还原糖-砷钼酸比色法.ppt

单击此处编辑母版标题样式,*,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,实验五,还原糖含量的测定,-,砷钼酸比色法,基础生物化学,一、糖,1.,糖的生理功能,(1),分布广泛的有机化合物,它是某些植物种子,、根、茎的重要组成部分，也是蔬菜、,水果等的重要组成部分。,(2),维持生命活动的主要能量来源。,(3),是许多植物和微生物细胞壁的重要组成部分。,2.,测定的意义,(1),在植物组织中，糖含量可高达,80%,左右，在动物和人组织中，含量较少，约为干重的,2%,。,(2),植物中糖的种类和含量分析，对于选种及控制培育条件有重要的意义。,(3),在微生物发酵中控制培养基中糖等物质的含量，对指导生产实践很重要。,(4),在医学方面根据血糖或尿糖含量的高低诊断某些疾病。,3.,测定的方法,(1),根据糖溶液的折射率、比重、旋光活性等物理性质，可用折射仪、波美比重计、旋光仪来测定糖含量。,(2),根据糖的化学性质可用滴定法、比色法定量测定，此外还有氧电极、酶电极等快速微量的定糖方法。,二、实验目的,1.,了解还原糖的生理意义及作用。,2.,掌握砷钼酸比色法测定还原糖的基本原理和操作方法。,三、实验原理,还原糖,：,指含有自由醛基或酮基的糖类，单糖都是还原糖，双糖和多糖不一定是还原糖，其中乳糖和麦芽糖是还原糖，蔗糖和淀粉是非还原糖。,利用糖的,溶解度,不同，可将植物样品中的单糖、双糖和多糖分别提取出来。,对没有还原性的双糖和多糖，可用,酸水解法,使其降解成有还原性的单糖进行测定，再分别求出样品中还原糖和总糖的含量（还原糖以葡萄糖含量计）。,1,、砷钼酸比色原理,（,1,）还原糖在碱性条件下加热，可以定量地还原二价铜离子为一价铜离子，即产生砖红色地氧化亚铜沉淀，其本身被氧化。具体反应如下：,（酒石酸钾钠）,砖红色,（,2,）氧化亚铜在酸性条件下，可将钼酸铵还原，还原型地钼酸铵再与砷酸氢二钠起作用，生成一种蓝色复合物即砷钼蓝，其颜色深浅在一定范围内与还原糖地含量,(,即被还原的,Cu,2,O),成正比，用标准葡萄糖与砷钼酸作用，比色后做标准，就可测得样品还原糖含量。,2,、测定还原糖其它方法,(1),蒽酮比色法：,强酸可使糖类脱水生成糠醛，糠醛与蒽酮脱水缩合，形成糠醛的衍生物，呈蓝绿色，其颜色的深浅与糖含量成正比关系，在,620nm,波长下可测定其光密度值。,(2)3,5-,二硝基水杨酸：,还原糖在碱性条件下加热被氧化成糖酸及其它产物，,3,5-,二硝基水杨酸则被还原为棕红色的,3-,氨基,-5-,硝基水杨酸。在一定范围内，还原糖的量与棕红色物质颜色的深浅成正比关系，利用分光光度计，在,540nm,波长下测定光密度值，查对标准曲线并计算，便可求出样品中还原糖和总糖的含量。,(3),费林试剂滴定法,费林试剂由甲乙两种溶液混合而成，甲液,(,硫酸铜,),与乙液,(,氢氧化钠,),生成天蓝色沉淀，在碱性溶液中，乙液,(,酒石酸钾钠,),使氢氧化铜溶解生成一种络合物，还原糖在碱性加热条件下，可以定量还原费林试剂中,Cu,2,+,为,Cu,1+,使费林试剂脱色，其脱色的程度与还原糖含量成正比关系。,四、实验材料、主要仪器和试剂,1,实验材料,：,苹果,2,仪器,（,1,）恒温水浴锅（,2,）,Spc22-,可见分光光度计,（,3,）容量瓶（,4,）漏斗（,5,）研钵,3,试剂,（,1,）铜试剂：,CuSO,4,、酒石酸钾钠、,Na,2,SO,4,、,Na,2,CO,3,、,Na,H,CO,3,（,2,）砷钼酸试剂：,（,NH4),6,Mo,7,O,24,4H,2,O,、,Na,2,HAso,4,7H,2,O,（,3,）,200g/mL,葡萄糖标准液,1,、制作标准曲线,:,取,7,支试管，按下表操作，然后以,标准葡萄糖浓度,为横坐标，,对应的吸光值,为纵坐标绘制标准曲线。,管,号,葡萄糖,标准液,mL,蒸馏水,mL,铜试剂,mL,沸水,浴,砷钼酸,mL,OD,620nm,葡萄糖浓度,（,g,/ml,）,0,(,参比,),0,2,2,10,min,冷却,2,mL,振荡,2min,定容到,20,mL,0,1,0.1,1.9,10,2,0.2,1.8,20,3,0.3,1.7,30,4,0.4,1.6,40,5,0.5,1.5,50,6,0.6,1.4,60,提取液,2ml,五、实验步骤,标准葡萄糖溶液浓度,(ug/ml),OD,值,0,样品,OD,C,0,2,、还原糖的提取,称取,0.25g,苹果于研钵中加约,30ml,蒸馏水由漏斗冲入,50ml,容量瓶，摇匀,80,水浴浸提,30min,冷却加,3mlZnSO,4,加,3ml0.3N,的,Ba(OH),2,振荡后静置上层出现清液后再加一滴,Ba(OH),2,至无白色沉淀定容至,50ml,。,3,、还原糖含量的测定,过滤提取液取滤液,0.5ml,于,50ml,容量瓶中定容取稀释液,2ml,于刻度试管中加铜试剂,2ml,煮沸,10min,加砷钼酸试剂,2ml,振荡,2min,定容到,20ml620nm,下比色测定记录结果查标准曲线。,五、结果与计算,在标准曲线上分别查出相应的还原糖毫克数，按下式计算出样品中还原糖百分含量。,还原糖,(%)=,W,10,6,100,稀释倍数,样液总体积,六、思考题,1,、何谓还原糖？,2.,简述四种常用的还原糖含量测定的原理。,（,1,）蒽酮比色法,（,2,）砷钼酸比色法,（,3,）费林试剂滴定法,（,4,）,3,5-,二硝基水杨酸比色法,