Western blot详解及问题分析.ppt

单击此处编辑母版标题样式,Western Blot,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,蛋白质免疫印迹技术及,常见问题分析,张绍进,Western Blot,简介,Western Blot,一般流程,Western Blot,常见问题分析,Western Blot,简介：,印迹法（,blotting,）是指将样品转移到固相载体上，而后利用相应的探测反应来检测样品的一种方法。,1975,年，,Southern,建立了将,DNA,转移到硝酸纤维素膜（,NC,膜）上，并利用,DNA,RNA,杂交检测特定的,DNA,片段的方法，称为,Southern,印迹法。,而后人们用类似的方法，对,RNA,和蛋白质进行印迹分析，对,RNA,的印迹分析称为,Northern,印迹法，对单向电泳后的蛋白质分子的印迹分析称为,Western,印迹法，对双向电泳后蛋白质分子的印迹分析称为,Eastern,印迹法。,Western Blot,基本原理,Western Blot,优点,高分辨率的电泳技术,特异敏感的抗原,-,抗体反应,1-5ng,中等大小的靶蛋白,Western Blot,应用,目的蛋白的表达特性分析,目的蛋白与其它蛋白的互作,目的蛋白的组织定位,目的蛋白的表达量分析,Western Blot,流程,蛋白样品的制备,SDS-PAGE,转膜,封闭,一抗杂交,二抗杂交,底物显色,通过有机溶剂或水溶法制备总蛋白,水溶液提取法,针对水、稀盐、稀酸或碱溶液中的蛋白质。稀盐和缓冲系统的水溶液对蛋白质稳定性好、溶解度大、是提取蛋白质最常用的溶剂。,有机溶剂提取法,对于分子中非极性侧链较多的蛋白质可用有机溶剂提取，包括乙醇、丙酮和丁醇等。,通过层析或电洗脱法制备目的蛋白,蛋白样品的提取,蛋白样品的定量,目前常用比色法测定样品蛋白的含量：,Bradford,法（考马斯亮蓝法）、,Lowry,法（,Folin,-,酚试剂法）、,BCA,法等。但各有优缺点，大家可以根据具体情况选取。按相应蛋白质定量试剂盒操作说明操作，测定样品浓度。,蛋白质浓度测定的各种方法汇总：,Tris-HCl(pH6.8),10 ml,1M DTT,20 ml,SDS,4 g,甘油,20 ml,溴酚蓝,0.2 g,总体积,100ml,100mM Tris-HCl(pH6.8),200mM DTT,4%SDS,0.2%,溴酚兰,20%,甘油,ddH,2,O,SDS,：,阴离子去污剂 变性剂,氨基酸侧链与,SDS,充分结合形成带负电荷的蛋白质,-SDS,胶束。,蛋白质,-SDS,胶束所带的负电荷大大超过了蛋白质分子原有的电荷量，消除了不 同分子之间原有的电荷差异。,与强还原剂一起使蛋白分子氢键、疏水键打开，使蛋白质分子线性化。,蛋白质,-SDS,胶束的特点：,（,1,）具有相同的形状，形状像一个长椭圆棒（,2,）平均,1g,蛋白质结合,1.4g SDS,（,3,）短轴对不同的蛋白质亚基,-SDS,胶束基本上是相同的,（,4,）长轴的长度则与亚基分子量的大小成正比,不连续的电泳缓冲体系。,SDS,蛋白质复合物在凝胶电泳时，不再受蛋白质电荷与形状的影响，而只取决于蛋白质分子量的大小。,SDS,聚丙烯酰胺凝胶电泳,SDS-PAGE,是在蛋白质样品中加入,SDS,和含有巯基乙醇的样品处理液，,SDS,是一种很强的,阴离子表面活性剂,，它可以,断开分子内和分子间的氢键,，破坏蛋白质分子的二级和三级结构。,强还原剂巯基乙醇（或二硫苏糖醇，,DTT,）,可以,断开二硫键破坏蛋白质的四级结构,。使蛋白质分子被解聚成肽链形成单链分子。解聚后的侧链与,SDS,充分结合形成带负电荷的蛋白质,-SDS,复合物。,蛋白质分子结合,SDS,阴离子后，所带负电荷的量远远超 过了它原有的净电荷，从而消除了不同种蛋白质之间所,带净电荷的差异。蛋白质的电泳迁移率主要决定于亚基 的相对分子质量，而与其所带电荷的性质无关。,【SDS-PAGE,基本原理,】,凝胶成分,丙烯酰胺和,N,N-,亚甲双丙烯酰胺,SDS,配胶的,Tris,缓冲液,TEMED,过硫酸铵,Tris,-,甘氨酸电泳缓冲液,PAGE,：聚丙烯酰胺凝胶,聚丙烯酰胺凝胶,(,polyacrylamide,gel),是由单体丙烯酰,胺,(,acrylamide,，简称,Acr,),和交联剂,(,crosslinker,),N,N,-,亚甲基双丙烯酰胺,(N,N,-,methylenebisacylamide,，,简称,Bis,),在催化剂和加速剂作用下聚合交联而成的三维网,状结构的凝胶。化学惰性强，具有一定的机械强度和透明,度。是良好的电泳介质。,聚丙烯酰胺凝胶的聚合方式：,单体：丙烯酰胺（,Acr,）；,交联剂：甲叉双丙烯酰胺（,Bis,）；,催化剂：过硫酸胺或核黄素（,AP,）；,加速剂：四甲基乙二胺（,TEMED,）；,产物：三维网状结构凝胶,聚丙烯酰胺凝胶聚合机理是通过提供氧游离基,(free radicals),的催化，使体系发生氧化还原作用,(catalyst-,redox,systems),来完成的。