改良J-G法测定血清总胆红素和结合胆红素.pptx

,标题文本,正文级别 1,正文级别 2,正文级别 3,正文级别 4,正文级别 5,实验,七 改良,J-G,法测定血清总,胆红素,和,结合胆红素,一.,目的要求,掌握本法测定血清胆红素的基本原理。,熟悉,本法测定血清胆红素的基本操作步骤及参考值。,了解,临床测定血清胆红素的主要方法及意义,。,二实验原理,血清,中,结合胆红素,可直接与,重氮试剂,反应，生成,紫色,的,偶氮胆红素,；在同样条件下，未结合胆红素须有,加速剂,破坏胆红素氢键后才能与重氮试剂反应,。,咖啡因、苯甲酸钠作为加速剂，,醋酸钠缓冲液可维持反应,的,p,H,值同时兼有加速,作用,。,(,叠氮钠,破坏剩,余重氮试剂，终止结合胆红素测定管的偶氮反应,。,),最后加入碱,性酒石酸钠，在碱性条件下，,紫色,偶氮胆红素转变为,蓝色,偶氮胆红素,，使最大吸光度由,530nm,转移到,598nm,，此时，非胆红素的黄色色素及其他红色与棕色色素产生的吸光度可忽略不计，使测定的灵敏度和特异性增加。,最后形成的绿色是由蓝色的碱性偶氮胆红素和咖啡因对氨基苯磺酸之间形成的黄色色素混合而成,。,三器材及试剂,1,器材：,（,1,）,试管,（,2,）,刻度吸管,（,3,）,紫,外,-,可见,分光光度计,（,4,）恒温水浴箱,三器材及试剂,2,试剂,：,咖啡因,-,苯甲酸钠试剂,称取无水醋酸钠,14.0g,，苯甲酸钠,37.5g,，乙二胺四乙酸二钠（,EDTA-Na,2,）,0.5g,，溶于,500ml,蒸馏水中，再加咖啡因,25.0g,，搅拌至完全溶解（不可加热），用蒸馏水稀释至,1000ml,。混匀，过滤，置棕色瓶中，室温保存。,碱性酒石酸钠溶液,称取氢氧化钠,75.0g,，酒石酸钠（,Na,2,C,4,H,4,O,6,2H,2,O,）,263.0g,，用蒸馏水溶解并稀释至,1000ml,。混匀，置塑料瓶中，室温,保存,(,每排配,150mL,计算后给老师确认后方可配制,),。,5.0g/L,亚硝酸钠溶液,称取亚硝酸钠（,NaNO,2,）,0.5g,，用蒸馏水溶解并稀释至,100ml,，混匀，置棕色瓶中，,4,保存。若溶液呈淡黄色时，应丢弃重配。,5.0g/L,对氨基苯磺酸溶液,称取对氨基苯磺酸（,NH,2,C,6,H,4,SO,3,H,H,2,O,）,5.0g,，加蒸馏水,800ml,及浓盐酸,15ml,，待完全溶解后加蒸馏水稀释至,1000ml,，混,匀,(,每排配,100mL，,计算后给老师确认后方可配制,),。,重氮试剂,临用前取,5.0g/L,亚硝酸,钠,0.5ml,和,5.0g/L,对氨基苯磺酸,溶液,20ml,，混匀。,三器材及试剂,2,试剂,：,胆红素标准,稀释,血清,：收集无溶血、无黄疸、无脂浊之新鲜血清，过滤。取过滤,血清,0.2mL,，加入,4.8mL,新鲜,生理盐水，混匀。以生理盐水调零，比色杯光径,10mm,，稀释血清在,414nm,吸光度应小于,0.100,，,460nm,吸光度应小于,0.040,。,胆红素,标准液（,171,mol/L,或,10mg/dL,）,:,称取符合标准的胆红素（,MW,：,584.68,）,10mg,，加入二甲亚砜,1mL,，,玻棒搅匀，加入,0.05mol/,L Na,2,CO,3,溶液,2mL,，,使胆红素完全溶解。移入,100ml,容量瓶，用稀释血清洗涤数次并移入容量瓶中，缓慢加入,0.1mol/L HCl,溶液,2mL,（,边加边缓慢摇动，切勿产生气泡），最后用稀释血清稀释至,100mL,。,避光，,4,保存,，,3,天内有效，最好当天绘制标准曲线。,四,操作步骤,1,标准曲线的绘制：,按,下表,配制,5,种不同浓度的胆红素标准液,将以上各管充分混匀（不产生气泡,）。,试剂,(ml)/,管别,0,1,2,3,4,5,胆红素标准液,(171,mol/L),0.0,0.2,0.4 0.6 0.8 1.0,稀释血清,1.0,0.8,0.6 0.4 0.2 0.0,相当于胆红素,浓度,mol/L,mg/dl,34.2 68.4 103 137,171,2,4,6,8,10,四,操作步骤,1,标准曲线的绘制,：,不同浓,度的胆红素标准液,按下表,操作,试剂,(mL),不同浓度的胆红素标准液,0.2,咖啡因,-,苯甲酸钠试剂,1.6,重,氮试剂,0.4,混,匀，总胆红素管置室温,15,分钟，,按下表继续操作,：,碱性,酒石酸钠溶液,1.2,每一浓度平行做,二,管，取平均值。