠, 用水溶解并稀释至10 0 0m L。A.3.2.2.5 对硝基酚标准液(1m g/m L) : 称取对硝基酚1 0 0m g, 加乙酸盐缓冲液溶解, 定容至1 0 0m L。A.3.2.2.6 -葡糖苷酶溶液: 用乙酸盐缓冲液进行稀释、 定容( 稀释后的酶液中-葡糖苷酶活力在2U/m L4U/m L之间) 。A.3.2.2.7 对硝基酚-麦芽糖苷溶液(1 0mm o l/m L) : 准确称取4.6 3g对硝基酚-麦芽糖苷, 用-葡糖苷酶溶液溶解并稀释至10 0 0m L。A.3.2.3 仪器A.3.2.3.1 分析天平。A.3.2.3.2 电热恒温水浴锅。A.3.2.3.3 分光光度计。A.3.2.3.4 计时器。A.3.2.4 分析步骤A.3.2.4.1 对硝基苯标准曲线的绘制吸取乙酸盐缓冲液2.0m L, 加入1.0m L碳酸钠溶液, 混匀, 制成标准空白样。分别吸取对硝基酚标准液1.0 0m L、2.0 0m L、3.0 0m L、4.0 0m L、5.0 0m L、6.0 0m L、7.0 0m L, 分别G B5 0 0 9.2 4 52 0 1 69 用乙酸盐缓冲液定容至1 0 0 m L, 配制成浓度0.1 0m g/m L、0.2 0m g/m L、0.3 0m g/m L、0.4 0m g/m L、0.5 0m g/m L、0.6 0m g/m L、0.7 0m g/m L对硝基酚标准使用液, 吸取对硝基酚标准使用液各1m L, 分别加入到5m L刻度试管中, 再分别加入1.0m L乙酸盐缓冲液和1.0m L碳酸钠溶液, 以标准空白液为对照调零, 在4 0 0n m处测定吸光度值。以吸光度值为纵坐标, 对硝基酚含量(m g) 为横坐标, 绘制标准曲线。A.3.2.4.2 待测酶溶液的配制称取测试酶样品, 用乙酸盐缓冲液进行稀释、 定容( 稀释后的酶液中-葡糖苷酶活力在2U/m L4U/m L之间 ) 。A.3.2.4.3 测定步骤吸取1 0.0m L对硝基酚-麦芽糖苷溶液,4 0平衡2 0m i n。吸取1 0.0m L待测酶液,4 0平衡2 0m i n。吸取1.0m L平衡后待测酶液, 加入到5m L刻度试管中, 再加入1.0m L碳酸钠溶液, 混匀, 然后加入1.0m L平衡后的对硝基酚-麦芽糖苷溶液,4 0平衡1 0m i n, 室温放置5m i n, 以标准空白液为对照调零, 在4 0 0n m处测定吸光度值AB。吸取1.0m L平衡后待测酶液, 加入到5m L刻度试管中, 再加入1.0m L平衡后的对硝基酚-麦芽糖苷溶液, 混匀,4 0平衡1 0m i n, 然后加入1.0m L碳酸钠溶液, 室温放置5m i n, 以标准空白液为对照调零, 在4 0 0n m处测定吸光度值AE。A.3.2.5 酶活力计算葡糖苷酶的酶活力按式(A.3) 计算:XD= (AE-AB)K+C0Mt10 0 0(A.3) 式中:XD 待测酶液的淀粉葡糖苷酶活力, 单位为活力单位每毫升(U/m L) ;AE 酶反应液的吸光度;AB 酶空白液的吸光度;K 标准曲线的斜率;C0 标准曲线的截距;M 对硝基酚的摩尔质量,M(C6H5NO3)=1 3 6.1 1g/m o l;t 酶解反应的时间, 单位为分(m i n) ;10 0 0 换算系数。G B5 0 0 9.2 4 52 0 1 61 0 附 录 B色谱参考条件B.1 四电位离子色谱检测条件B.1.1 离子色谱条件分析柱:C a r b o P aP A 1( 粒径1 0m,2 5 0mm2mm) ; 保护柱:C a r b o P aP A 1( 粒径1 0m,5 0mm2mm) ,或等效柱。进样量:2 0L;柱温:3 0。注:给出分析柱信息是为了方便本标准的使用者, 并不表示对该产品的认可, 如果其他等效产品具有相同的效果,则可使用这些等效的产品。B.1.2 流动相注:配好的流动相需脱气, 并用惰性气体保护。A液: 含0.1 5m o l/L氢氧化钠;B液: 含0.1 5m o l/L氢氧化钠,0.5 0m o l/L乙酸钠;流速:0.5m L。B.1.3 梯度淋洗程序梯度淋洗程序见表B.1。表B.1 梯度淋洗程序时间/m i n流动相A/%流动相B/%0.07 03 01 0.001 0 01 5.001 0 02 5.07 03 0B.1.4 检测器采用四电位波形, 见表B.2。表B.2 检测器的波形设置时间/s电压/V积分0.0 00.1 00.2 00.1 0开始0.4 00.1 0结束0.4 1-2.0G B5 0 0 9.2 4 52 0 1 61 1 表B.2( 续)时间/s电压/V积分0.4 2-2.00.4 30.6 00.4 4-0.1 00.5 0-0.1 0B.1.5 四电位波形聚葡萄糖参考物质的色谱图四电位波形聚葡萄糖参考物质的色谱图见图B.1。图B.1 四电位波形聚葡萄糖参考物质的色谱图B.2.1 离子色谱条件分析柱:H a m i l t o nR C X - 3 0( 粒径7m,2 5 0mm4.6mm) ,M e t r o s e pC a r b 1G u a r d( 粒径5m,5 0mm4.0mm) 或等效柱;进样量:2 0L;柱温:3 2。注:给出分析柱信息是为了方便本标准的使用者, 并不表示对该产品的认可, 如果其他等效产品具有相同的效果,则可使用这些等效的产品。B.2.2 流动相注:配好的流动相需脱气, 并用惰性气体保护。A液: 含0.1 5m o l/L氢氧化钠;B液: 含0.1 5m o l/L氢氧化钠,0.5 0m o l/L乙酸钠;流速:0.5m L。B.2.3 梯度淋洗条件梯度淋洗条件见表B.3。G B5 0 0 9.2 4 52 0 1 61 2 表B.3 梯度淋洗条件时间/m i n流动相A/%流动相B/%0.07 03 01 0.001 0 01 4.001 0 02 0.07 03 0B.2.4 检测器采用三电位检测波形, 见表B.4。表B.4 检测器的波形设置时间/s电压/V积分0.0 0+0.0 50.2 0+0.0 5开始0.3 0+0.0 5结束0.3 5+0.5 50.5 5-0.1 0B.2.5 三电位波形聚葡萄糖参考物质的色谱图三电位波形聚葡萄糖参考物质的色谱图见图B.2。图B.2 三电位波形聚葡萄糖参考物质的色谱图