催化体系主要有化学催化（,AP,TEMED,）和光化学催化（核黄素,TMTED,）体系。,凝胶浓度与蛋白分离范围,凝胶浓度（）,线性分离范围（,KD),15,12-43,10,16-68,7.5,36-94,5.0,57-212,SDS-PAGE,浓缩胶,(5%,Acrylamide,),及分离胶配方表：,隔绝空气,ddH,2,O,0.1%SDS:8%,灌制积层胶 插入梳子,Staking gel,Separating gel,转膜,要将电泳后分离的蛋白质从凝胶中转移到固相载体（例如,NC,膜）上，通常有两种方法：,毛细管印迹法和电泳印迹法,。,常用的电泳转移方法有,湿转和半干转,。两者的原理完全相同，只是用于固定胶,/,膜叠层和施加电场的机械装置不同。,转移膜的选择,最常用于,Western Blot,的转移膜主要是硝酸纤维素（,Nitrocellulose,，,NC,）膜和聚偏二氟乙烯（,Polyvinylidene,Fluoride,PVDF,）膜，此外也有用尼龙膜、,DEAE,纤维素膜做蛋白印迹。尼龙膜和,NC,膜的特点相似,主要用于核酸杂交。,各种膜的详细特点介绍：,Blot,膜封闭液（生物试剂公司）,Tween-20,的作用：减少非特异性吸附，不影响抗体与抗原的结合。,一抗、二抗孵育,把,NC,膜放在密闭塑料袋或者培养皿中，根据膜面积以,0.1mL/cm,2,的量加入一抗溶液，摇床上平缓摇动，于室温孵育,1-2,小时或,4,过夜。,回收一抗溶液，用,TBST,漂洗膜,3,次，每次,10min,。,加入用封闭液配制的二抗，摇床上缓慢摇动，于室温孵育,1-2,小时或,4,过夜。,回收一抗溶液，用,TBST,漂洗膜,3,次，每次,10min,。,最后用,TBS,漂洗膜,2,次，每次,10min,。,二抗与底物反应显色,辣根过氧化物酶法（,HRP,）,碱性磷酸酶法（,AP,）,化学发光显色法,(,HRP,),膜解吸方法（膜的重复利用）,通过加热和去污剂进行解吸,原理：,组合使用去污剂和加热使抗体解离，适用于任何化学发光底物系统。,酸解吸,原理：,使用低,pH,改变抗体结构从而使结合位点失活，从而将抗体与抗原分离，适用于任何化学发光底物系统。,Western Blot,结果分析,目的蛋白的灰度值除以内参的灰度值以校正误差，所得结果代表某样品的目的蛋白相对含量。,Western Blot,结果分析软件,Gel-Pro Analyzer 4,绿色版（附动画演示教程）,Blot,常见问题分析,SDS-PAGE,电泳,胶不平？,凝胶漏液？,胶板洗刷干净,加入,AP,和,TEMED,的量要合适,加入试剂后摇匀，使其充分混合，防止部分胶块聚合不均匀,温度合适，受热不均匀导致胶聚合不均匀,两块玻璃板底部要对齐,条带比正常的窄？,“,微笑,”,或,“,倒微笑,”,条带？,凝胶聚合不均匀，灌胶时候尽量混合均匀，动作轻缓,拔梳子要迅速，清洗加样孔要小心，以免把上样带扭曲,样品盐浓度过高会挤压其他条带导致宽窄不一，纯化样品，调整盐浓度,胶板底部有气泡会影响电泳效果，应赶走气泡。同时注意电泳槽装置是否合适,SDS-PAGE,电泳,转膜及抗体检测,凝胶肿胀或卷曲？,条带歪斜或漂移？,单个或多个白点？,转膜缓冲液过热,？,可将凝胶在转膜之前放到转膜缓冲液中浸泡,5-10min,电转仪长期使用导致海绵变薄，“三明治”结构不紧凑导致。可在两块海绵之间垫上少许普通的草纸,确保膜和胶块之间没有气泡,缓冲液中离子浓度太低，电流或电压太高。转膜过程注意降温,转移到膜上的蛋白很少,蛋白分子量,10KD,蛋白的等电点,9,SDS,浓度不合适,凝胶太厚,原因,对,策,蛋白分子量,1,0KD,时，减少转膜时间；使用小孔径的膜,更换高,pH,值,Buffer,在阴极,buffer,中加入,0.005-0.01%SDS,可提高转膜效率,延长转膜时间,膜没有均匀浸湿,膜或者缓冲液污染,封闭不充分,抗体与封闭剂出现交叉反应,抗体浓度过高,原因,对,策,转膜前用,100%,甲醇将膜完全浸湿,拿取膜与吸水纸时要戴手套，更换新鲜转膜缓冲液,检测一抗、二抗与封闭剂是否有交叉反应,杂交前检测一抗、二抗的工作浓度,背景太高,杂交信号很弱,抗体保存不当,抗原不充足,膜的漂洗过度,原因,对,策,抗体长期保存应在,70,，使用前做效价检测,增加蛋白上样量，做已知标准量蛋白的对照,减少漂洗的时间和次数,一抗不是唯一特异的,二抗出现非特异结合,原因,对,策,制备单克隆抗体或者重新选取合成抗原多肽的位点,设立不加一抗，只加二抗的平行对照来检测二抗是否有非特异结合,出现非特异带,Further Readings,生物秀,Western Blotting,专题,Blotting,操作手册,blot,问题解答专帖,