植物DNA的提取.ppt

,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,单击此处编辑母版标题样式,*,植物DNA的提取,基本原理,DNA提取,DNA纯化,操作步骤,注意事项,核酸的分类及存在,脱氧核糖核酸,(DNA),、核糖核酸,(RNA),与蛋白质结合在一起以,核蛋白（,DNP,）的形式存在。,在制备核酸时通常,破坏细胞壁及细胞膜来使,核蛋白释放出来。,核酸的理化性质,DNA,为白色类似石棉样的,纤维状物，,RNA,的纯品呈,白色粉末或结晶,。核酸和核苷酸大都呈酸味。,DNA、RNA,和核苷酸都是,极性化合物,，一 般都,溶于水，不溶于乙醇、氯仿等有机溶 剂，它们的钠盐比游离酸易溶于水,。,在酸性溶液中，核酸易水解，中性或弱碱性溶液中较稳定。,由于生物材料的差异,，,不可能有一种普遍适用的提纯生物体DNA的方法,，,植物材料有坚固的细胞壁,，,核酸含量较少,，,含有较多的多糖物质和色素,、,核酸酶活性高等这些因素给植物DNA的分离纯化带来了困难,。,DNA,提取,SDS,法,SDS是一种已知的能够使蛋白质变性的去污剂,。,它用于确定蛋白分子量的聚丙烯酰胺凝胶电泳。它也可以用于核酸抽提操作中破坏细胞壁及裂解核酸,-,蛋白复合物。在较高温度下，破坏蛋白质与DNA的结合，使DNA释放出来。,SDS,是有效的阴离子去垢剂，细胞中,DNA,与蛋白质之间常借静电引力或配位键结合,SDS,能够破坏这种价键。,十二烷基硫酸钠,CTAB溶解细胞膜，并结合核酸，使核酸便于分离,。,Tris-HCl(pH8.0)提供一个缓冲环境，防止核酸被破坏,。,NaCl 提供一个高盐环境，使CTAB与核酸形成的复合物充分溶解，存在于液相中,。,EDTA,(乙二胺四乙酸),螯合Mg2+或Mn2+，抑制DNase活性,。,-巯基乙醇是抗氧化剂，有效地防止酚氧化成醌，避免褐变，PVP-K30（聚乙烯吡喏烷酮）可以降低酚化合物的离子化，使酚容易去除。,CTAB提取缓冲液中各试剂的作用：,注意,-巯基乙醇,有很高的毒性，吸入、摄入或经皮肤吸收后会中毒。,中毒表现有呕吐、震颤、头痛、昏迷，甚至死亡。对眼、皮肤有强烈刺激性。可引起角膜混浊。,DNA,纯化（去杂质）,蛋白质,常用苯酚：氯仿：异戊醇（,25,：,24,：,1,）或氯仿：异戊醇（,24,：,1,）抽提。,RNA,常选用,RNase,消化,酚类物质,提取液中加少量巯基乙醇。,多糖,提取液中加,PVP,。,聚乙烯吡咯烷酮,是一种非离子型高分子化合物,操作步骤,1,.,称取 200-300mg 叶片装入 1.5ml 离心管，置于液氮中，用研磨,棒,研磨至粉碎，然后向离心管中加入 1000l 经过 65预热、含有 2%PVP 的 CTAB提取液和10l-疏基乙醇,，,混匀；在 65下水浴 40min-1h 其间要经常颠倒混匀。,2.加入 200l 醋酸钾，混匀，冰浴 15min。10000rpm 离心 10min，取上清约900l。,3,、,加入等体积的 Tris 饱和酚-氯仿-异戊醇（25：24：1），在摇床上充分摇动15min；10000rpm 离心10min,，,取上清 700l。,4,、,加入 1/10 上清液体积的 Rnase，混匀；37水浴 40min-1h。,5,、,加入等体积的的氯仿-异戊醇（24：1），摇床上摇动 15min；10000rpm 离心10min，取上清约 500l。,6.加入 1/10 体积的醋酸钠，2 倍体积的无水乙醇，充分混匀，4冰箱中静置20min。,7.10000rpm 离心 10min，弃上清。,8.分别用 75%酒精和无水乙醇漂洗沉淀 2 次，倒掉酒精，将离心管管口朝下，自然晾干。,9.加入 100l 1TE 溶液溶解 DNA，也可以 50助溶，保存在 4备用。,注意事项,1),选取新鲜材料，研磨迅速彻底，研磨好的材料应与,CTAB,抽提液充分混匀；,2),若提取产物有颜色，可能是材料中含有较多的多酚类物质，添加巯基乙醇（,2,5,），尽可能选取幼嫩的材料；,3,）收集,CTAB,与核酸形成的复合物时不要离心过度，否则沉淀再溶解难；,4,）为了获得具有生物活性的天然核酸，在分离制备过程中必须采用温和的条件，避免过酸过碱、剧烈地搅拌，防止热变性，同时还要避免核酸降解酶类的降解。,谢谢,