用空白管调零，于波长,600nm,，读取各管吸光度，然后与相应的胆红素浓度绘制标准曲线,四,操作步骤,2总胆红素,的测定：,取,3,支试管,（总胆红素,2,组平行，空白管,1,管）,，,标,明总胆红素管和空白管，然后按,下表,操作,试剂,(ml)/,管别,总,胆红素管,空白,管,血清,0.2,0.2,咖啡因,-,苯甲酸钠试剂,1.6,1.6,氨基,苯磺酸溶液,0.4,重,氮试剂,0.4,混,匀，总胆红素管置室温,1,5,分钟，,按下表继续操作,：,碱性,酒石酸钠溶液,1.2,1.2,充分,混匀后，用空白管调零，于波长,600nm,，,读取总胆红素管,的,吸,光度，在标准曲线上查出相应的胆红素浓度。,五,实验结果,A,总胆红素,=,？,血清总胆红素,=,？,六,注意,事项,参考,值,血清,总胆红素,5.119,mol/L(0.3,1.1mg/dl,),血清,结合胆红素,1.76.8,mol/L(0.1,0.4mg/dl,),在,10,37,范围内，本测定方法不受环境温度影响，呈色在,2,小时内稳定。,严重,溶血时，可导致测定结果偏低。,血脂,可影响测定结果，故应尽量取空腹血。,胆红素,对光敏感，胆红素标准液及血清样本均应避光。,七,相关知识与,临床意义,胆色素,代谢,胆色素,(bile pigment),是体内铁卟啉类化合物的主要分解代谢产物，包括胆绿素,(biliverdin),、胆红素,(bilirubin),、胆素原,(bilinogen),和胆素,(bilin),等。,胆红素,处于胆色素代谢的中心，是人体胆汁中的主要色素。,七,相关知识与,临床意义,胆红素,空间结构,示意图,胆红素,的特有结构赋予其亲脂疏水的性质,易自由透过细胞膜进入血液。,七,相关知识与,临床意义,1.,胆红素,主要源于血红素的降解,（,1,）胆红素主要源于衰老红细胞的,破坏,体内的铁卟啉化合物包括,血红蛋白、肌红蛋白、细胞色素、过氧化氢酶及过氧化物酶。,正常人每天可生成,250,350mg,胆红素，其中约,80%,以上来自衰老红细胞破坏所释放的血红蛋白的分解。,七,相关知识与,临床意义,1.,胆红素,主要源于血红素的降解,（,2,）血红素,加氧酶和胆绿素还原酶催化胆红素的生成,部位：,肝,、脾、骨髓等单核吞噬细胞微粒体与胞液中。,过程：,血红蛋白,血红素,珠蛋白,氨基酸,胆红素,七,相关知识与,临床意义,1.,胆红素,主要源于血红素的降解,（,2,）血红素,加氧酶和胆绿素还原酶催化胆红素的生成,胆红素的生成过程：,七,相关知识与,临床意义,2.,血液中的胆红素主要与白蛋白结合而运输,运输,形式：,胆红素,-,白蛋白复合体,意义：,一方面增加了胆红素的水溶性，提高了血浆对胆红素的运输能力；,另一方面限制了它自由通透各种细胞膜，避免了它对组织细胞造成的毒性，起到暂时性的解毒作用。,竞争结合剂：,如磺胺药、水杨酸、胆汁酸等。,七,相关知识与,临床意义,3.,胆红素在肝细胞中转变为结合胆红素并泌入胆小管,（,1,）,游离胆红素可渗透肝细胞膜而被摄取,胆红素,可以自由双向通透肝血窦肝细胞膜表面进入肝细胞,；,胆红素在胞浆与配体蛋白,(,蛋白或蛋白,),结合，胆红素,-Y,蛋白或胆红素,-Z,蛋白形式将胆红素携带至肝细胞滑面内质网。,七,相关知识与,临床意义,3,.,胆红素,在肝细胞中转变为结合胆红素并泌入,胆小管,（,2,）胆红素在内质网结合葡糖醛酸生成水溶性结合胆红素,部位,：,滑面内网质,反应：,结合反应,(,主要结合物为,UDP,葡糖醛酸,UDPGA),催化酶：,葡糖醛酸基转移酶,产物：,主要为双葡糖醛酸胆红素，另有少量单葡萄糖醛酸胆红素、硫酸胆红素，统称为结合胆红素。,意义：,胆红素与葡糖醛酸的结合是肝对有毒性胆红素一种根本性的生物转化解毒方式。,七,相关知识与,临床意义,3,.,胆红素,在肝细胞中转变为结合胆红素并泌入,胆小管,（,2,）胆红素在内质网结合葡糖醛酸生成水溶性结合胆红素,葡糖醛酸,胆红素的生成,:,胆红素,+,UDP-,葡糖醛酸,胆红素葡糖醛酸一酯,+,UDP,UDP-,葡糖醛酸基转移酶,胆红素葡糖醛酸一酯,+,UDP-,葡糖醛酸,UDP-,葡糖醛酸基转移酶,胆红素葡糖醛酸二酯,+,UDP,七,相关知识与,临床意义,3,.,胆红素,在肝细胞中转变为结合胆红素并泌入,胆小管,（,2,）胆红素在内质网结合葡糖醛酸生成水溶性结合胆红素,两种,胆红素理化性质的比较,理化性质,未结合胆红素,结合胆红素,同义名称,间接胆红素、游离胆红素,直接胆红素、肝胆红素,与葡糖醛酸结合,未结合,结合,水溶性,小,大,脂溶性,大,小,透过细胞膜的能力及毒性,大,小,能否透过肾小球随尿排出,不能,能,与重氮试剂反应,间接阳性,直接阳性,七,相关知识与,临床意义,4.,胆红素,在肠道内转化为胆素原和胆素,胆,素原生成过程：,结合胆红素,胆素原,肠 菌,葡糖醛酸,还原,胆素,氧化,游离胆红素,七,相关知识与,临床意义,4.,胆红素,在肠道内转化为胆素原和胆素,七,相关知识与,临床意义,5.,高胆红素血症及黄疸,（,1,）正常人胆红素的生成与排泄维持动态平衡,正常血清胆红素浓度：,3.4,17.1mol/L,（,0.2,1mg/dl),。,4/5,为游离胆红素，其余为结合胆红素。,高胆红素血症（,hyperbilirubinemia),：体内胆红素生成过多，或肝细胞对胆红素的摄取、转化及排泄能力下降等因素引起血浆胆红素含量的增多。,七,相关知识与,临床意义,5.,高胆红素血症及黄疸,（,2,）,黄疸依据病因有溶血性、肝细胞性和阻塞性之分,体内胆红素生成过多，或肝细胞对胆红素的摄取、转化及排泄能力下降等因素均可引起血浆胆红素含量增多，称为高胆红素血症,(hyperbilirubinemia),。,胆红素为橙黄色物质，过量的胆红素可扩散进入组织造成组织黄染，这一体征称为黄疸,(jaundice),。,七,相关知识与,临床意义,5.,高胆红素血症及黄疸,（,2,）,黄疸依据病因有溶血性、肝细胞性和阻塞性之分,当血浆胆红素浓度超过,34.2mol/L(2mg/dl),时，肉眼可见皮肤、粘膜及巩膜等组织黄染，临床上称为显性黄疸。,若,血浆胆红素升高不明显，在,1,2mg/dl,之间时，肉眼观察不到皮肤与巩膜等黄染现象，称为隐性黄疸,(jaundice occult),。,临床上常根据黄疸发病的原因不同，简单的将黄疸分为三,类,：,（,1,）,溶血性黄疸,(hemolytic jaundice),；（,2,）肝细胞性黄疸,(hepatocellular jaundice),；（,3,）阻塞性黄疸,(obstructive jaundice),七,相关知识与,临床意义,5.,高胆红素血症及黄疸,（,2,）,黄疸依据病因有溶血性、肝细胞性和阻塞性之分,溶血性黄疸,溶血性黄疸,(hemolytic jaundice),，又称为肝前性黄疸,(prehepatic jaundice),。,属于高未结合型胆红素血症。,此类黄疸是由于红细胞的大量破坏，在单核,-,吞噬细胞系统产生胆红素过多，超过了肝细胞摄取、转化和排泄胆红素的能力，造成血液中未结合胆红素浓度显著增高所致。,七,相关知识与,临床意义,5.,高胆红素血症及黄疸,（,2,）,黄疸依据病因有溶血性、肝细胞性和阻塞性之分,八,胆红素测定的其它方法,1.,胆红素氧化酶法,胆红素呈,黄色，在,450nm,附近有最大吸收峰。胆红素氧化酶,(BOD),催化胆红素氧化，随着胆红素被氧化，,A450nm,下降，下降程度与胆红素被氧化的量相关。在,pH8.0,条件下，未结合胆红素及结合胆红素均被氧化，因而检测,450nm,吸光度的下降值可反映总胆红素含量；加入,SDS,及胆酸钠等阴离子表面活性剂可促进其氧化。,八,胆红素测定的其它方法,2,.,钒酸盐氧化法,在,pH=3,左右,，有表面活性剂和间接反应胆红素抑制剂的条件下，样品中的直接胆红素被氧化剂钒酸钠氧化为胆绿素。胆红素的黄色特异性吸光度下降，通过测定钒酸盐氧化前后吸光度的变化，计算样品中直接胆红素的含量。,九思考题,1.,试,述改良,J-G,法测定血清胆红素的基本原理。,2.,试,述胆红素代谢的基本过程以及血清胆红素测定在黄疸鉴别诊断中的意义。,